楊丹婷 蘇嘉妮 李婉珊 鐘衛(wèi)燁 王 曦 韋 云 丁清龍 周 露*

（廣東省食品檢驗(yàn)所 廣東廣州 510435）

1 前言

伯克霍爾德菌，原稱為洋蔥假單胞菌，由美國植物病理學(xué)家Burkholder 于1949年首次發(fā)現(xiàn)。它是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭氏陰性細(xì)菌。隨著細(xì)菌分類技術(shù)的發(fā)展，伯克霍爾德菌屬包括洋蔥伯克霍爾德菌群（B.cepacia complex）、假鼻疽伯克霍爾德菌（B.pseudomallei）、唐菖蒲伯克霍爾德菌（B.gladioli）、鼻疽伯克霍爾德菌（B.mallei）、泰國伯克霍爾德菌（B.thailandensis）等 60 多個(gè)菌種，具有復(fù)雜多樣性，既有人畜共患病原菌，也有植物病原菌及環(huán)境分離株，臨床上以洋蔥伯克霍爾德菌較為常見[1,2]。洋蔥伯克霍爾德菌群是基因型不同但表型相近的一組非發(fā)酵復(fù)雜菌群。2001年，Coneyet 等利用rRNA-DNA 雜交全細(xì)胞電泳和細(xì)菌表型標(biāo)志物等方法將洋蔥伯克霍爾德菌群分為9種基因型[3,4]。

洋蔥伯克霍爾德菌群廣泛存在于自然界和醫(yī)院環(huán)境中，是一種常見的條件致病菌，常引起囊性纖維化疾病和慢性肉芽腫。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域洋蔥伯克霍爾德復(fù)合群感染已呈上升趨勢，可引起多種部位的感染，可引起爆發(fā)流行，對多種抗生素具有耐藥性，治療難度大[5,6]。

在2018年度廣東省食品檢驗(yàn)所的專項(xiàng)抽檢米面制品、淀粉及其制品專項(xiàng)中發(fā)現(xiàn)，廣東省米面制品、淀粉及其制品中存在伯克霍爾德菌屬污染的風(fēng)險(xiǎn)較高，特別是洋蔥伯克霍爾德菌群。目前，國內(nèi)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中，只有進(jìn)出口口腔清潔類產(chǎn)品和進(jìn)出口化妝品中有洋蔥伯克霍爾德菌的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，且鑒定的主要方法是生理生化實(shí)驗(yàn)[7,8]。2014年，高業(yè)成等建立了可以有效排除雜菌干擾檢測出食品樣品中的洋蔥伯克霍爾德菌的方法[9]。2016年，胡娟等用生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合PCR 方法鑒定飲水中洋蔥伯克霍爾德菌[10]。在食品行業(yè)沒有洋蔥伯克霍爾德菌群鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，探究準(zhǔn)確高效的洋蔥伯克霍爾德菌群鑒定方法，可為食品標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù)，提高食品安全保障。

目前，傳統(tǒng)生化方法和臨床上應(yīng)用的 VITEK 2 COMPACT 不能準(zhǔn)確區(qū)分洋蔥伯克霍爾德菌群基因型[11]。VITEK MS、分子生物學(xué)手段是近年發(fā)展起來并已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定的方法。本文對從廣東省米面制品、淀粉及其制品中分離的洋蔥伯克霍爾德菌群分別進(jìn)行VITEK 2 COMPACT、VITEK MS 質(zhì)譜鑒定和 16s rDNA 基因測序，其中，VITEK 2 COMPACT 只能鑒定是洋蔥伯克霍爾德菌群，不能進(jìn)一步細(xì)化； 16s rDNA 雖然可以鑒定出具體菌種，但由于序列相似性太高，鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確； VITEK MS 質(zhì)譜可直接鑒定到種水平，鑒定置信度99%，方便快捷。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

VITEK 2 Compact 自動微生物快速檢測分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃股份有限公司）； VITEK MS質(zhì)譜儀（法國生物梅里埃股份有限公司）； Nano 核酸蛋白分析儀（日本島津中國公司）； Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司）； T100 PCR 儀（美國伯樂公司）。

腦心浸出液肉湯（BHI）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）； VITEK 2 COMPACT GN 鑒定卡（法國梅里埃公司）； 哥倫比亞血瓊脂平板（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）； 基質(zhì)液CHCA（法國梅里埃公司）； 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）。

實(shí)驗(yàn)菌株：均來源于2018年廣東省米面制品、淀粉及其制品抽檢樣品。具體見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株信息

（續(xù)表1）

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

用BHI 將實(shí)驗(yàn)需用菌株進(jìn)行復(fù)蘇。

2.2.1 VITEK MS 質(zhì)譜儀鑒定

在48 孔靶板質(zhì)控孔涂校準(zhǔn)菌（在哥倫比亞血瓊脂平板上培養(yǎng)24 h 新鮮的單個(gè)大腸埃希氏菌ATCC-8739 菌落），涂勻后加 1 μL 基質(zhì)液 CHCA，每 16孔區(qū)域涂一個(gè)質(zhì)控孔； 在樣品孔涂勻待測菌，每涂一個(gè)孔加一次1 μL 基質(zhì)液CHCA，待基質(zhì)液干透后上機(jī)。

2.2.2 16s rDNA 基因測序

（1）DNA 提取。DNA 提取方法參照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）操作說明進(jìn)行。

（2）DNA 濃度測定。取 3.5 μL 提取的 DNA 于核酸蛋白分析儀上，以無菌水清洗、DNA 提取試劑 TE 作空白，測定 DNA 濃度。

（3）PCR。參照 PCR 試劑盒說明書。

擴(kuò)增體系：DNA 模板 2 μL，上游引物（27F）2 μL，下游引物（1492R）2μL，2×PCR DSmix 25 μL，用超純水補(bǔ)足至50 μL。

擴(kuò)增條件：94℃，3 min； 94℃，30 s； 60℃，30 s； 72℃，2 min，30 個(gè)循環(huán)； 72℃，10 min。

（4）電泳。取 5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 2%瓊脂糖凝膠電泳，以2 000 bp Marker 作為參照。電泳條件：120 V，40 min。電泳結(jié)束后，于凝膠成像裝置成像。

（5）測序。PCR 產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

3 結(jié)果與分析

3.1 VITEK 2 COMPACT生化鑒定結(jié)果與分析

在VITEK 2 COMPACT 生化鑒定實(shí)驗(yàn)中，15 株實(shí)驗(yàn)菌均鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌群，只能鑒定到菌群，不能鑒定到種，可信度范圍為88%～99%，可信度越接近99%，說明鑒定結(jié)果越好，詳見表2。15 株實(shí)驗(yàn)菌在 VITEK 2 COMPACT 的 47 個(gè)生化反應(yīng)中，有35 個(gè)生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致； 12 個(gè)生化反應(yīng)結(jié)果有區(qū)別，包括：L-脯氨酸芳氨酶、谷氨酰芳氨酶PNA、D-甘露醇、L-蘋果酸鹽同化、L-組氨酸同化、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、尿素酶、丙二酸鹽、L-乳酸鹽同化、β-丙氨酸芳氨酶 PNA、D-山梨醇、磷酸酶。其中，菌株編號為 4、5、7 的 3株菌報(bào)告的生化反應(yīng)結(jié)果完全一致，具體生化反應(yīng)詳見表3。其中，存在差異的生化結(jié)果見表4。

表2 15株實(shí)驗(yàn)菌VITEK 2 COMPACT結(jié)果及可信度

表3 VITKE 2 COMPACT生化結(jié)果

表4 15株實(shí)驗(yàn)菌存在差異的生化結(jié)果

3.2 VITEK MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果與分析

VITEK MS 質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果可以達(dá)到種的水平。在15株實(shí)驗(yàn)菌中，有13株鑒定為越南伯克霍爾德菌，2株鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌。可信限為99.8%～99.99%，具體見表5。以2號和3號實(shí)驗(yàn)菌為例，2種菌的峰值圖分別如圖1和圖2所示。

表5 VITEK MS鑒定結(jié)果

3.3 16s rDNA基因測序結(jié)果與分析

在16s rDNA 基因測序鑒定實(shí)驗(yàn)中，15 株實(shí)驗(yàn)菌DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，獲得與預(yù)期大小基本一致的1500 bp 左右的目標(biāo)片段，詳見圖3。將測序結(jié)果在NCBI 中經(jīng)過BLAST 分析比對，每個(gè)樣品鑒定結(jié)果均有2 個(gè)以上，同源性均在99%以上，結(jié)果包括中心伯克霍爾德菌、洋蔥伯克霍爾德菌、越南伯克霍爾德菌等，詳見表6。

3.4 3種鑒定方法比較分析

3.4.1 鑒定結(jié)果比較

比較3種鑒定方法的結(jié)果，詳見表7。VITEK 2 COMPACT 只能鑒定是洋蔥伯克霍爾德菌群，不能進(jìn)一步細(xì)化，可信度范圍為88%～99%； 16s rDNA基因測序可以鑒定到種水平，序列同源性均在99%以上； VITEK MS 質(zhì)譜可直接鑒定到種水平，可信限為99.8%～99.99%。

圖1 越南伯克霍爾德菌峰值圖（2號）

圖2 洋蔥伯克霍爾德菌峰值圖（3號）

圖3 15株實(shí)驗(yàn)菌16s rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

表6 16s rDNA基因測序結(jié)果

（續(xù)表6）

菌株編號為1 和3 的VITEK MS 結(jié)果均為洋蔥伯克霍爾德菌，而16s rDNA 基因測序結(jié)果均為中心伯克霍爾德菌或伯克霍爾德菌，其余13 株菌用2種鑒定方法結(jié)果一致，VITEK MS 結(jié)果均鑒定為越南伯克霍爾德菌，16s rDNA 基因測序結(jié)果都有可能為越南伯克霍爾德菌，但不同樣品用16s rDNA 基因測序方法鑒定的結(jié)果不完全一致。16s rDNA 基因測序結(jié)果不唯一的原因是，伯克霍爾德菌在16s 序列比較保守，雖然可以鑒定出具體菌種，但由于序列相似性太高，鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確。2017年，黃庭軒等用RecA 序列分析得出伯克霍爾德菌屬內(nèi)各種鑒定有效且接近全基因組分析的結(jié)果[12]。因此，要運(yùn)用分子生物學(xué)手段鑒定洋蔥伯克霍爾德菌群，可先用16s rDNA 基因測序進(jìn)行初篩，再進(jìn)一步做RecA 基因或全基因組測序以確定具體的種類。

表7 3種鑒定方法的結(jié)果

3.4.2 鑒定時(shí)長比較

從鑒定時(shí)長比較3種鑒定方法：鑒定時(shí)長從備好上機(jī)用的增菌液或平板后開始計(jì)算，VITEK 2 COMPACT 鑒定時(shí)長相對較長，VITEK MS 最短，詳見表8。

表8 3種方法的鑒定時(shí)長比較

4 結(jié)語

在3種鑒定方法中，VITEK 2 COMPACT 鑒定結(jié)果只能到洋蔥伯克霍爾德菌群，鑒定時(shí)長為7 h或以上； VITEK MS質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果能到種的水平，鑒定時(shí)長只需要15 min； 16s rDNA 基因測序法鑒定能到種的水平，但由于伯克霍爾德菌在16s序列比較保守，序列比對結(jié)果不唯一，不適合鑒定到種。綜上，用VITEK MS 方法鑒定洋蔥伯克霍爾德菌群最佳，該方法結(jié)果準(zhǔn)確，時(shí)效性高。