李倩，毛旭虎

陸軍軍醫(yī)大學藥學與檢驗醫(yī)學系臨床微生物與免疫學教研室， 重慶 400038

類鼻疽是由類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei，B.pseudomallei)(簡稱類鼻疽菌)感染引起的一種熱帶醫(yī)學疾病。該病在東南亞和澳洲北部流行分布，我國海南、廣東、香港、臺灣等地為主要疫源地。其臨床表現(xiàn)復雜多樣，嚴重感染時可快速發(fā)展為敗血癥，病死率高達40%，每年有超過 9萬人死于該病，且越來越多的證據(jù)，它是一種正在擴散的人獸共患傳染病[1-2]。近年來，隨著國際交流和合作日趨頻繁，我國面臨的類鼻疽危害日趨嚴峻，特別是“一帶一路”的建設、海南國際旅游島的開發(fā)以及南海海洋利益維護和主權(quán)安全保障已上升至國家戰(zhàn)略，迫切需要尋找針對該病的有效臨床診療和防控策略[3]，這有賴于了解類鼻疽菌的致病機制。然而當前對類鼻疽菌分子致病機制的認識尚不透徹，尤其是類鼻疽菌如何逃逸宿主免疫清除的。為有助于人們更好認識類鼻疽菌，本文就近年來類鼻疽菌感染免疫相關研究的主要成果做一概述。

1 類鼻疽菌的重要毒力因子

類鼻疽菌作為一種土壤腐生革蘭陰性短桿菌，是一種機會性、兼性胞內(nèi)寄生菌。雖然目前其具體致病機制尚未明確，但近年來研究顯示，該菌具有顯著的內(nèi)在毒力因子和廣泛的抗生素耐藥性，這一特性使其適應能力增強，能根據(jù)受感染組織產(chǎn)生各種臨床表現(xiàn)，并在受感染的宿主和環(huán)境中持續(xù)存在。因此，關于類鼻疽菌重要毒力因子的致病機制研究是目前人們關注的熱點[4]。

類鼻疽菌在感染過程中需將毒力蛋白注入宿主細胞內(nèi)，干擾細胞生理進程而逃避宿主免疫應答，為此細菌進化出多種復雜而精細的分泌系統(tǒng)以適應這種需求。類鼻疽菌的毒力主要體現(xiàn)在能入侵宿主天然免疫細胞，逃離吞噬體囊泡并在胞內(nèi)存活和增殖，最終導致細胞融合而造成細菌播散[5-6]。類鼻疽菌侵入宿主細胞后，通過表達一系列的毒力相關因子，完成逃離囊泡和誘導細胞融合過程。有研究認為，Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system， T3SS)和Ⅵ型分泌系統(tǒng)(type Ⅵ secretion system， T6SS)是類鼻疽菌胞內(nèi)生存過程中最關鍵的2個毒力相關因子[4-5]。

1.1 T3SS對類鼻疽菌逃離囊泡至關重要

T3SS是許多革蘭陰性菌的重要毒力因子，又稱 “注射器裝置”，即由多種蛋白分子復合體所構(gòu)成的跨膜蛋白輸出裝置，可將細菌胞內(nèi)的分泌蛋白直接注入宿主細胞內(nèi)，發(fā)揮調(diào)控宿主多種信號通路的作用，如誘導細胞骨架重排、干擾宿主免疫應答、抑制細胞凋亡和干擾囊泡運輸，最終改變宿主環(huán)境而有利于細菌生存和增殖。類鼻疽菌共有3套T3SS，分別是T3SS-1(BPSS1390-1408)、T3SS-2(BPSS1613-1629)和T3SS-3(BPSS1520-1554)，只有T3SS-3對細菌在真核宿主胞內(nèi)生存和毒力發(fā)揮起重要作用[7]。類鼻疽菌T3SS-3由35個開放讀碼框構(gòu)成，根據(jù)所編碼的蛋白功能可分為5類：裝置蛋白(apparatus proteins)、轉(zhuǎn)位蛋白(translocon proteins)、效應分子(effector proteins)、分子伴侶(chaperones)和調(diào)控蛋白(regulator proteins)。近年來研究顯示，缺失T3SS-3蛋白BopA[8]、BsaQ[9]、BopE[10]和BipD[11]的類鼻疽菌逃逸囊泡的能力減弱，但這些效應分子介導囊泡逃逸的分子機制仍不清楚。T3SS-3中是否還存在其他未被發(fā)現(xiàn)的效應分子而在逃逸過程中發(fā)揮作用仍需深入研究。

1.2 T6SS促進類鼻疽菌在細胞間的播散

特別指出的是，在感染后期類鼻疽菌能誘導感染細胞與周圍細胞相互融合，形成一種稱之為多核巨細胞(multi-nucleated giant cells，MNGC)典型的細胞病理改變[12]。其特征表現(xiàn)為由多個單核細胞融合，體積較大，細胞核多，數(shù)目可達10～50個，核的排列缺乏規(guī)律。類鼻疽菌誘導的MNGC可幫助細菌播散，使其在胞內(nèi)獲得更大的生存空間和更多的營養(yǎng)物質(zhì)，同時還能逃避胞外宿主的免疫清除及抗生素殺傷，最終導致宿主致病，因此MNGC與類鼻疽菌的致病性密切相關。類鼻疽菌T6SS共有6套，分別是：T6SS-1(BPSS1490-BPSS1514)、T6SS-2(BPSS0515-BPSS0533)、T6SS-3(BPSS2090-BPSS2109)、T6SS-4(BPSS0166-BPSS0185)、T6SS-5(BPSS0091-BPSS0117)和T6SS-6(BPSL3096-BPSL3111)[13]。目前研究發(fā)現(xiàn)T6SS-1和T6SS-5具有誘導細胞融合的功能，同時在動物感染模型中發(fā)揮重要的毒力作用。T6SS分泌方式可比作細菌的弓箭，由膜-底座復合體和外鞘組成弓，將由溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(haemolysin co-regulated protein, Hcp)組成的箭體和纈氨酸甘氨酸重復蛋白G(valine glycine repeat G, VgrG)組成的箭頭在幾毫秒內(nèi)射入宿主細胞。研究發(fā)現(xiàn)，類鼻疽菌缺失Hcp和VgrG后，喪失了誘導細胞融合的能力，胞內(nèi)生存受限，并在小鼠動物模型中毒力明顯減弱，但其具體的分子機制仍有待進一步的研究[14-15]。

2 類鼻疽菌的感染與免疫逃逸

病原菌與宿主的相互作用是決定其感染和發(fā)病的前提。類鼻疽菌作為一種胞內(nèi)感染病原，為實現(xiàn)在宿主細胞內(nèi)生存、達到感染和致病目的，有效逃逸宿主細胞免疫清除成為雙方斗爭的焦點(圖1)。同時，類鼻疽菌作為一種典型的胞內(nèi)模式菌，其具體致病機制的闡明將對其他胞內(nèi)菌的研究具有重要借鑒意義。

圖1 類鼻疽菌逃避宿主免疫的機制示意圖

2.1 增加對宿主細胞的黏附和入侵

類鼻疽菌有效入侵宿主細胞是建立感染的第1步，研究顯示，類鼻疽菌可以主動或被動的方式侵入多種吞噬細胞(如多形核細胞、巨噬細胞等)或非吞噬細胞(如HeLa細胞、A549細胞、中國倉鼠卵巢細胞等)，而在這一過程中類鼻疽菌的多種結(jié)構(gòu)或毒力因子參與調(diào)控[1,6]。 Essex-Lopresti等研究發(fā)現(xiàn)Ⅳ型菌毛結(jié)構(gòu)蛋白PilA在類鼻疽菌有效黏附上皮細胞中起作用[16]。除此之外，細菌的分泌系統(tǒng)也發(fā)揮重要調(diào)控功能。Balder等發(fā)現(xiàn)，在大腸埃希菌中重組表達類鼻疽菌黏附蛋白BoaA和BoaB能明顯增加大腸埃希菌對肺上皮A549細胞的黏附作用，而敲除BoaA或BoaB后類鼻疽菌對小鼠巨噬細胞J774A.1的黏附能力大大下降[17]；T3SS效應蛋白BopE通過對宿主細胞的Rho GTP酶進行鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)催化作用，誘導宿主細胞肌動蛋白重排，從而幫助細菌入侵[10]。

2.2 逃避宿主細胞天然免疫的清除作用

天然免疫作為人體抵御病原微生物侵襲的第1道防線，在抗感染中發(fā)揮至關重要的作用。自噬(autophgay)作為天然免疫中重要的組成部分，同時也作為機體自我保護的生理學行為，在抗病原微生物感染及其導致的炎癥中發(fā)揮關鍵作用。在非吞噬細胞模型中， Li等研究發(fā)現(xiàn)，類鼻疽菌感染肺上皮A549細胞后，通過表觀遺傳修飾誘導多個miRNA協(xié)同干擾宿主細胞自噬相關蛋白ATG10的表達，從而介導其逃避宿主的自噬清除[18-19]。唐夢靈的研究發(fā)現(xiàn)，類鼻疽菌通過劫持宿主脂質(zhì)代謝抑制脂噬，逃逸宿主免疫清除[20]。在天然免疫系統(tǒng)重要成員的巨噬細胞模型中，類鼻疽菌逃逸宿主胞內(nèi)免疫清除的具體機制得到了多方面的揭示。Toll樣受體(toll like receptors，TLR)作為巨噬細胞表面的經(jīng)典模式識別受體，能識別保守的病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)，并通過各種信號轉(zhuǎn)導分子介導炎癥免疫應答。而TLR(尤其是TLR4和TLR5)的遺傳多態(tài)性，與類鼻疽患者的疾病嚴重程度密切相關[21-22]。有研究顯示，類鼻疽菌可通過對自身脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)結(jié)構(gòu)進行4-氨基-4-脫氧阿拉伯糖(4-amino-4-deoxy-arabinose, Ara4N)修飾，抑制TLR信號通路的激活，從而干擾宿主細胞的免疫應答[23]。為防止細菌入侵，巨噬細胞通過吞噬作用攝取細菌，形成包裹細菌的吞噬囊泡，隨后吞噬囊泡逐漸成熟酸化，并轉(zhuǎn)運至溶酶體形成吞噬溶酶體，從而殺滅細菌。Hu等研究發(fā)現(xiàn)在類鼻疽菌感染小鼠巨噬細胞RAW264.7模型中，類鼻疽菌通過上調(diào)miR-30b/c的表達干擾宿主細胞的Rab32分子向吞噬囊泡的招募，抑制吞噬囊泡與溶酶體融合[24]。同樣，Cullinane等研究也發(fā)現(xiàn)，類鼻疽菌通過T3SS-3效應蛋白BopA抑制自噬相關蛋白LC3的招募，幫助其逃逸吞噬囊泡，從而干擾宿主細胞的清除能力，但具體調(diào)控機制尚未闡明[25]。另外，類鼻疽菌T3SS-3效應蛋白BsaZ、BsaQ、BsaU也參與了囊泡的逃逸[9,26]。類鼻疽菌利用多種手段逃避溶酶體的殺傷，但活化的宿主巨噬細胞可形成呼吸爆發(fā)，生成大量代謝性自由基，借助強氧化和細胞毒作用對類鼻疽菌進行清除[27]。還有研究發(fā)現(xiàn)，類鼻疽菌可抑制誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、O2-等抗菌活化物的毒性作用。Utaisincharoen等報道，類鼻疽菌誘導負向調(diào)節(jié)因子SOCS3(suppressor of cytokine signalling 3)和CIS(cytokine-inducible SH2-containing protein)的表達，抑制宿主細胞誘導型一氧化氮(induced nitric oxide，iNO)的產(chǎn)生，從而逃逸免疫殺傷作用[28-29]。而近年來T6SS-5在類鼻疽菌逃逸至胞質(zhì)后誘導MNGC形成中的作用機制逐漸得到了揭示[30]。研究發(fā)現(xiàn)，該菌依賴T6SS-5分泌的效應蛋白VgrG-5、BPSS1504，參與MNGC的形成，對感染后期細菌在宿主細胞間的播散起到重要調(diào)控作用[14,31]。

2.3 干擾宿主細胞獲得性免疫的激活

目前，宿主獲得性免疫在清除類鼻疽菌中的作用鮮見相關研究。據(jù)報道，在泰國類鼻疽患者中，人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)與疾病嚴重程度密切相關[32-33]。臨床病例研究顯示，CD4+和CD8+T細胞在類鼻疽患者急性感染期間出現(xiàn)強烈反應；若患者合并糖尿病，則會影響CD4+和CD8+T細胞的反應，而較低的反應與較高的病死率相關，提示T細胞免疫在抗類鼻疽菌感染中具有重要作用[34-36]。See等發(fā)現(xiàn)，類鼻疽菌可上調(diào)T細胞對程序性死亡受體-1(programmed death receptor-1，PD-1)的表達，從而逃避宿主的免疫清除[37]。

3 類鼻疽菌的疫苗研究

由于類鼻疽菌屬于胞內(nèi)感染病原菌，且該菌逃逸宿主免疫清除的機制還尚未闡明，因此疫苗研究仍處于探索階段[1,38]。直至目前，類鼻疽菌多種形式的疫苗(如全菌體滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、多糖結(jié)合疫苗等)以及疫苗佐劑已有研究報道，然而相關報道均停留在臨床前階段，且大多數(shù)疫苗候選抗原無法誘導完全的保護性免疫應答 (只能在短時間內(nèi)提高受試動物的生存率)，也無法徹底清除在體內(nèi)定植的類鼻疽菌[39-40]。因此，類鼻疽菌疫苗的研制還有待其致病機制研究的不斷深入和疫苗技術(shù)的不斷發(fā)展，期待將來能研發(fā)出預防類鼻疽菌感染的有效疫苗。

4 展望

本文闡述了近年來類鼻疽菌的重要毒力因子及其在免疫逃逸中作用機制的研究進展。在類鼻疽菌感染過程中，宿主免疫系統(tǒng)與類鼻疽菌的相互作用十分復雜，類鼻疽菌特殊的分泌系統(tǒng)及胞內(nèi)免疫逃逸機制在其致病過程中發(fā)揮至關重要作用，而目前對于該菌感染及其免疫逃逸機制的研究尚處于不明確階段。因此，闡明類鼻疽菌重要毒力因子的致病機制，將有助于理解類鼻疽菌在面對免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除中長期存活的機制，并將有望對類鼻疽的預防和治療措施的改善產(chǎn)生更大的推動作用，為開發(fā)出有效的疫苗和藥物提供理論指導，為解決類鼻疽這個棘手的臨床疾病帶來新的希望。