魏東梅,邵龍剛

(江蘇省第二中醫(yī)院急危重癥醫(yī)學(xué)科,江蘇 南京210019)

膿毒癥是不同病原體侵入循環(huán)系統(tǒng)后引起的全身免疫反應(yīng),與其相關(guān)的免疫反應(yīng)包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等多種細(xì)胞的激活[1]。在膿毒癥發(fā)生后,激活的免疫細(xì)胞處于高炎癥狀態(tài),不受控制的產(chǎn)生促炎因子、急性期蛋白和其他炎癥介質(zhì)[2]。感染部位的炎性反應(yīng)還包括白細(xì)胞的募集和增殖、補(bǔ)體系統(tǒng)的活躍以及內(nèi)皮黏附分子和趨化因子水平的增加等[1-2]。目前雖已建立了多種治療膿毒癥的方法,然而,患者的病死率并沒有顯著降低[1,3]。因此,開發(fā)新型藥物對(duì)于膿毒癥的治療具有重要意義。芒柄花黃素是一種從紅三葉和黃芪中提取的甲基化異黃酮,由于其來源廣泛,且使用安全,引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注[4]。最新的多項(xiàng)研究表明,芒柄花黃素具有強(qiáng)大的抗炎能力,已有報(bào)道其在神經(jīng)保護(hù)、血管保護(hù)和治療哮喘等方面具有良好的應(yīng)用前景[5-7]。然而,迄今為止,尚未有芒柄花黃素在膿毒癥中的作用報(bào)道。本研究通過腹腔注射脂多糖建立小鼠膿毒癥模型,探究芒柄花黃素對(duì)膿毒癥炎性反應(yīng)的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取8～10周齡、清潔級(jí)的C57BL/6雄性小鼠40只,體重22 g左右,由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)通過后實(shí)施。

1.2 試劑與儀器 芒柄花黃素購自Med Chem Express公司(純度>99.9%,貨號(hào)HY-N0183);脂多糖購自Sigma-Aldrich公司(貨號(hào)297-473-0);檢測炎癥因子C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)(貨號(hào)MCRP00)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)(貨號(hào)CSB-E07430)、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性(貨號(hào)CSB-E12108)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)(貨號(hào)DY401)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)(貨號(hào)SM6000B)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)(貨號(hào)SMTA00B)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購自Minneapolis公司;抗P-P38抗體(貨號(hào)ab182453)、抗P38抗體(貨號(hào)ab170099)、抗P-ERK抗體(貨號(hào)ab229912)、抗ERK1/2抗體(貨號(hào)ab176640)、抗P-JNK抗體(貨號(hào)ab176662)、抗JNK 抗體(貨號(hào)ab126424)、抗P65抗體(貨號(hào)ab32536)和抗β-actin抗體(貨號(hào)ab6276)購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(貨號(hào)9003-99-0)購自Macklin公司。顯微鏡(Olympus公司);酶標(biāo)儀(BEC公司);電泳儀及發(fā)光儀(天能公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膿毒癥小鼠模型建立和分組:利用隨機(jī)數(shù)法將小鼠隨機(jī)分為四組,即對(duì)照組、內(nèi)毒素組、低劑量組和高劑量組,每組10只。內(nèi)毒素組按5 mg/kg濃度腹腔注射脂多糖[8],對(duì)照組按5 mg/kg注射0.9%氯化鈉溶液,低劑量組在給予脂多糖小鼠中當(dāng)天按照10 mg/kg腹腔注射芒柄花黃素,高劑量組的芒柄花黃素濃度為20 mg/kg,連續(xù)注射7 d[9-10]。

1.3.2 白細(xì)胞計(jì)數(shù):利用3 ml無菌0.9%氯化鈉溶液灌洗小鼠腹腔,收集灌洗后的腹腔液(IPF)保持在冰上以進(jìn)行進(jìn)一步分析。將500 μl IPF固定在載玻片上5 min,并用Wright染色法染色,在顯微鏡下對(duì)不同種類白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)[11]。

1.3.3 炎癥因子檢測:取小鼠脾臟后獲取脾臟勻漿液。根據(jù)試劑盒說明書,對(duì)CRP、MCP-1、MPO活性、IL-1β、IL-6和TNF-α進(jìn)行檢測。利用聚氯乙烯作為固相載體,在試劑盒中加入適合濃度的抗體,調(diào)整包被緩沖液pH值,室溫孵育2 h后,即刻利用非特異性蛋白進(jìn)行封閉,完成清洗后加入顯色液,酶標(biāo)儀檢測[11]。

1.3.4 脾臟形態(tài)學(xué)分析:為確定膿毒癥及給藥后脾臟形態(tài)學(xué)變化,室溫下,將小鼠脾臟浸潤在10%福爾馬林中固定過夜,隨后將其包埋在石蠟中。用蘇木精和伊紅(HE)染料對(duì)厚度為4～5 μm的脾臟切片進(jìn)行染色,最后使用放大400倍的光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察[11]。

1.3.5 免疫印跡法檢測蛋白含量:利用蛋白裂解液對(duì)小鼠脾臟進(jìn)行勻漿,低溫離心后加入緩沖液,煮沸制作蛋白樣本;電泳及轉(zhuǎn)膜參數(shù):90 V維持30 min,120 V維持90 min,250 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h。進(jìn)行抗體孵育過夜,沖洗后孵育二抗[12]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩樣本間比較利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),三個(gè)樣本比較采用方差分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 芒柄花黃素對(duì)膿毒癥小鼠存活率的影響 見圖1。對(duì)照組小鼠在觀察期間全部存活;內(nèi)毒素組小鼠在2 d后開始死亡,7 d的病死率為100%;低濃度組小鼠的存活率為21%;高濃度組小鼠的存活率達(dá)到了37.5%。

圖1 芒柄花黃素對(duì)膿毒癥小鼠存活率的影響

2.2 芒柄花黃素對(duì)膿毒癥小鼠IPF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 見圖2。與對(duì)照組相比,內(nèi)毒素組白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均增加(均P<0.05);與內(nèi)毒素組相比,芒柄花黃素干預(yù)后上述白細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低(均P<0.05),且具有劑量依賴性(均P<0.05)。

A:IPF中白細(xì)胞總數(shù);B:IPF中巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù);C:IPF中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù);D:IPF中淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。與對(duì)照組相比,*P<0.05;與內(nèi)毒素組相比,#P<0.05;與低劑量組相比,&P<0.05

2.3 芒柄花黃素對(duì)膿毒癥小鼠脾臟中炎性介質(zhì)的影響 見圖3。與對(duì)照組相比,內(nèi)毒素組小鼠脾臟中的炎癥因子(CRP、MCP-1和MPO)和促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)含量均升高(均P<0.05);與內(nèi)毒素組相比,芒柄花黃素干預(yù)后上述炎癥因子和促炎因子均降低(均P<0.05),且具有劑量依賴性(均P<0.05)。

A:脾臟組織中CRP含量;B:脾臟組織中MCP-1含量;C:脾臟組織中MPO含量;D:脾臟組織中IL-1β含量;E:脾臟組織中IL-6含量;F:脾臟組織中TNF-α含量。與對(duì)照組相比,*P<0.05;與內(nèi)毒素組相比,#P<0.05;與低劑量組相比,&P<0.05

2.4 芒柄花黃素對(duì)膿毒癥小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響 見圖4。對(duì)照組脾組織的HE染色表現(xiàn)出正常的組織結(jié)構(gòu);內(nèi)毒素組切片中融合的白髓(黑色箭頭)明顯增多,還觀察到壞死細(xì)胞及紅髓處的凋亡小體,這意味著脾腫大和白髓周圍巨噬細(xì)胞的主動(dòng)免疫反應(yīng)強(qiáng);芒柄花黃素干預(yù)后上述脾臟的受損表現(xiàn)得到部分恢復(fù),且以劑量依賴的方式改善。

注:黑色箭頭指示融合的白髓

2.5 芒柄花黃素對(duì)膿毒癥小鼠脾臟組織中MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白的影響 見圖5。與對(duì)照組相比,內(nèi)毒素組P-P38、P-ERK、P-JNK和P65表達(dá)均增加(均P<0.05);與內(nèi)毒素組相比,芒柄花黃素干預(yù)后P-P38、P-ERK、P-JNK和P65表達(dá)減少(均P<0.05),且具有劑量依賴性(均P<0.05)。

A:免疫印跡實(shí)驗(yàn)條帶的灰度示意圖;B:P-P38含量統(tǒng)計(jì)圖;C:P-ERK含量統(tǒng)計(jì)圖;D:P-JNK含量統(tǒng)計(jì)圖;E:P65含量統(tǒng)計(jì)圖。與對(duì)照組相比,*P<0.05;與內(nèi)毒素組相比,#P<0.05;與低劑量組相比,&P<0.05

3 討 論

膿毒癥進(jìn)展迅速,病死率高,治療效果不盡如人意[1-3]。而芒柄花黃素來源廣泛,使用安全,在多種疾病中取得一定治療效果,相關(guān)研究成為熱點(diǎn)[4-7]。本研究發(fā)現(xiàn)芒柄花黃素能夠提高膿毒癥小鼠的存活率。而膿毒性的進(jìn)展與白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等細(xì)胞數(shù)量的增加密切相關(guān),這些細(xì)胞的過度活化是機(jī)體發(fā)生失控性炎性反應(yīng)的根本環(huán)節(jié)[1-3]。膿毒癥發(fā)生后,這些白細(xì)胞分泌并產(chǎn)生大量炎癥蛋白和促炎因子,CRP是一種急性期蛋白[13],MCP-1是一種啟動(dòng)細(xì)胞因子[14],而MPO活性反映了中性粒細(xì)胞在脾臟中的隔離[15],所有這些介質(zhì)都被廣泛用作炎癥標(biāo)志物;而IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子,不僅消耗大量抑炎因子,而且又能引起炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng),引發(fā)失控性炎癥[16]。因此,抑制炎癥細(xì)胞的過度活化,控制炎性反應(yīng),是膿毒癥治療的關(guān)鍵所在[13-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)芒柄花黃素不僅能夠降低膿毒癥小鼠IPF中的多種白細(xì)胞數(shù)量,還能顯著降低脾臟中相關(guān)炎癥因子(CRP、MCP-1和MPO)和促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)含量。本實(shí)驗(yàn)對(duì)脾臟形態(tài)學(xué)的分析也同樣支持芒柄花黃素的抗炎作用和對(duì)膿毒癥的治療作用。近來一些研究已證實(shí),芒柄花黃素能夠調(diào)節(jié)白細(xì)胞增殖和活性,以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而抑制炎性反應(yīng)。有學(xué)者報(bào)道,芒柄花黃素可通過減輕動(dòng)脈粥樣硬化中的血管炎癥發(fā)揮腦保護(hù)作用[6]。也有學(xué)者證實(shí),芒柄花黃素能夠抑制胃潰瘍大鼠的炎性反應(yīng)促進(jìn)胃黏膜血管再生[17]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn),芒柄花黃素抑制IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞炎癥并減緩大鼠骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[10]。不僅在慢性炎癥中發(fā)揮抗炎作用,芒柄花黃素在急性炎癥中也同樣發(fā)揮作用。Yi 等[17]報(bào)道,芒柄花黃素可減輕小鼠過敏性哮喘的氣道炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究相似,均證實(shí)了芒柄花黃素的抗炎作用,并擴(kuò)展了芒柄花黃素在不同疾病中的應(yīng)用。

為進(jìn)一步探究芒柄花黃素減輕膿毒癥炎性反應(yīng)的機(jī)制,課題組進(jìn)行了炎癥相關(guān)通路的檢測。已有文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道,在發(fā)生膿毒癥等炎性反應(yīng)過程中NF-κB和MAPK信號(hào)通路可被激活,通路中的關(guān)鍵分子,如P38、JNK、ERK1/2和P65等表達(dá)增加。Gao等[18]發(fā)現(xiàn),膿毒癥發(fā)生肝腎損傷時(shí)NF-κB和MAPK信號(hào)通路活化,加重組織器官損傷。還有研究發(fā)現(xiàn),在膿毒癥心肌損傷時(shí)巨噬細(xì)胞功能紊亂,導(dǎo)致P38、JNK、ERK1/2和P65等分子異常表達(dá)[19]。本研究也發(fā)現(xiàn),在小鼠膿毒癥發(fā)生后脾臟中的NF-κB和MAPK信號(hào)通路被激活,而芒柄花黃素干預(yù)后此異?；罨耐繁灰种?。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和先前研究一致,芒柄花黃素能夠通過對(duì)NF-κB和MAPK等炎癥關(guān)鍵通路的抑制發(fā)揮抗炎作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),芒柄花黃素通過抑制NF-κB和MAPK通路的激活來減弱破骨細(xì)胞的生成[20]。也有學(xué)者證實(shí),芒柄花黃素通過調(diào)節(jié)NF-κB通路抑制大鼠胃部炎癥并促進(jìn)潰瘍愈合[17]。

綜上所述,芒柄花黃素可能通過抑制MAPK/NF-κB通路活化減輕小鼠膿毒癥炎性反應(yīng)。本研究拓展了芒柄花黃素在不同疾病模型上的應(yīng)用,為開發(fā)新型治療膿毒癥藥物提供了更加深入的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。