王玉瑋,李丁新,趙 飛,齊寶明,高志強(qiáng)

(1.唐山市協(xié)和醫(yī)院口腔修復(fù)科,河北 唐山 063000;2.唐山市協(xié)和醫(yī)院兒童牙科,河北 唐山 063000)

牙周炎是導(dǎo)致患者牙齒松動(dòng)或缺失的重要原因,牙槽骨吸收是牙周炎的病理基礎(chǔ),因此預(yù)防牙槽骨吸收,促進(jìn)牙槽骨的修復(fù)與重建,可有效改善牙周炎[1-2]。熊果酸(Ursolic acid,UA)是從山楂、熊果等植物中提取的五環(huán)三萜類化合物,具有抗炎、抗氧化等作用。研究[3-4]顯示,UA還具有促進(jìn)骨合成、抑制骨吸收的作用,對(duì)骨質(zhì)疏松患者的骨重塑過程發(fā)揮重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的酶,AMPK可激活下游沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent information regulator 1,SIRT1),而SIRT1是一種組蛋白脫乙?；?。研究[5]顯示,SIRT1具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞分化的作用。AMPK/SIRT1通路的激活,可誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)和成骨分化[6]。UA對(duì)牙周炎大鼠牙槽骨吸收的研究尚未見報(bào)道,本研究以此為出發(fā)點(diǎn),旨在探索UA對(duì)牙周炎大鼠牙槽骨吸收及AMPK/SIRT1通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 6～8周齡雄性SD大鼠(SPF級(jí)),體重230～270 g,購自山東艾來克生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(魯)2019-0017,大鼠在24～25 ℃溫度、60%～64%濕度、12 h∶12 h光暗的環(huán)境下飼養(yǎng)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)L2022-2-03)。UA(批號(hào)S31135,純度≥99%,原料藥)、AMPK抑制劑(Compound C)(批號(hào)P5499)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑(批號(hào)387AJ)均購自上海源葉生物科技有限公司;HE試劑盒(批號(hào)C0105S)、兔抗鼠核因子κB受體活化因子配體(RANKL)(批號(hào)AF7872)、SIRT1(批號(hào)AF5300)、磷酸化AMPK(p-AMPK)(批號(hào)AF5908)、AMPK(批號(hào)AF6195)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)(批號(hào)AF7924)均購自常州市比迪文生物科技有限公司;兔抗鼠核因子κB p65(NF-κB p65)(批號(hào)ab16502)、乙酰化NF-κB p65(Ac-NF-κB p65)(批號(hào)ab19870)、骨保護(hù)素(OPG)(批號(hào)ab73400)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(批號(hào)ab6671)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)(批號(hào)ab254360)抗體均購自美國Abcam公司;免疫組化檢測(cè)試劑盒(批號(hào)SP1641)、羊抗兔二抗(批號(hào)SP5627)均購自蘇州螞蟻淘生物科技有限公司;小動(dòng)物活體斷層掃描儀(型號(hào)Viva CT40)、顯微鏡(型號(hào)M110T)、凝膠成像分析儀(型號(hào)Tanon 3900)均購自深圳市伯建生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)造模及分組給藥 根據(jù)文獻(xiàn)[7]制備牙周炎大鼠模型,4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后,在大鼠雙側(cè)上頜第二顆磨牙牙頸部使用0.2 mm的正畸結(jié)扎絲進(jìn)行結(jié)扎,同時(shí)在頰側(cè)牙齦齦溝內(nèi)注射30 μl的脂多糖,每隔2 d注射一次,共注射3次,當(dāng)出現(xiàn)牙齒松動(dòng)、牙齦紅腫、出血、糜爛等現(xiàn)象則表明造模成功。30只大鼠造模成功,隨機(jī)分為模型組、UA組(150 mg/kg)、UA+AMPK抑制劑組(150 mg/kg+0.2 mg/kg),每組10只。另取10只健康大鼠(不進(jìn)行任何處理)作為對(duì)照組。UA組大鼠使用150 mg/kg的UA灌胃給藥(用0.9%氯化鈉溶液配制成濃度為15 mg/ml的混懸液,以10 ml/kg的體積灌胃)[8];UA+AMPK抑制劑組大鼠使用150 mg/kg的UA灌胃給藥,同時(shí)腹腔注射0.2 mg/kg的Compound C[9];對(duì)照組和模型組大鼠灌胃10 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液;每天給藥1次,連續(xù)給藥2周。

1.3 微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(Micro-CT)觀察大鼠牙槽骨吸收 末次給藥24 h后,處死大鼠,分離上頜骨及相應(yīng)牙周組織,剪取500 μg組織于-80 ℃保存,其余使用4%多聚甲醛固定并切片。取4%多聚甲醛固定的牙周組織標(biāo)本,采用小動(dòng)物活體斷層掃描儀進(jìn)行三維掃描,分別檢測(cè)骨小梁厚度(Tb.Th)、釉牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂?shù)木嚯x(CEJ-ABC)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.4 HE染色觀察牙周組織病理改變 將石蠟包埋的牙周組織切成厚度4 μm的切片,使用HE染色試劑盒進(jìn)行染色,鏡下觀察牙周組織病理學(xué)變化。

1.5 TRAP染色及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù) 牙周組織石蠟切片脫蠟水化后,使用TRAP染色試劑盒進(jìn)行染色,顯微鏡觀察破骨細(xì)胞數(shù),隨機(jī)觀察5個(gè)視野,計(jì)算平均每個(gè)視野破骨細(xì)胞數(shù)。

1.6 免疫組化法檢測(cè)牙周組織RANKL、OPG蛋白表達(dá) 取牙周組織的石蠟切片,經(jīng)脫蠟水化抗原修復(fù)后,分別加入兔抗鼠RANKL、OPG一抗(1∶1000稀釋),4 ℃孵育過夜,再加入羊抗兔二抗孵育1 h,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,RANKL主要表達(dá)于細(xì)胞膜與胞漿,OPG主要表達(dá)于胞漿,陽性呈棕黃色或棕褐色,顯微鏡觀察RANKL、OPG蛋白陽性表達(dá)并拍照,隨機(jī)選擇3個(gè)區(qū)域,采用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件分析RANKL、OPG蛋白的光密度值。

1.7 蛋白印跡法檢測(cè)牙周組織AMPK、p-AMPK、SIRT1、Ac-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá) 取各組大鼠牙周組織,進(jìn)行研磨,RIPA裂解液進(jìn)行總蛋白的提取,經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)膜并封閉,分別加入兔抗鼠AMPK(1∶300)、p-AMPK(1∶300)、SIRT1(1∶200)、Ac-NF-κB p65(1∶500)、NF-κB p65(1∶500)、TNF-α(1∶700)、IL-1β(1∶700)、β-actin(1∶700)一抗,4 ℃孵育過夜,再加入羊抗兔二抗(1∶1200),室溫孵育2 h,顯色,β-actin為內(nèi)參,分析蛋白相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 UA對(duì)牙周炎大鼠牙槽骨吸收的影響 與對(duì)照組比較,模型組大鼠牙槽骨CEJ-ABC、Tb.Sp顯著升高,Tb.N、Tb.Th顯著降低(均P<0.05);與模型組比較,UA組大鼠牙槽骨CEJ-ABC、Tb.Sp顯著降低,Tb.N、Tb.Th顯著升高(均P<0.05);與UA組比較,UA+AMPK抑制劑組大鼠牙槽骨CEJ-ABC、Tb.Sp顯著升高,Tb.N、Tb.Th顯著降低(均P<0.05)。見圖1(表1)。

圖1 各組大鼠牙槽骨Micro-CT圖

表1 四組大鼠牙槽骨CEJ-ABC、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp比較

2.2 UA對(duì)牙周炎大鼠牙周組織病理變化的影響 HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠牙槽骨表面光滑完整,未見明顯吸收,牙周膜區(qū)域?qū)挾染鶆?未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤牙周組織;模型組大鼠牙槽骨表面不平整,牙槽骨高度明顯降低,有較多骨吸收陷窩,牙周膜纖維排列紊亂,有大量炎癥細(xì)胞浸潤;UA組大鼠較模型組大鼠病理改變減輕,牙槽骨吸收減少,牙周纖維排列較整齊,炎癥細(xì)胞浸潤程度減輕;UA+AMPK抑制劑組較UA組大鼠病理改變加重,牙槽骨表面不平整,骨吸收增加,炎癥細(xì)胞浸潤增加。見圖2。

注:箭頭所示為骨吸收陷窩

2.3 UA對(duì)牙周炎大鼠牙周組織破骨細(xì)胞的影響 與對(duì)照組比較,模型組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05);與模型組比較,UA組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05);與UA組比較,UA+AMPK抑制劑組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 四組牙周炎大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)比較(個(gè))

2.4 UA對(duì)牙周炎大鼠牙周組織RANKL和OPG蛋白表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示,RANKL和OPG陽性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色顆粒。與對(duì)照組比較,模型組大鼠牙周組織RANKL蛋白表達(dá)顯著升高,OPG蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05);與模型組比較,UA組大鼠牙周組織RANKL蛋白表達(dá)顯著降低,OPG蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05);與UA組比較,UA+AMPK抑制劑組大鼠牙周組織RANKL蛋白表達(dá)顯著升高,OPG蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。見表3。

表3 四組牙周炎大鼠牙周組織RANKL、OPG蛋白表達(dá)比較

2.5 UA對(duì)牙周炎大鼠牙周組織AMPK、p-AMPK、SIRT1、Ac-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,模型組大鼠牙周組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)水平顯著降低,Ac-NF-κB p65/NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05);與模型組比較,UA組大鼠牙周組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)水平顯著升高,Ac-NF-κB p65/NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05);與UA組比較,UA+AMPK抑制劑組大鼠牙周組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)水平顯著降低,Ac-NF-κB p65/NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。見表4。

表4 四組牙周炎大鼠牙周組織p-AMPK/AMPK、SIRT1、Ac-NF-κB p65/NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)比較

3 討 論

牙周炎是臨床常見疾病,其發(fā)病率可達(dá)70%,可造成牙周組織損害,是成人喪失牙齒的原因之一[10-11]。本研究采用結(jié)扎聯(lián)合注射脂多糖的方法建立大鼠牙周炎模型,結(jié)果顯示,大鼠牙槽骨表面不平整,牙槽骨高度明顯降低,有較多骨吸收陷窩,牙周膜纖維排列紊亂并伴有炎癥細(xì)胞浸潤,牙槽骨CEJ-ABC、Tb.Sp、牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)顯著升高,Tb.N、Tb.Th顯著降低,與以往報(bào)道[2]結(jié)果類似,說明結(jié)扎聯(lián)合注射脂多糖的方法確實(shí)能夠誘導(dǎo)大鼠牙周炎癥的發(fā)生,使牙槽骨遭到破壞,提示建模成功。

UA為一種中藥提取物,具有抗炎、抗菌、抗氧化等多種功效,在炎癥性疾病、腫瘤等疾病中發(fā)揮重要作用[12]。報(bào)道顯示,UA還具有促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收的作用,通過作用多種靶基因、多條信號(hào)途徑治療骨質(zhì)疏松[13]。李夢(mèng)紅等[14]研究表明,UA具有促進(jìn)小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的作用。另有研究顯示,在正畸牙移動(dòng)模型大鼠中,UA可減少大鼠正畸牙移動(dòng)的距離,減緩正畸所致牙根吸收[15]。與上述研究相似的是,本研究發(fā)現(xiàn),UA可顯著改善牙周炎模型大鼠病理學(xué)改變,且牙槽骨CEJ-ABC、Tb.Sp、牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)顯著降低,Tb.N、Tb.Th顯著升高,表明UA可減輕牙周炎引起的牙周病理損傷,緩解牙槽骨吸收,提示UA對(duì)牙周炎的改善作用可能與促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收有關(guān)。

骨骼重塑過程涉及成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡,多種因子參與誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化與成熟[16]。RANKL又稱為骨保護(hù)素配體,可促進(jìn)破骨細(xì)胞的活化增殖;OPG可抑制破骨細(xì)胞分化,減少骨吸收[17-18]。既往研究[19]顯示,牙周炎大鼠牙周組織中OPG下調(diào),RANKL上調(diào),牙槽骨吸收能力增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)牙周炎大鼠的牙周組織中RANKL蛋白表達(dá)較健康大鼠顯著升高,OPG蛋白表達(dá)較健康大鼠顯著降低,說明牙周炎大鼠具有較強(qiáng)的牙槽骨吸收能力。接著,本研究給予牙周炎模型大鼠UA治療后,結(jié)果顯示,與模型組比較,UA組大鼠牙周組織OPG蛋白表達(dá)顯著升高,RANKL蛋白表達(dá)顯著降低,提示UA可上調(diào)OPG蛋白表達(dá),抑制RANKL蛋白表達(dá),減少牙槽骨吸收。

AMPK是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的蛋白,AMPK激活可上調(diào)SIRT1表達(dá),AMPK/SIRT1信號(hào)通路可參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化、炎性反應(yīng)等,還可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡而影響骨骼肌質(zhì)量[20]。研究[21]顯示,激活A(yù)MPK/SIRT1信號(hào)通路可提供骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抗氧化功能,及促進(jìn)成骨分化。TNF-α、IL-1β為主要炎癥因子,SIRT1可通過抑制NF-κB乙?；郊稗D(zhuǎn)錄而抑制炎癥因子的釋放[22]。Tamaki等[23]研究發(fā)現(xiàn),在牙周炎大鼠的牙周組織中,AMPK及SIRT1處于抑制狀態(tài),AMPK的激活有助于緩解牙槽骨吸收。本研究給予牙周炎模型大鼠UA治療后,結(jié)果顯示,與模型組比較,UA組大鼠牙周組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)水平顯著升高,Ac-NF-κB p65/NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著降低,提示UA可能激活A(yù)MPK/SIRT1信號(hào)通路。而使用AMPK抑制劑Compound C后,與UA組比較,UA+AMPK抑制劑組大鼠牙周組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)水平顯著降低,Ac-NF-κB p65/NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著升高,同時(shí),大鼠牙槽骨CEJ-ABC、Tb.Sp及牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)、RANKL蛋白表達(dá)顯著升高,牙槽骨Tb.N、Tb.Th及牙周組織OPG蛋白表達(dá)顯著降低,牙周組織病理改變加重,進(jìn)一步表明UA可通過激活A(yù)MPK/SIRT1信號(hào)通路,調(diào)控RANKL、OPG蛋白表達(dá),進(jìn)而抑制牙槽骨吸收和炎性反應(yīng),促進(jìn)牙槽骨的修復(fù)與重建。

綜上所述,UA可通過激活A(yù)MPK/SIRT1信號(hào)通路,抑制炎癥因子釋放和牙周炎大鼠牙槽骨吸收,促進(jìn)牙槽骨的修復(fù)與重建。另外,本研究未進(jìn)行氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè),不能確定UA對(duì)牙槽骨吸收的抑制作用是否與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān),這是本研究的不足之處,后續(xù)將針對(duì)此不足開展相關(guān)實(shí)驗(yàn),以完善UA減輕牙周炎大鼠牙槽骨吸收的機(jī)制研究。