馬戈甲 ,裴蛟淼,李 楊,韓 巖

(1.西安市中心醫(yī)院燒傷整形美容外科,陜西 西安 710004;2.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院西京整形醫(yī)院,陜西 西安 710032;3.解放軍總醫(yī)院整復外科,北京 100853)

近年來,隨著社會發(fā)展,各種意外傷害造成大量患者因外傷導致了各種皮膚軟組織的缺損[1],部分缺損已經(jīng)不能用傳統(tǒng)的整形外科手段進行治療,因此整形外科醫(yī)生加強了在異體復合組織移植技術領域的研究探索,并先后在臨床上進行了手、顏面、喉、舌、耳、腹壁等異體復合組織移植[2]。上述異體復合組織移植手術后,雖然大部分異體復合組織移植的患者發(fā)生了急性排斥反應,但多數(shù)是可逆性的,采用新型免疫抑制藥物,一部分可以抑制免疫排斥反應,維持移植組織的成活。大劑量應用免疫抑制藥物,雖然能夠抑制排斥反應,但會產(chǎn)生很多不良反應,如肝腎等臟器功能損害、 糖尿病等,如果長期使用,甚至可能面臨腫瘤和致死性感染的危險。因此,尋找一個有效的方法,減少術后早期全身性免疫抑制劑的用量成了一個關鍵的問題。因為,淋巴結主要是特異性細胞免疫的必需場所。異體器官或組織移植后,供體抗原經(jīng)供體或受體的抗原提呈細胞攝取后,進入淋巴結激活初始T細胞,增殖為效應T細胞,經(jīng)過血液循環(huán)進入移植物破壞供體組織。所以本課題將目光放在了移植物局部的引流淋巴結上,希望從此突破,尋找一個更加有效并且不良反應低的免疫抑制方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 8～10周雄性Lewis大鼠和Brown Norway(BN)大鼠,均購買自空軍軍醫(yī)大學動物實驗中心,在清潔室內(nèi)飼養(yǎng),給予正常飼料和水。Lewis大鼠為受體,BN大鼠為供體。

1.2 分組與移植方法 實驗采取下腹部游離皮瓣移植。大鼠進行腹腔注射麻醉(1%戊巴比妥溶液)下腹部取3 cm×3 cm大小皮瓣,從BN大鼠移植到Lewis大鼠。首先確定移植區(qū)域局部表淺引流淋巴結位置,確保受體在移植時淋巴結不會遭到破壞,供體皮瓣不包含供體引流淋巴結。將大鼠隨機分為三組:A組(n=8),正常移植; B組(n=8),術中去除移植區(qū)域引流淋巴結;C組(n=8),將皮瓣卷成皮管,利用硅膠管隔離移植物和受體之間的皮膚接觸,僅保留血管相通。

1.3 觀察項目

1.3.1 大體觀察:通過皮瓣外觀觀察移植物的變化,通過移植后水腫期、紫癜期及排斥期大體區(qū)分皮瓣移植后的免疫排斥變化。觀察移植皮瓣的色澤、血運及溫度,記錄皮瓣存活時間。根據(jù)臨床皮膚排斥反應分級標準,將大體表現(xiàn)分為Grade Ⅰ-Ⅳ 4級,分別為Ⅰ級紅斑;Ⅱ級進行性的紅斑、水腫;Ⅲ級表皮組織糜爛壞死;Ⅳ級干性壞疽。Grade Ⅲ級作為發(fā)生急性排斥反應的標志。

1.3.2 HE染色組織學觀察:術后3、7 d取材,通過HE染色確定皮瓣免疫排斥的變化。排斥反應分級根據(jù) Banff 2007 標準進行[3]:0級為沒有或者僅少量炎性細胞浸潤;Ⅰ級為輕度淋巴細胞浸潤,未涉及表皮組織;Ⅱ級為血管周圍中度或重度淋巴細胞浸潤,無表皮組織角質(zhì)層斷裂或消失,伴有或者不伴輕度表皮及其附屬器的受累;Ⅲ級為淋巴細胞廣泛密集的浸潤皮膚全層,上皮細胞凋亡,角質(zhì)層斷裂,角蛋白溶解;Ⅳ級為表皮組織及其他皮膚結構壞死空泡形成,發(fā)生急性排斥反應。本實驗將Ⅲ級作為排斥終點。

1.3.3 尾靜脈血清白介素-2(IL-2)表達水平檢測:術前和術后3、7、10 d及排斥終點,采集鼠尾靜脈血0.5 ml進行IL-2 ELISA 檢測(大鼠 IL-2 ELISA 試劑,Model680 型酶標儀),按照說明書進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。生存評價采用Log-Rank (Mantel-Cox)檢驗;多組比較使用One-way ANOVA方差分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 移植后皮瓣存活情況 術后各組動物狀態(tài)良好,未有啃咬皮瓣的情況發(fā)生。A組皮瓣第3天開始出現(xiàn)水腫,并且有小面積的出血點,其他各組沒有異常情況發(fā)生。第7天A組皮瓣基本全部被排斥(圖1A),平均存活天數(shù)為(6.38±0.52)d,其余各組逐漸出現(xiàn)水腫的情況,但是并沒有出血點出現(xiàn)。B組在第6、7天出現(xiàn)水腫,并且出現(xiàn)出血點(圖1B),平均存活時間為(10.00±0.76)d;C組第7天,皮管僅出現(xiàn)輕度水腫和少量出血點(圖1C),平均存活時間為(14.38±0.74)d。采用Log-Rank (Mantel-Cox)檢驗,B、C組皮瓣存活時間相較于A組明顯延長(均P<0.05)。

A:A組術后第7天,可見表皮糜爛壞死,為典型的急性排斥反應,分級為Grade Ⅲ級;B:B組術后第7天,出現(xiàn)出血點并水腫,皮溫升高,分級為Grade Ⅱ級;C:C組術后第7天,皮管僅出現(xiàn)輕度水腫和少量出血點,外觀正常

2.2 組織學檢查 各組皮瓣分別于術后第3、7天取材進行HE染色。A組第3天可觀察到中度至重度血管、毛囊周圍炎癥,炎癥累及表皮,表皮部分發(fā)生剝落,中度真皮水腫,根據(jù)分級可判定為Grade Ⅱ級;第7天出現(xiàn)廣泛的淋巴細胞浸潤,部分真皮組織壞死,累及表皮,出現(xiàn)表皮松解(圖2A)。B組和C組第3天只有少量的淋巴細胞浸潤,沒有累積到表皮;第7天出現(xiàn)輕度的淋巴細胞浸潤,伴隨輕度的表皮水腫(圖2B、C)。

A:A組術后第7天,可見真皮及毛囊周圍大量炎性細胞浸潤,血管內(nèi)外膜炎性細胞浸潤,管腔內(nèi)有血栓填塞,認定為排斥終點;B:B組術后第7天,皮下及毛囊周圍少量炎性細胞浸潤,真皮及皮下組織結構正常,有輕微水腫;C:C組術后第7天,皮瓣僅出現(xiàn)輕度淋巴細胞浸潤,伴輕度皮膚水腫

2.3 血清IL-2表達水平 各組分別在術前和術后第3、7、10天及排斥終點,采集鼠尾靜脈血液進行IL-2 表達水平檢測(圖3)。各組IL-2都有升高的情況發(fā)生,A組相較于其他各組,IL-2的升高非常明顯,在排斥終點(術后第7天)達到最大(245.94±10.21)ng/L;B、C組在術后第7天IL-2表達水平分別為(145.15±4.2)ng/L和(96.28±4.62)ng/L,A組與其他兩組比較具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)。B、C組相較于A組升高緩慢,但B組在第7天皮瓣出現(xiàn)出血點和有排斥現(xiàn)象發(fā)生后開始明顯升高,在排斥終點IL-2表達水平達到最高(221.35±5.46)ng/L。C組在術后第3天IL-2表達較穩(wěn)定,術后第7天后表達量增加,排斥終點時IL-2最高達到(189.97±4.76)ng/L。

圖3 各組血清 IL-2 表達水平比較

3 討 論

本實驗主要目的是要證明移植物局部的引流淋巴結在異體復合組織移植中是否參與了早期的排斥反應,干預淋巴結后能否延長皮瓣存活時間。研究主要集中在局部引流淋巴結上,通過設計不同的實驗方案,觀察研究引流淋巴結對于異體復合組織移植的影響。在實驗組中,我們設計了針對淋巴結和淋巴引流的一系列實驗,分別利用物理去除淋巴結及隔離淋巴引流的方法來驗證我們的設想。從實驗結果觀察,局部引流淋巴結的確在早期的急性排斥反應起到了一定的關鍵作用。與對照組(A組)相比,其余實驗各組都能有效地延長皮瓣的存活。

相較于內(nèi)臟器官的移植,皮膚組織移植后會產(chǎn)生強烈的排斥反應,因此認為皮膚組織是抗原性最高的組織[4]。而異體復合組織移植一般都含有皮膚組織,因此認為復合組織移植的排斥幾率要高于內(nèi)臟器官[5]。同種異體的排斥反應被認為是以T細胞適應性免疫應答為主的排斥反應過程[6]。初始T細胞在次級淋巴組織(Secondary lymphoid tissues,SLTs)與載有抗原的抗原提呈細胞(APCs)經(jīng)過反復接觸、識別,使初始T細胞逐漸成熟,并增殖成為效應T細胞,然后進入血液循環(huán),到達異體移植物局部后,促使移植物發(fā)生排斥反應。而APCs攝取含皮膚移植物的異體抗原后,只能沿著淋巴引流進入引流淋巴結,因此很難有大量的抗原通過血液進入脾或其他部位的淋巴結[7]。次級淋巴組織既是成熟T細胞、B細胞等免疫細胞定居的場所,同時也是產(chǎn)生免疫應答的部位?？乖騍LTs定向移動并被截留其中,這決定了淋巴結在免疫應答中的重要性。

有研究[8]發(fā)現(xiàn),在異體皮膚組織與受體真皮移植床建立新的血管化連接之前,由于淋巴引流受阻,推遲或阻止了移植物的排斥。這提示淋巴結是針對皮膚移植物發(fā)生免疫應答的主要部位[9]。我們實驗中也發(fā)現(xiàn),將皮瓣卷成皮管并用硅膠管隔絕供受體皮膚之間的接觸是能夠延長移植物的存活時間(C組),并且移植物的水腫情況比較嚴重,一般要在第10～12天能消腫,并且消腫后很快出現(xiàn)了排斥反應。這有可能和皮膚后期生長越過硅膠管使皮膚接觸有關,也有可能是依賴于SLTs,使初次免疫應答和初始T細胞激活產(chǎn)生效應細胞導致移植物的排斥[10-12]。一旦激活,初始T細胞分化成效應T細胞,可以遷移至外周組織,通過血液循環(huán)到達移植部位,從而發(fā)生移植物排斥[10]。

T細胞的激活需要兩個激活信號[13]。第一信號為抗原特異性T細胞的受體識別抗原提呈細胞表面的MHC抗原肽復合物;第二信號,又稱作共刺激信號,是T細胞表面受體識別抗原提呈細胞的相應配體。RAS -絲裂原活化蛋白激酶通路、鈣調(diào)磷酸酶通路等數(shù)個信號通路經(jīng)過這兩個信號活化,激活數(shù)個轉(zhuǎn)錄因子,如IL-2。IL-2可激活下游細胞因子的增殖,也稱為第三信號。經(jīng)過一系列信號傳導及活化,最終導致效應T細胞的CD4+T細胞和CD8+T細胞克隆增殖[14]。在我們的試驗中,A組相較于其他各組,IL-2的升高非常明顯,在排斥終點達到(245.94±10.21)ng/L,其他各組在該時間點略有增加,但是隨著IL-2的增加,慢慢也出現(xiàn)了排斥反應,最終在不外加其他任何干預的情況下,皮瓣全部壞死。

初始T細胞和大部分記憶性T細胞的活化部位是SLTs,同時該部位也是引發(fā)同種異體移植物排斥反應所必需的場所。在非血管化的皮膚、角膜移植實驗中證實,引流淋巴結對異體移植物的排斥起促進作用。有實驗研究[15-16]發(fā)現(xiàn),在大鼠異體角膜移植中,去除角膜的引流淋巴結(下頜淋巴結、頸淺淋巴結)可以延長正?；蚋呶＝悄ひ浦参锏拇婊顣r間。在小鼠、豚鼠、兔進行了去除引流淋巴結的皮片移植研究,證實可以延長皮片的移植時間[9,17]。在本實驗中,我們也進行了大鼠復合組織移植局部的淋巴結摘除。首先利用ICG的顯影技術,確定了該區(qū)域淋巴引流的方向和范圍(其引流方向是向腋下淋巴結處引流),切除移植物局部引流淋巴結后發(fā)現(xiàn),相較于對照組(A組)第3天出現(xiàn)的水腫和出血點情況,實驗組(B組)水腫和出血點等排斥跡象發(fā)生在第7天,該組皮瓣存活時間為(10.00±0.76)d,要高于對照組(A組),但是要低于C組。通過 IL-2 的變化(圖3),發(fā)現(xiàn)去除引流淋巴結在早期確實可以降低機體急性排斥反應強度。同時有研究[18-19]表明,在皮膚、角膜的移植中脾可能具有調(diào)節(jié)作用。我們實驗組在下一步的實驗中也將驗證這種排斥反應的發(fā)生是否和脾臟有著密切的關系。

總體從實驗結果來看,移植物局部的引流淋巴結在移植早期的確起著非常重要的作用。雖然到后期在不添加任何其他干預手段的情況下,皮瓣最終都會壞死,但是相較于對照組,的確起到了延緩排斥反應發(fā)生的作用。從臨床上看,現(xiàn)在的抗免疫排斥方面主要是早期全身給予大量免疫抑制劑或者激素,但是長期全身大量的用藥帶來了一系列的不良反應,主要有:機體代謝紊亂(糖尿病、庫欣綜合征等)、機會性感染(條件致病菌、真菌、皰疹病毒等)及腫瘤的發(fā)生等[20]。因此,局部用藥和減少用藥劑量就成了大家關心的一個問題。從我們的試驗中可以看出,早期干預移植物局部引流淋巴結可以延緩排斥反應的發(fā)生,延長皮瓣存活時間。淋巴結是特異性細胞免疫的必需場所。異體器官或組織移植后,供體抗原經(jīng)供體或受體的抗原提呈細胞攝取后,進入淋巴結激活初始T細胞,增殖為效應T細胞,經(jīng)過血液循環(huán)進入移植物破壞供體組織。根據(jù)角膜移植的研究可見,局部引流淋巴結對非血管化組織的免疫排斥起主要作用,而對于血管化的內(nèi)臟器官移植來說,引流淋巴結眾多,分布復雜、廣泛,不易對其操作,而對于血管化的頭面、四肢異體復合組織移植來說,引流淋巴結相對集中局限,容易干預。

在未來的研究中,我們將使用小劑量的免疫抑制藥物聯(lián)合移植物局部引流淋巴結的處理,對其進行有效干預,可能會降低術后(特別是術后早期)全身免疫抑制藥物的應用劑量,減少或避免全身大劑量用藥的不良反應,為異體復合組織移植探索一種新的安全有效的免疫抑制治療策略與方法,從而推動異體復合組織移植在臨床的廣泛應用。