王 蕾，許淑芬

廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，福建 廈門 361003

高齡孕婦是指孕婦在35周歲以上分娩的人群。隨著現(xiàn)代社會發(fā)展，職業(yè)女性多推遲生育，并且在我國二胎政策全面放開后，根據(jù)國家相關(guān)政策，符合二胎政策的育齡夫婦高達近9 000萬對，其中女性年齡在40歲以上的夫妻比例超過半數(shù)，女性年齡在35歲以上的夫妻更是高達六成，因此高齡夫婦尋求生育的人數(shù)越來越多，高齡生育是現(xiàn)階段許多女性需要面對的問題。在女性年齡增加的同時，高齡婦女卵巢功能下降，生殖細胞質(zhì)量下降，其自然受孕幾率下降［1］，需要去醫(yī)院輔助生殖中心尋求幫助的患者越來越多。高齡不孕患者行輔助生殖技術(shù)（ART）的數(shù)量近幾年呈明顯上升趨勢，高齡女性生育問題將面臨巨大的醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)。在過去的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，高齡女性行ART助孕過程中，面臨獲卵少、可用胚胎數(shù)量少評分低、反復(fù)移植失敗、流產(chǎn)率及胎兒畸形率高等臨床妊娠結(jié)局不良問題。

早在1988年，國外學(xué)者就對胚胎序貫移植（SET）進行了探討［2］，國內(nèi)學(xué)者亦在既往行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）失敗患者行冷凍胚胎解凍移植（FET）中的SET 方案進行了研究［3-4］，但目前在高齡不孕患者FET 周期中應(yīng)用SET方案的探討尚未見專家提出指導(dǎo)意見。本研究通過對生殖醫(yī)學(xué)中心高齡（年齡≥35歲）不孕女性冷凍胚胎解凍移植病例進行回顧性分析，為高齡女性FET方案選擇提供新的臨床思路，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年7月—2021年5月廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行FET、年齡≥35 歲患者的150 例作為研究對象，按移植胚胎種類分為三組，A 組（序貫移植n=30）、B組（移植2枚卵裂胚n=60）和C組（移植2枚囊胚n=60）。本研究納入標準：年齡≥35 歲。排除標準：年齡＜35 歲；有宮腔黏連、子宮內(nèi)膜息肉/黏膜下肌瘤、宮腔積液等。

1.2 胚胎選擇

患者冷凍/解凍胚胎按玻璃化冷凍/解凍胚胎。解凍后胚胎進行評估，卵裂胚：細胞數(shù)為7～9 個、細胞碎片＜10%、無多核化的胚胎定義為優(yōu)質(zhì)卵裂胚；囊胚：評分D5≥3BB、D6≥4BB的囊胚定義為優(yōu)質(zhì)囊胚［5-6］。

1.3 分組情況

內(nèi)膜準備方案：月經(jīng)及排卵規(guī)律的患者采用自然周期，陰道B超監(jiān)測排卵，在B超確定排卵后D3移植卵裂期胚胎，排卵后D5 移植囊胚。月經(jīng)及排卵不規(guī)律的患者采用激素替代周期準備內(nèi)膜，月經(jīng)周期第2～3 d 起口服芬嗎通紅片（含17β-E2，2 mg/片）4 mg/d×7 d，根據(jù)超聲、激素水平調(diào)整藥物用量，在使用芬嗎通紅片D14～15，內(nèi)膜厚度在8 mm 以上，給予安琪坦200 mg/d 置陰道+達芙通20 mg/d 轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，4 d 后行D3 卵裂胚移植，6 d 后行D5/D6囊胚移植。A組（序貫移植）為排卵后第3 d或激素替代周期孕酮轉(zhuǎn)化第3 d移植1枚D3卵裂胚，排卵后第5 d移或激素替代周期孕酮轉(zhuǎn)化第5 d植1枚D5/D6囊胚。B組（移植2枚卵裂胚）為排卵后第3 d或激素替代周期孕酮轉(zhuǎn)化第3 d移植2枚D3卵裂胚。C組（移植2枚囊胚）排卵后第5 d 移或激素替代周期孕酮轉(zhuǎn)化第5 d 植2 枚D5/D6囊胚。

1.4 移植后早孕診斷

卵裂胚移植14 d、囊胚移植11 d后，抽靜脈血行人絨毛膜促性腺激素（HCG）檢查確認妊娠；繼續(xù)用藥，在移植后4周左右，超聲提示宮內(nèi)見孕囊、胚芽及胎心搏動即判定為宮內(nèi)妊娠，未見胚芽、胎心者，7 d 后復(fù)查彩超，若認為見胚胎、胎心則判定胚胎停育、流產(chǎn)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，三組間比較采用F分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者一般臨床資料

本研究共納入FET 周期150 例，按子宮胚胎選擇準備方案分為A 組、B 組和C 組?；颊吣挲g35～42 歲，三組患者年齡、抗繆勒管激素（AMH）、基礎(chǔ)性激素比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組患者一般臨床資料（±s）

表1 三組患者一般臨床資料（±s）

組別A組（n=30）B組（n=60）C組（n=60）F值P值年齡37.3±2.22 37.4±2.20 37.8±2.14 0.735 0.481 AMH（ng/mL）2.18±1.04 1.87±1.28 1.76±0.79 1.581 0.209 FSH（mIU/mL）8.04±2.25 8.60±2.55 8.07±1.89 1.039 0.357 LH（mIU/mL）5.81±1.82 5.15±1.15 5.29±2.12 1.489 0.229 E2（pg/mL）50.86±21.36 56.67±35.55 57.33±26.19 0.526 0.592 T（ng/dL）17.46±8.70 18.12±8.57 18.13±7.04 0.083 0.920 P（ng/mL）0.45±0.20 0.61±0.23 0.56±0.19 1.909 0.152

2.2 三組患者FET臨床結(jié)局

三組患者的臨床指標：孕酮轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度、移植優(yōu)質(zhì)胚胎率、多胎妊娠率和早期流產(chǎn)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但A 組患者臨床妊娠率和胚胎種植率明顯高于B、C 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組患者FET臨床結(jié)局（±s）

表2 三組患者FET臨床結(jié)局（±s）

組別A組（n=30）B組（n=60）C組（n=60）F/χ2值P值轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度（images/BZ_32_2167_1986_2181_2019.png±s）10.04±1.53 10.34±1.53 9.81±1.41 1.959 0.145移植優(yōu)質(zhì)胚胎（%）93.33 94.17 91.67 0.589 0.745胚胎種植（%）31.67 15.83 25.83 6.569 0.037妊娠（%）56.67 30.00 41.67 6.042 0.049多胎妊娠（%）11.76 5.56 24.00 2.987 0.225早期流產(chǎn)（%）5.88 11.11 12.00 0.456 0.796

3 討論

隨著女性年齡增加自然受孕能力開始出現(xiàn)斷崖式下降，流產(chǎn)率明顯升高。ART經(jīng)過40余年發(fā)展，胚胎冷凍、解凍移植技術(shù)日益成熟，高齡患者因自身條件受限，新鮮周期移植取消率明顯高于年輕患者，冷凍胚胎解凍比率亦明顯升高。目前大多數(shù)專家學(xué)者認為，在ART周期的移植胚胎選擇方案為移植單個優(yōu)質(zhì)胚胎，能在保證較高妊娠率的同時能降低多胎妊娠率，是目前大多數(shù)輔助生殖中心選擇移植胚胎的主要策略。但年齡是影響妊娠結(jié)局的重要因素［7］，高齡患者由于自身條件受限，難以獲得質(zhì)量較好的優(yōu)質(zhì)囊胚，因此胚胎移植后臨床妊娠率一直處于較低水平［8］，高齡患者移植胚胎選擇面臨更多困難。在冷凍胚胎解凍周期中，高齡不孕患者由于常常需要多個取卵周期累積胚胎，獲得優(yōu)質(zhì)胚胎不容易，需要個性化選擇更好的方案移植以提高妊娠率。在臨床上，F(xiàn)ET的胚胎選擇方式主要有卵裂胚移植、囊胚移植以及卵裂胚+SET。

SET方案的研究初衷在于提高患者的胚胎種植率以增加ART的成功率，Yazbeck等［9］的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在反復(fù)移植失敗的患者中，冷凍胚胎解凍移植行SET妊娠結(jié)局明顯高于純卵裂期胚胎以及純囊胚移植。張印峰等［10］國內(nèi)學(xué)者也得出解凍周期SET能夠顯著提高RIF患者臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率的結(jié)論，尤其是SET 2枚胚胎在顯著提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率的同時不增加多胎妊娠率，研究中認為SET 可成為RIF 患者的一種有效的治療手段。合并RIF的多囊卵巢綜合征（PCOS）患者行SET后臨床妊娠率和胚胎種植率均得到顯著提高［11］。

本研究結(jié)果顯示，在高齡不孕患者行FET 周期中，SET 組妊娠率及胚胎種植率顯著高于移植2 枚卵裂胚及2枚囊胚組。分析其原因可能有以下幾點：第一，在序貫移植中，初次行胚胎移植時移植管伸入宮腔的操作是對子宮內(nèi)膜形成機械性微刺激，這可能有利于胚胎著床［12］，其機制可能是刺激子宮內(nèi)膜募集可促進胚胎著床的細胞因子，如白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、γ-干擾素（IFN）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等有利于增加子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的因子分泌，以及白細胞抑制因子（LIF）、骨橋蛋白（OPN）等誘導(dǎo)胚胎著床相關(guān)的因子分泌。同時，巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷性細胞（NK）聚集活化增加，這能夠促進上述相關(guān)因子的分泌表達，子宮自然殺傷性細胞可以促進血管新生，增加子宮內(nèi)膜和內(nèi)膜下血流，利于滋養(yǎng)細胞侵入［13］從而提高胚胎植入提高妊娠率。第二，SET周期第一個移植的胚胎（第3 d的卵裂胚）在種植進入子宮內(nèi)膜后，導(dǎo)致環(huán)氧合酶2（COX 2）基因表達上調(diào)，前列腺素2（PG-2）生成增加，促進血管生成，誘導(dǎo)組織特異性子宮NK 細胞增殖，進而調(diào)節(jié)胚胎附著、子宮內(nèi)膜重塑、抗氧化防御和囊胚周圍免疫機制中的胚胎自分泌和母體旁分泌因子，增進了胚胎和內(nèi)膜間的相互作用，這種作用使得內(nèi)膜出現(xiàn)了“種植窗”狀態(tài)，促進第二次移植的胚胎植入［14］。第三，SET中由于兩次移植不同時期胚胎，第一個移植的卵裂胚種植后能誘導(dǎo)分泌的絨毛膜促性腺激素HCG，而HCG 的分泌促進白細胞介素-1（IL-1）分泌。IL-1作為重要的胚胎信號，多方面影響子宮內(nèi)膜容受性促進胚胎著床。IL-1等細胞因子能促進白血病抑制因子（LIF）、前列腺素2（PGE2）等表達，這些細胞因子的分析均有增加子宮內(nèi)膜容受性的作用，從而促進胚胎著床、提高妊娠率［15］。本研究結(jié)果還顯示，SET組的多胎妊娠率、流產(chǎn)率與另外兩組無顯著差異，序貫移植并未顯著增加多胎妊娠及流產(chǎn)風(fēng)險，這與既往的研究結(jié)果一致［16-17］。

胚胎在體外培養(yǎng)至囊胚階段能對胚胎進行進一步的評估和篩選，但因體外培養(yǎng)條件的受限、高齡患者胚胎發(fā)育潛能下降等眾多因素，可能面臨無囊胚移植風(fēng)險，因此高齡SET存在一定的局限性。但有在FET周期中已經(jīng)有多種胚胎選擇的條件下，SET不僅可以應(yīng)用在反復(fù)移植失敗患者中，還可以作為一種相對能提高妊娠率而不增加多胎率、流產(chǎn)率的有效方案在高齡不孕患者FET中應(yīng)用，國內(nèi)學(xué)者［18］在對40歲以上超高齡反復(fù)移植失敗患者冷凍胚胎SET結(jié)局的研究得到了與本次研究結(jié)果一致的結(jié)論。但是由于SET 在一次冷凍胚胎解凍周期中存在兩次胚胎解凍，兩次移植，在一定程度上增加了患者經(jīng)濟及時間成本，這也是臨床工作中需要綜合考慮的問題。

綜上所述，冷凍胚胎移植周期中，SET對高齡不孕患者是一種有效的移植策略，但目前研究者收集臨床樣本量較少，還需要今后更大樣本量的臨床研究進一步探討。