羅超迪,閆 煬,鄭幸龍,韓 丹

抗癲癇藥物苯妥英(phenytoin,PHT)是一種ⅠB類抗心律失常藥物,主要作用于心肌細(xì)胞的電壓依賴性鈉離子通道(Nav1.5)[1]。苯妥英用作抗心律失常藥物的典型劑量為每天200～400 mg,目標(biāo)血藥濃度為40～70 μmol/L[2]。然而,苯妥英引起的一些嚴(yán)重心臟不良反應(yīng)已有報(bào)道,特別是在心律失常方面,包括心動(dòng)過緩、竇性停搏、Ⅰ型Brugada型心電圖模式和心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)[3-6]。體外研究表明,苯妥英引起的心律失常可能是由于其阻斷了快速激活的延遲整流鉀(IKr)通道而引起的[7]。苯妥英通過阻斷IKr通道導(dǎo)致心臟復(fù)極時(shí)間延長(zhǎng),進(jìn)而導(dǎo)致QT間期延長(zhǎng),早期后除極(early after depolarization,EAD)、延遲后除極(delayed after depolarization,DAD)和觸發(fā)活動(dòng),增加了室性復(fù)極的透壁分散,最終導(dǎo)致尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速(torsades de pointes,TdP)甚至心室顫動(dòng)(ventricular fibrillation,VF)[8]。

鈣電流是由廣泛分布于心臟組織的L型鈣通道(Cav1.2)介導(dǎo)的,該通道在心臟組織中發(fā)揮重要的生理作用。心臟Cav1.2通道參與觸發(fā)興奮-收縮耦聯(lián)(excitation-contraction coupling,EC),控制動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration,APD)并且調(diào)節(jié)基因表達(dá)[9]。研究表明,當(dāng)內(nèi)向電流增加和/或外向電流減少時(shí)會(huì)發(fā)生EADs,導(dǎo)致心臟APD延長(zhǎng),其中鈣離子(Ca2+)內(nèi)流發(fā)揮重要作用,在這種條件下,動(dòng)作電位平臺(tái)期Cav 1.2通道可能重新激活并反向復(fù)極化[10]。研究還表明,細(xì)胞內(nèi)Ca2+循環(huán),特別是自發(fā)Ca2+釋放是導(dǎo)致EADs的原因之一[11]。

Cav1.2通道在心臟的起搏、心率、心律和收縮活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12]。苯妥英誘發(fā)的心律失?？赡芘c其干擾心臟Cav1.2通道有關(guān)。苯妥英對(duì)胰高血糖素分泌腫瘤細(xì)胞中的Cav1.2通道的影響已有研究,但苯妥英對(duì)心肌細(xì)胞(CMs)中Cav1.2通道的作用機(jī)制尚不清楚[13]。本研究采用CellTiter-Glo法探討苯妥英對(duì)CMs活性的影響,采用蛋白免疫印跡法(Western Blot)和激光掃描共聚焦顯微鏡探討苯妥英對(duì)SD大鼠CMs中Cav1.2通道的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

1 材料與方法

1.1 心肌原代細(xì)胞提取 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)乳鼠(1～3 d,購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)10只,乙醇消毒后將心臟剪下并將心室肌組織剪碎成約1 mm3組織塊,在不含鈣離子和鎂離子的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(Hyclone)中沖洗2次,向組織塊中加入2 mL胰蛋白酶(索萊寶,T1300)和Ⅱ型膠原酶(索萊寶,C8150),37 ℃水浴鍋中輕微震蕩,取出上清,并在上清中加入含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素(Hyclone)的DMEM/F-12培養(yǎng)基(Corning),重復(fù)7次,前4次每次振蕩5 min,后3次每次振蕩7 min。用鐵篩將消化后的液體過濾,將收集到的液體以800 r/min離心5 min。棄上清液,然后用DMEM-F12完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并培養(yǎng)。培養(yǎng)45 min后,心肌成纖維細(xì)胞貼壁,取上清液,同時(shí)在上清液中加入抑制劑,上清液即為原代心肌細(xì)胞。

1.2 苯妥英配制 苯妥英(S2525,Selleck)溶解于二甲基亞砜(DMSO)(碧云天,ST038)中,儲(chǔ)存液濃度為20 mg/mL,-20 ℃保存,每次實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水連續(xù)稀釋至最終使用濃度。實(shí)驗(yàn)過程中DMSO的最終含量不超過0.05%。

1.3 細(xì)胞干預(yù)及CellTiter-Glo法測(cè)定細(xì)胞活力 CellTiter-Glo法是基于ATP檢測(cè)的快速細(xì)胞活力檢測(cè)法[14]。將原代CMs接種于96孔板(100 μL,5×104個(gè)/mL細(xì)胞,5 000個(gè)/孔細(xì)胞),待細(xì)胞充分貼壁后換用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12 h后,分別使用含0 μg/mL、0.000 1 μg/mL、0.001 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、100 μg/mL苯妥英的完全培養(yǎng)基干預(yù)細(xì)胞并進(jìn)行分組,然后在37 ℃、5%CO2環(huán)境中分別孵育24 h和48 h(1 μg/mL苯妥英≈3.96 μmol/L苯妥英)。每孔加入CellTiter-Glo試劑和DMEM(Corning)各50 μmol/L,在避光條件下于培養(yǎng)箱中孵育10 min。使用Tecan Infinite M1000酶標(biāo)儀(Tecan Austria GmbH,Gr?dig,Austria)記錄結(jié)果。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)至少3遍至結(jié)果保持穩(wěn)定。

1.4 Western Blot測(cè)定Cav1.2蛋白水平 將原代CMs(n=1 250)接種于直徑35 mm的培養(yǎng)皿(中國(guó)香港NEST Biotechnology公司)內(nèi),待細(xì)胞充分貼壁后換用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12 h后,分別使用含0 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、100 μg/mL苯妥英的完全培養(yǎng)基干預(yù)細(xì)胞48 h后提取蛋白。每1 mL蛋白裂解液RIPA(碧云天,P0013B)中加入20 μL(50×)蛋白酶抑制劑儲(chǔ)存液(碧云天,P1005),使抑制劑的最終濃度為1 mmol/L。吸去上清液后,用PBS清洗培養(yǎng)皿3次,加入100 μL蛋白裂解液,在冰上用細(xì)胞刮刀輕刮細(xì)胞,每次5min,3次后將液體轉(zhuǎn)移至1 mL EP 管中,冰上孵育30 min,旋渦振蕩3次,于4 ℃,半徑12 cm,12 000 r/min離心30 min,將上清液轉(zhuǎn)移至干凈EP管內(nèi),用蛋白定量試劑盒(中暉赫彩,PQ003)測(cè)定各組樣本蛋白質(zhì)濃度,分裝后置于-80 ℃冰箱保存。取蛋白樣品40 g進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(碧云天,FFP39),室溫下使用50 g/L牛血清清蛋白的TBST封閉硝酸纖維膜2 h,再加入羊抗鼠Cav1.2抗體(Abcam,ab58552)中4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(博奧森,bs-80295G-HRP)孵育1 h,將膜用TBST緩沖液洗滌3次后加入超敏化學(xué)發(fā)光試劑(碧云天,P0018FS),曝光、成像。用Quantity One分析軟件測(cè)定各條帶灰度值,結(jié)果用目的條帶的灰度值/β-actin條帶的灰度值表示。

1.5 Cav1.2蛋白的表達(dá)定位 將原代CMs(1 250個(gè))接種于直徑35 mm的培養(yǎng)皿(香港NEST Biotechnology公司)內(nèi),待細(xì)胞充分貼壁后換用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12 h后,分別使用含0 μg/mL和10 μg/mL苯妥英的完全培養(yǎng)基干預(yù)細(xì)胞48 h后連續(xù)孵育抗CACNA1C抗體(Abcam,ab58552),抗Calnexin抗體(Invitrogen,MA3-027),Hoechest(Sangon,E607329)。洗滌后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(Invitrogen,1832035)孵育,細(xì)胞圖像采用FV1000激光掃描顯微鏡(德國(guó)Leica,DM2500)獲取。

2 結(jié) 果

2.1 CellTiter-Glo法檢測(cè)苯妥英對(duì)細(xì)胞活力的影響 隨著苯妥英濃度的增加,除100 μg/mL組在干預(yù)48 h時(shí)的細(xì)胞存活率降低到85.23%(P<0.05)外,其余各組間細(xì)胞存活率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1。

2.2 Western Blot檢測(cè)苯妥英對(duì)Cav1.2蛋白合成的影響 根據(jù)CellTiter-Glo實(shí)驗(yàn)和前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7],本研究選擇了不同濃度的苯妥英(0 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、100 μg/mL)干預(yù)原代CMs 48 h后提取細(xì)胞蛋白。采用Western Blot評(píng)價(jià)不同濃度苯妥英對(duì)原代CMs中Cav1.2通道蛋白合成的影響。結(jié)果顯示,100 μg/mL苯妥英組明顯降低了原代CMs中Cav1.2蛋白的合成,與0 μg/mL組細(xì)胞比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖2、圖3)。因此,認(rèn)為苯妥英在超過治療水平的較高濃度下可能導(dǎo)致Cav1.2通道蛋白合成異常。

圖2 Cav1.2及β-actin蛋白免疫印跡

與0 μg/mL苯妥英組比較,＊ P<0.05。圖3 Cav1.2蛋白表達(dá)定量圖

2.3 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察苯妥英對(duì)Cav1.2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 為確定苯妥英對(duì)Cav1.2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,使用激光掃描共聚焦顯微鏡評(píng)估0 μg/mL和10 μg/mL苯妥英干預(yù)組原代CMs染色圖像(見圖4),對(duì)照組抗CACNA1C抗體熒光(紅色)主要出現(xiàn)在細(xì)胞表面,表明Cav1.2蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜。然而,10 μg/mL干預(yù)組細(xì)胞圖像顯示,Cav1.2通道蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜受阻,紅色熒光從膜上消失,Calnexin是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上作為分子伴侶參與新生肽鏈的折疊、加工的蛋白質(zhì),抗Calnexin抗體熒光(綠色)集中分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,說(shuō)明10 μg/mL苯妥英干預(yù)后Cav1.2 蛋白由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜受阻。盡管苯妥英在100 μg/mL水平開始抑制Cav1.2通道蛋白的合成,但在治療劑量范圍內(nèi)可誘導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙。以上結(jié)果表明,苯妥英易導(dǎo)致Cav1.2通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)異常。

圖4 原代CMs亞細(xì)胞水平Cav1.2蛋白定位圖像(A、B、C、D為無(wú)苯妥英干預(yù)的原代CMs的圖像,E、F、G、H為10 μg/mL苯妥英干預(yù)的原代CMs的圖像。藍(lán)色標(biāo)記細(xì)胞核,綠色標(biāo)記Calnexin,紅色標(biāo)記Cav1.2)

3 討 論

苯妥英于1938年作為一種抗癲癇藥物引入臨床,后來(lái)又作為抗心律失常藥物被用于心血管領(lǐng)域[15]。近年來(lái),心電生理領(lǐng)域?qū)Ρ酵子⒉涣挤磻?yīng)的認(rèn)識(shí)逐漸深入。苯妥英的致心律失常作用是由于其阻斷了心肌細(xì)胞離子通道,其中Cav1.2通道在調(diào)節(jié)心率和心律方面發(fā)揮重要作用[16]。本研究評(píng)估了苯妥英對(duì)原代CMs中Cav1.2蛋白合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,結(jié)果顯示,苯妥英對(duì)心臟Cav1.2通道蛋白表達(dá)的抑制具有濃度依賴性;Western Blot顯示,100 μg/mL苯妥英導(dǎo)致Cav1.2通道蛋白合成顯著降低;苯妥英干預(yù)后的細(xì)胞熒光照片顯示,Cav1.2通道蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面的過程出現(xiàn)異常。苯妥英雖然僅在大于治療劑量上抑制了Cav1.2的合成,但仍可在治療劑量范圍內(nèi)誘導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙,這或許可以部分解釋苯妥英的致心律失常作用;也有可能是由于苯妥英對(duì)Nav1.5通道的抑制作用使Na+電流降低,抑制Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinasesⅡ,CaMKⅡ)的活性,進(jìn)而導(dǎo)致Cav1.2通道蛋白表達(dá)降低。因此,苯妥英對(duì)CMs Cav1.2蛋白的影響也可通過Na+和Ca2+阻滯劑干預(yù)進(jìn)一步探究。

Abrahamsson等[17]研究發(fā)現(xiàn),較低水平的苯妥英導(dǎo)致心動(dòng)過緩,而隨著苯妥英濃度的增加,逐漸出現(xiàn)室性心律失常、其他嚴(yán)重的心臟不良反應(yīng),如致命性室性心律失常,Ⅰ型Brugada型心電圖、低血壓、竇性停搏和SCD也有報(bào)道[5-6,18]。苯妥英抑制Cav1.2蛋白的合成和轉(zhuǎn)運(yùn),可能導(dǎo)致Ca2+電流降低,從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)功能障礙,從而阻礙相鄰心肌細(xì)胞電活動(dòng)的傳導(dǎo)。隨著Ca2+電流的降低,IKr相對(duì)增加,促進(jìn)APD明顯縮短,心室復(fù)極跨壁離散度增加,導(dǎo)致ST段抬高,J波形成,甚至“R on T”,最終導(dǎo)致心室顫動(dòng)[19-20]。這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)在一定程度上可以解釋苯妥英引起的心律失常。另有研究顯示,苯妥英成功糾正了用傳統(tǒng)治療方法難以糾正的TdP病人的心律失常[21-22]。苯妥英的抗心律失常作用包括降低心室自律性、交感放電和增加房室傳導(dǎo)速度[21]。

由于苯妥英對(duì)Cav1.2通道的抑制作用,本研究結(jié)果顯示,苯妥英在不同的個(gè)體中表現(xiàn)出促心律失常作用或抗心律失常作用。因此,苯妥英的用藥是一把雙刃劍,在選擇用藥中應(yīng)綜合評(píng)價(jià)苯妥英的個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)獲益比,以減少不良反應(yīng)的發(fā)生。

綜上所述,本研究驗(yàn)證了苯妥英對(duì)心臟Cav1.2通道的影響,苯妥英以濃度依賴性的方式抑制Cav1.2通道,改變Cav1.2蛋白合成并干擾通道蛋白運(yùn)輸,這可能是苯妥英促心律失常作用的原因。