周玉斌　湯海濤　吳丹明

[摘要] 目的 探討CD40基因單核苷酸多態(tài)性及其基因型與下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的相關(guān)性。 方法 采用reverse transcription-PCR技術(shù)及DNA測序法對(duì)經(jīng)動(dòng)脈彩色多普勒檢查診斷為下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的201例患者（病例組）及健康體檢中未發(fā)現(xiàn)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的198例健康人（對(duì)照組）進(jìn)行檢測分析，比較CD40基因rs1883 832C/T單核苷酸多態(tài)性及其基因型與下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的相關(guān)性。 結(jié)果 下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥組與健康對(duì)照組CD40基因rs1883832C/T位點(diǎn)中CC基因相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.380，P=0.007）；通過等位基因頻率的危險(xiǎn)性評(píng)估發(fā)現(xiàn)，C基因攜帶者患下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的風(fēng)險(xiǎn)是T基因攜帶者的1.304倍（OR=1.304）。 結(jié)論 CD40基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1883832C/T與下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)病顯著相關(guān)，其中C等位基因可能是該疾病的危險(xiǎn)因素。

[關(guān)鍵詞] 基因；等位基因；動(dòng)脈粥樣硬化；單核苷酸多態(tài)性

[中圖分類號(hào)] RR543.5；R440 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）36-0026-03

[Abstract] Objective To investigate the correlation between single nucleotide polymorphisms of CD40 gene as well as its genotype and arteriosclerosis obliterans of lower extremities. Methods 201 patients who were diagnosed with arteriosclerosis obliterans by arterial color Doppler ultrasonography examination（case group） and 198 cases of healthy patients who were not found lower extremity arteriosclerosis obliterans in health examination（control group） were detected and analyzed by use of reverse transcription-PCR and DNA sequencing. The correlation between CD18 gene rs1883832C/T single nucleotide polymorphisms as well as their genotype and lower extremity arteriosclerosis obliterans were compared. Results CC gene in CD40 gene rs1883832C/T locus of the case group was significantly different from that of the control group（χ2=7.380， P=0.007）. Through the risk assessment of allele frequency， it was found that the risk of atherosclerotic occlusive disease in C gene carriers was 1.304 times that of T gene carriers（OR=1.304）. Conclusion CD40 gene polymorphic locus 1883832C/T was significantly associated with the development of lower extremity arteriosclerosis obliterans， in which C allele may be a risk factor for the disease.

[Key words] Gene； Allele； Atherosclerosis； Single nucleotide polymorphism

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥是全身動(dòng)脈粥樣硬化在下肢動(dòng)脈的表現(xiàn)，是反應(yīng)全身動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)窗口，通常發(fā)生在40歲以上人群中，隨著年齡增加而逐漸加重[1]，常因動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、管腔狹窄或閉塞導(dǎo)致間歇性跛行、患肢皮溫低、疼痛甚至發(fā)生潰瘍或肢體壞死[2]。近年來，越來越多的研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈內(nèi)膜發(fā)生了炎癥性質(zhì)的改變，而CD40基因可以對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行激活，從而促進(jìn)動(dòng)脈內(nèi)膜的炎癥改變的發(fā)生[3，4]，為了探討CD40基因與下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥之間的關(guān)系，本文采用reverse transcription-PCR技術(shù)及DNA測序法對(duì)201例下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥患者及198例健康人進(jìn)行檢測，通過對(duì)兩組人群進(jìn)行比較，探討 CD40基因單核苷酸多態(tài)性及其基因型與下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的相關(guān)性，為基因與表型之間的聯(lián)系提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)，為進(jìn)一步研究下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)病機(jī)制提供線索。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2014年1月～2016年5月間于我院住院就診的下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的201例患者為病例組，其中男123例，女78例，平均年齡（63.2±15.1）歲，另選擇2015年5月～2015年8月間來我院健康體檢的40歲以上健康人198例為對(duì)照組，其中男105例，女93例，平均年齡（64.7±18.3）歲。病例組與對(duì)照組在年齡、性別等方面均衡可比。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：病例組患者均符合2011年衛(wèi)生部頒布的下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS 339-2011），所有納入的人群均不合并血管栓塞性疾病、血管炎性疾病及腫瘤、自身免疫性疾??；排除標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)生過血栓閉塞性脈管炎、多發(fā)性大動(dòng)脈炎、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周圍炎、特發(fā)性動(dòng)脈血栓形成以及急性下肢動(dòng)脈栓塞的患者；拒絕進(jìn)行本次研究的患者。

1.3研究方法

采用reverse transcription-PCR技術(shù)及DNA測序法檢測目的基因的多態(tài)性。

1.3.1 RNA的提取 在調(diào)查對(duì)象全血中收集單個(gè)核細(xì)胞，采用改良酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取法（TRIzol法）提取單核細(xì)胞基因組RNA[5]，然后將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成c-DNA保存于-80℃冰箱中備用。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì) 采用primer premier5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)CD40基因rs1883832C/T基因序列的擴(kuò)增引物。首先在NCBI的基因庫中查找該基因的基因序列，復(fù)制序列至primer premier5軟件，設(shè)置參數(shù)，引物長度一般設(shè)置成18～30 bp，擴(kuò)增片段長度設(shè)置成100～600 bp。設(shè)計(jì)完成后采用Oligo 6.0軟件對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)估。

1.3.3 引物的合成 采用分子量標(biāo)準(zhǔn)引物定位合成法（marker primer-directed synthesis，MPDS）[6]合成以上軟件設(shè)計(jì)的引物，其中，rs1883832C/T位點(diǎn)堿基的DNA片段正向引物序列為5-GGACCTGGGGG-CAAAGAAGA-3，反向引物序列為5-CCCACTCCCAAC-TCCCGTCT -3。

1.3.4 PCR擴(kuò)增 該CD40基因單核苷酸的PCR擴(kuò)增體系共50 μL，具體反應(yīng)體系成分及擴(kuò)增程序見表1、2。CD40基因單核苷酸多態(tài)性分型用Genemapper4.0進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

CD40基因各多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，病例組與對(duì)照組兩組之間基因型及等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)于其中單個(gè)基因是否是導(dǎo)致該病的危險(xiǎn)因素采用OR（比值比）進(jìn)行計(jì)算，OR值>1表示該因素是危險(xiǎn)因素；OR值<1，表示該因素是保護(hù)因素。采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD40基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型

CD40基因rs1883832C/T位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為374 bp。根據(jù)單核苷酸多態(tài)性分型結(jié)果，CD40基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型均為CC型、CT型以及TT型。

2.2 病例組與對(duì)照組CD40基因多態(tài)性的差異

經(jīng)過Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)所納入的兩組人群中CD40基因型分布頻率與現(xiàn)實(shí)人群分布一致，處于遺傳平衡狀態(tài)，具有群體代表性。下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥組與健康對(duì)照組CD40基因rs1883832C/T位點(diǎn)，CC、TT基因型和C、T等位基因頻率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中，C基因攜帶者患下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的風(fēng)險(xiǎn)是T基因攜帶者的1.304倍（OR=1.304）。見表3。

3 討論

隨著年齡的增長，下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)病率逐年提高，帶給人們的健康危害也越來越大。據(jù)報(bào)道，國外75歲以上人群中患病率接近20%[7-9]，在我國，老年人群中下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的患病率高達(dá)10% 以上[10]。同時(shí)，相應(yīng)的流行病學(xué)調(diào)查顯示，在進(jìn)行下肢截肢的患者中約有40%～60%是因?yàn)榘l(fā)生了下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥[11]，即便能夠保留下肢，對(duì)于下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的患者而言，其自己本身的生活質(zhì)量也不高。因此，關(guān)于下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的病因?qū)W研究也顯得愈加重要。越來越多的有關(guān)動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病與基因間的關(guān)系的研究證實(shí)基因?qū)用娴牟∫虿攀菍?dǎo)致該疾病發(fā)生的主要原因[12]。而進(jìn)行年來，越來越多的研究表明造成動(dòng)脈粥樣硬化的最主要原因是因?yàn)槁匝装Y性質(zhì)的改變，在最近的基因與疾病的相關(guān)性研究中，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)多種細(xì)胞的腫瘤壞死因子受體超家族成員CD40的多態(tài)性與血管硬化性疾病的發(fā)生具有相關(guān)性，以往的研究顯示正常的動(dòng)脈內(nèi)并不存在CD40L，僅僅只存在CD40，但是在存在著動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞中CD40L與CD40均存在。而進(jìn)一步的研究證明，一旦位于血管平滑肌內(nèi)的CD40L被激活，會(huì)使得細(xì)胞外間質(zhì)膠原纖維的降解增大，從而使得動(dòng)脈血管內(nèi)斑塊的不穩(wěn)定性增加，進(jìn)一步加速下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)生[13]。

本病例對(duì)照研究中，下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥組在rs1883832C/T位點(diǎn)上CC等位基因的頻率要顯著高于與健康對(duì)照組（P<0.05）。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)rs1883832C基因攜帶者患下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的風(fēng)險(xiǎn)是T基因攜帶者的1.304倍（OR=1.304）。上述研究結(jié)果表明：CD40基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1883832C/T與下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)病顯著相關(guān)，其中C等位基因可能是該疾病的危險(xiǎn)因素。這一研究結(jié)果也與國內(nèi)外相關(guān)的研究結(jié)果相印證。國內(nèi)學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，CD40的多態(tài)性可影響CD40基因及蛋白表達(dá)，進(jìn)而對(duì)于CD40相關(guān)疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸都能發(fā)生相應(yīng)的影響[12]，結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為CD40基因rs1883832C/T位點(diǎn)C基因在下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)病中起到重要作用， C等位基因可能通過促進(jìn)CD40基因多態(tài)性的表達(dá)而促進(jìn)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)病。在現(xiàn)代的研究中相關(guān)的學(xué)者目前在動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)研究中已經(jīng)達(dá)成共識(shí)，即動(dòng)脈粥樣硬化為“炎癥損傷反應(yīng)”機(jī)制下的一個(gè)產(chǎn)物。而CD40可以通過對(duì)于MCP-1的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)，從而促進(jìn)血管平滑肌的細(xì)胞分裂增殖，同時(shí)還能使原本處于靜止?fàn)顟B(tài)的位于中層的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行遷移，往內(nèi)膜處進(jìn)行遷移，最終形成纖維性斑塊。同時(shí)CD40不斷的增加炎癥因子的釋放，導(dǎo)致了血管內(nèi)皮的損傷，并且發(fā)生沉積反應(yīng)，最后激活CD40基因，使得免疫細(xì)胞大量的聚集，發(fā)生一系列相關(guān)的反應(yīng)后最終導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化的形成[14，15]。

本研究結(jié)果提示CD40基因多態(tài)性與下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥之間具有相關(guān)性，但基因與該疾病之間的具體分子生物學(xué)機(jī)制以及CD40基因在下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥發(fā)病中所占的比重仍然未知，要真正搞清這些問題，在基因角度上提出疾病預(yù)防的依據(jù)，仍然需要大樣本、多中心的隨機(jī)對(duì)照研究的印證。

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（收稿日期：2016-09-17）