周文成 綜述 沈山 審校

暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510635

動物模型與人類生理特點相似、疾病表征相近、解剖結(jié)構(gòu)相符合的動物，通過實驗方法人為地改造或者利用某些動物的天然屬性，從而得到能夠外推到人類目標群體的真理。它是進入臨床實驗前不可或缺的的一部分，是基礎(chǔ)實驗步入臨床研究的關(guān)鍵步驟。實驗動物可以模擬人類疾病的發(fā)病過程、病理改變、臨床表現(xiàn)，從而成為目前究疾病病因、發(fā)病機制、治療方法的重要途徑。近年來，有關(guān)顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular disorders，TMD)研究的動物模型層出不窮。根據(jù)不同的病因和癥狀，可以采用不同的方式來誘導(dǎo)，主要分為以下四種方式：化學(xué)注射法、機械刺激法、手術(shù)誘導(dǎo)法、基因工程修飾法。根據(jù)TMD的不同病因，采取各種檢索方式和選擇標準，使用各種搜索詞的組合，如顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病、動物模型、實驗動物、發(fā)病機制。對相關(guān)文獻、綜述、會議文章進行檢索、納入和綜述，以尋找TMD的動物模型建立方法。

1 不同化學(xué)誘導(dǎo)劑作用機理及評價

1.1 完全弗氏佐劑誘導(dǎo)完全弗氏佐劑(complete freund's adjuvant，CFA)是一種油鹽乳液，熱滅活的結(jié)核分支桿菌懸浮其中，能夠有效地誘導(dǎo)抗體生成。CFA活性來自于油滴中免疫抗原的持續(xù)釋放，并刺激局部免疫反應(yīng)。Wang等[1]以7周齡雌性SD大鼠為實驗對象，在大鼠適應(yīng)環(huán)境后的第1天和第14天分別向大鼠的顳下頜關(guān)節(jié)(temporomandibular joint，TMJ)上腔注射CFA。在首次注射后的第1天，實驗組相對于對照組，頭圍平均增加了5 mm，提示關(guān)節(jié)發(fā)生嚴重腫脹，且頭部抽離閾值(head withdraw threshold)明顯低于對照組，表明實驗組大鼠產(chǎn)生劇烈疼痛；實驗組大鼠HE染色結(jié)果顯示大鼠表現(xiàn)出慢性滑膜炎的特征：滑膜襯里細胞增生，伴有大量單核細胞浸潤，且關(guān)節(jié)盤出現(xiàn)增厚和變形；實時熒光定量qPCR(RT-qPCR)結(jié)果顯示iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶)、IL-1β(白介素-1β)表達量明顯高于對照組，這導(dǎo)致關(guān)節(jié)盤炎性增厚，濕重和凈重增加，膠原蛋白和蛋白聚集多糖含量升高。這些結(jié)果驗證了Wang等[1]的假設(shè)：持續(xù)炎癥是顳下頜關(guān)節(jié)退行性變的誘發(fā)因素。然而，值得注意的是關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)盤前帶和中間帶的單核細胞總數(shù)顯著高于對照組，但后帶的單核細胞總數(shù)在對照組和實驗組之間無統(tǒng)計學(xué)意義。Barbin等[2]將CFA與牛二型膠原蛋白(typeⅡbovine collagen，CⅡ)混懸液注射入大鼠尾部，5 d后在同一部位進行二次注射。實驗組的IL-1β、TNF-α分泌水平明顯高于對照組，表明組織處于急性炎癥期。而IL-10的表達量卻低于對照組。同時組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CFA組TMJ髁突頂端區(qū)域纖維層、增生層厚度明顯低于對照組，同時實驗組所有動物均表現(xiàn)出髁突軟骨和軟骨下骨膠原纖維退化，膠原纖維數(shù)量減少。McIlwrath等[3]通過將CFA注射入TNF-α缺失小鼠顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)并聯(lián)合結(jié)腸刺激構(gòu)建了“雙重打擊”TMD炎癥模型。具體的構(gòu)建過程如下：TNF-α受體缺失小鼠麻醉后于TMJ關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射CFA，稱為一次打擊。三周之后麻醉小鼠，將聚乙烯管插入結(jié)腸內(nèi)，再通過注射器注入芥子油，稱為二次打擊。行為學(xué)反應(yīng)測定結(jié)果表明CFA誘導(dǎo)的實驗動物單側(cè)頭部抽離閾值顯著降低，在注射后第一天降低幅度達到最大，提示動物可能對機械刺激更加敏感，在第五天恢復(fù)至基線水平。而熱平板實驗結(jié)果在野生型和突變型小鼠之間沒有差異。細胞因子檢測結(jié)果顯示促炎因子在CFA刺激后明顯增加，尤其是在誘導(dǎo)后的第14天，例如TNF-α、CCL5、CXCL9、CCL2、CXCL10等，提示組織可能處于急性炎癥期。CFA誘導(dǎo)的小鼠對福爾馬林注射入唇引起的急性炎癥反應(yīng)程度更加劇烈，表明二者可能存在協(xié)同作用。筆者認為CFA是目前動物實驗常用的免疫誘導(dǎo)制劑，可以使抗原持續(xù)釋放，同時又能非特異性地誘導(dǎo)機體的免疫性應(yīng)答，一般多用于誘導(dǎo)實驗動物的初次免疫。但注射CFA而導(dǎo)致的局部組織炎癥、肉芽腫性改變，是否會對實驗產(chǎn)生不良影響，目前仍需要驗證。且CFA誘導(dǎo)制劑起效快，失效也快，不適合進行短期暴露。同時利用CFA的大多數(shù)動物模型都集中在小型嚙齒動物上，因此在大型動物模型中將需要更多的研究，以確保結(jié)果的普適性。

1.2 卵蛋白誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthriti，RA)是一種自身免疫性疾病，可累及手足小關(guān)節(jié)和顳下頜關(guān)節(jié)，同時伴有全身的其他表現(xiàn)。血管生成是其發(fā)病機制的重要組成部分，血管生成可以促進局部炎癥細胞遷移和疼痛受體的增加。因此檢測血管翳生成情況是評估RA活動性及不同療法效果的重要內(nèi)容。Liu等[4]創(chuàng)建了卵蛋白誘導(dǎo)兔關(guān)節(jié)炎模型(ovalbumin induced arthritis，OIA)，使用縱向能量多普勒血流顯權(quán)像(power doppler imaging，PDI)和對比增強超聲(contrast-enhanced ultrasound，CEUS)測量來評估疾病不同階段的血管生成情況，并分析測量值與血管生成的不同病理指標之間的相關(guān)性。具體模型建立方法如下：雄性新西蘭大白兔作為實驗組注射雞蛋清的白蛋白和CFA的混合液，對照組接受等量生理鹽水注射。16周后，使用超聲(ultrasoun，US)作為常規(guī)評估手段，超聲引導(dǎo)下對OIA兔膝關(guān)節(jié)滑膜進行活檢，免疫組化檢測CD31和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達。結(jié)果顯示：第6～12周，OIA兔的滑膜中CD31和VEGF表達增加，同時其表達量與能量多普勒圖像分級、CEUS分級和峰值強度呈顯著正相關(guān)。將功率多普勒圖像等級、CEUS等級和峰值強度，尤其是CD31表達量結(jié)合時，準確地表明了RA兔模型中滑膜血管化的程度。筆者認為新西蘭大白兔體型較大、體質(zhì)結(jié)實、成熟早、生長快，由于其耳大、皮膚白色和血管清晰等特點，是一種用于研究RA疾病的理想動物。同時該動物模型成功模擬了人類RA的疾病進程，實驗兔在第6～8周出現(xiàn)早期疾病表現(xiàn)(炎癥)，在第8～12周出現(xiàn)中期疾病表現(xiàn)(血管翳形成)，在第12～16周出現(xiàn)晚期疾病表現(xiàn)(纖維化)，為學(xué)者了解RA的發(fā)病機制打下了深厚的實驗基礎(chǔ)，同時有利于學(xué)者更好地對RA病情進行評估。但目前由種屬差異、飼養(yǎng)環(huán)境不同帶來的實驗結(jié)果的差異仍然是一個急需解決的問題。

1.3 膠原酶、膠原抗體誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)的治療藥物選擇十分有限，需要替代治療。大量臨床數(shù)據(jù)表明，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)可能是人類OA的治療靶點。Lee等[5]通過構(gòu)建膠原酶誘導(dǎo)性骨關(guān)節(jié)炎模型(collagenase induced arthritis model，CIOA)，在大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Ⅱ型膠原酶對照組注射生理鹽水，在CIOA誘導(dǎo)成功后，腹腔注射GM-CSF單克隆抗體，第23天出現(xiàn)了持續(xù)性疼痛，組織學(xué)檢測證明該組出現(xiàn)了明顯的軟骨損傷。半月板損傷是膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展的危險因素之一，但聚焦在半月板損傷上的動物模型卻鮮有報道，在CIOA模型中，還沒有關(guān)于半月板退行性變的研究。在這種模型中，高純度的膠原酶被注入關(guān)節(jié)內(nèi)，損傷了關(guān)節(jié)韌帶，導(dǎo)致關(guān)節(jié)不穩(wěn)定。Utomo等[6]構(gòu)建了這種CIOA模型，C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射膠原酶誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎。分別于1 d、3 d、7 d、14 d、28 d、56 d處死小鼠，取膝關(guān)節(jié)進行組織學(xué)分析。取16周齡未誘發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎的小鼠膝關(guān)節(jié)作為對照。經(jīng)硫胺染色切片評估半月板損傷、半月板脫出和關(guān)節(jié)軟骨損傷。結(jié)果表明半月板損傷與關(guān)節(jié)軟骨損傷發(fā)生在同一時間，半月板退行性變發(fā)展主要依靠對表面結(jié)構(gòu)、細胞密度和基質(zhì)染色的評估，從第14天開始，這三個參數(shù)與對照組相比都有隨時間增加的趨勢，CIOA組膝關(guān)節(jié)的半月板損傷和關(guān)節(jié)軟骨損傷呈中度相關(guān)。這些結(jié)果表明CIOA模型是研究半月板損傷與OA進展相關(guān)性的作用的重要模型，并可以為OA治療方法研究奠定基礎(chǔ)。Matsuo等[7]以C57/BL小鼠為實驗動物，通過皮下注射膠原單克隆抗體合劑構(gòu)建的實驗鼠被稱為膠原抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型(collagen antibody induced arthritis model，CAIA)，然后進行Col1a2-GFP小鼠的骨髓移植。Col1a2-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠在傷口愈合過程中及肝纖維化、肺纖維化和脂肪組織纖維化模型中出現(xiàn)的成纖維細胞，可以產(chǎn)生Ⅰ型膠原纖維并表達GFP，被稱為GFP陽性細胞。膠原抗體注射后(第0天)，GFP細胞數(shù)量在第5～8天達到頂峰，之后10 d內(nèi)持續(xù)升高，然后逐漸下降。同時發(fā)現(xiàn)CAIA小鼠組織中出現(xiàn)大量的的GFP細胞。同時還發(fā)現(xiàn)所有的GFP陽性細胞均表達成纖維細胞所有的標志蛋白，因此認為小鼠體內(nèi)的GFP細胞均為成纖維細胞。筆者認為CAIA、CIOA模型操作簡單、損傷可控和可重復(fù)性高,但至少四周后才能出現(xiàn)OA樣病變，耗時較長；Matsuo等[7]構(gòu)建的CAIA動物模型對于RA的病理學(xué)研究上意義非凡，但對于RA(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)動物的行為學(xué)表現(xiàn)、細胞學(xué)以及免疫學(xué)水平的研究卻沒有涉獵。

1.4 血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)Shen等[8]以48只10～12周齡的SD大鼠為實驗對象，分為VEGF注射組、生理鹽水注射組、空白對照組，每組各16只，分別在1、2、4、8周取材，每次取四只，HE染色觀察發(fā)現(xiàn)與其他兩組相比，VEGF注射組髁突軟骨肥大層厚度明顯變薄，且隨時間延長，厚度進一步降低；在第4周、第8周，髁突軟骨層出現(xiàn)空泡性變、變性等病理學(xué)改變；軟骨細胞多糖含量明顯降低，軟骨細胞排列逐漸變得紊亂；從第2周開始，VEGF組Mankin評分(學(xué)術(shù)界公認的對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變程度進行評價的通用標準)明顯高于其他兩組，提示該組退行性病變更加明顯。此外Micro-CT顯示VEGF組出現(xiàn)了軟骨下骨的骨性病變、局部硬化，同時骨小梁數(shù)量和骨小梁排列明顯高于其他組。免疫組化分析顯示：VEGF組MMP-9、MMP-13明顯高于其他組，且Tunel陽性細胞數(shù)明顯多于其他組。實驗證實VEGF可能通過VEGF2受體上調(diào)軟骨細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和MMP-13的表達，導(dǎo)致軟骨細胞凋亡，從而導(dǎo)致軟骨退變，該模型可以用來探討顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(temporal mandibular joint osteoarthritis，TMJ-OA)的分子機制。筆者認為大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射VEGF的確可以使大鼠變現(xiàn)出OA的基本病理變化：軟骨退變、軟骨下骨吸收，為探討TMJ-OA發(fā)病的分子學(xué)機制建立了一個成功的動物模型。但誘導(dǎo)周期為56 d，相對較長。且在軟骨生長過程中，VEGF在滑膜細胞和軟骨細胞中表達，VEGF及其受體均在淺表軟骨細胞層中被檢測到，如何排除內(nèi)源性VEGF的干擾也是該模型急需解決的問題。

1.5 木瓜蛋白酶/單碘酸鹽(monoiodate，MIA)Guzman等[9]以雄性Wistar大鼠為實驗對象，將單碘酸鹽注入大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)，分別在注射后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d和56 d處死取樣。在MIA注射后第1天，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)脛骨平臺區(qū)域出現(xiàn)大范圍的軟骨細胞變性，并伴有輕度到中度的淋巴細胞、巨噬細胞和漿細胞浸潤；在第7天可觀察到破骨細胞數(shù)量增加，受損壞死的軟骨細胞和軟骨下骨連接在一起；在第14天梭形細胞取代了原有的軟骨下骨髓，并與正常的骨小梁，骨髓細胞之間界限清楚；在第28天，出現(xiàn)多灶性骨小梁塌陷和碎裂，碎裂骨被大量破骨細胞包圍，偶可見軟骨下硬化區(qū)域。Cledes等[10]以雄性新西蘭大白兔為實驗對象，關(guān)節(jié)下腔單碘乙酸鈉溶液，分別在10 d、20 d、30 d、40 d麻醉后處死取材。實驗結(jié)果如下：(1)髁突軟骨和軟骨下骨改變：在第10天，實驗組病變主要集中在關(guān)節(jié)的前部和中央?yún)^(qū)，損傷區(qū)軟骨細胞增厚，軟骨下骨出現(xiàn)薄薄的結(jié)膜凹陷，骨軟骨連接的完整性被破壞，髁突軟骨的4層典型結(jié)構(gòu)消失；在第20天軟骨變薄，在關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)被纖維組織替代，軟骨下骨出現(xiàn)吸收；而在30 d時，軟骨完全被纖維組織替代；40 d時，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有一大片無軟骨的損傷區(qū)，軟骨下骨外露，其肥厚層(下層纖維軟骨層)顯露出來。觀察可以發(fā)現(xiàn)軟骨細胞形成一條粗大的連續(xù)線，清楚地將小的骨缺損與軟骨下骨分開。40 d時，關(guān)節(jié)間盤發(fā)生穿孔，并在雙板區(qū)層顯示骨化過程。(2)滑膜變化：MIA注射組兔的關(guān)節(jié)滑膜均出現(xiàn)纖維化、增生，前、后隱窩絨毛發(fā)育一系列病理變化。Molinet等[11]向雄性新西蘭大白兔分別注射MIA、木瓜蛋白酶作為實驗組，在實驗開始的第15天、第30天、第45天麻醉后處死取材。實驗結(jié)果如下：(1)MIA誘導(dǎo)組：髁突表面發(fā)生變形，軟骨細胞稀少，髁突形態(tài)和軟骨細胞細胞膜消失，甚至出現(xiàn)空斑。在45 d時，MIA組所有變量的平均值的增加比對照組更明顯。(2)木瓜蛋白酶誘導(dǎo)組：髁突關(guān)節(jié)面不規(guī)則，細胞外基質(zhì)明顯增多，中層軟骨細胞排列紊亂，深層軟骨細胞增生。關(guān)節(jié)囊變薄，中層軟骨細胞呈孤立排列，髁突和關(guān)節(jié)盤之間的關(guān)節(jié)間隙明顯縮小。(3)關(guān)節(jié)盤改變：30 d時仍有周邊撕裂，軟骨細胞數(shù)量較少，外緣不規(guī)則，但關(guān)節(jié)盤形態(tài)仍可保持但中部出現(xiàn)穿孔，邊緣軟骨細胞稀少。在木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的TMJ-OA中觀察到關(guān)節(jié)盤有撕裂的跡象，但其中仍可見軟骨細胞。筆者認為Guzman等[9]在關(guān)節(jié)內(nèi)注射MIA可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨的丟失，并導(dǎo)致類似OA的軟骨下骨病變的進展。提供了一種快速和微創(chuàng)的方法，在嚙齒類動物中復(fù)制OA樣病變，結(jié)果可靠、造模方便。Cledes等[10]選擇雄性動物作為實驗對象，有效地規(guī)避了雌激素對于骨、軟骨代謝的影響，且MIA注射僅在關(guān)節(jié)下腔進行，以獲得退變過程的平穩(wěn)進展，并符合人類臨床上主要涉及髁突軟骨的病理發(fā)展。MIA在第30天便可誘導(dǎo)動物出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎晚期表現(xiàn)，這與其他造模方法相比，誘導(dǎo)速度更快，這可能與MIA對軟骨細胞的直接作用有關(guān)，比機械應(yīng)力單獨引起的代謝變化更快。此外用化學(xué)誘導(dǎo)觀察到的變化不僅與退變過程一致，而且與軟骨損傷修復(fù)過程相吻合的。因此，所有關(guān)節(jié)的缺損周圍都有肥大的軟骨反應(yīng)，與骨關(guān)節(jié)炎的初始和修復(fù)階段一致(軟骨細胞增殖，新陳代謝增強，軟骨增厚)。但對于OA樣表現(xiàn)動物的觀察方法過于局限，基于現(xiàn)代免疫學(xué)發(fā)展基礎(chǔ)上的免疫組化染色以及Micro-CT觀察或可以得到更為翔實的實驗結(jié)果。

1.6 雌二醇誘導(dǎo)瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid-1，TRPVl)是一種非選擇性的陽離子通道，最初被鑒定為辣椒素受體，主要表達于外周神經(jīng)系統(tǒng)，不僅在滑膜內(nèi)分布的神經(jīng)和血管中表達，而且在大鼠和人顳下頜關(guān)節(jié)的滑膜襯里細胞中也有表達，在辣椒素、酸、熱、內(nèi)源性配體等疼痛性刺激的檢測中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。TRPV1的表達和致敏受神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)的調(diào)控。在感覺神經(jīng)元中，TRPV1的激活會誘導(dǎo)炎癥神經(jīng)肽的釋放，從而引起神經(jīng)源性炎癥和疼痛[13]。Wu等[14]以SD大鼠為實驗對象，將大鼠隨機分為5組，假手術(shù)組以及4組卵巢切除鼠(ovariectomize，OVX)，分別接受劑量為0、20 mg、80 mg或200 mg的雌二醇(estradiol，E2)，連續(xù)注射12 d，去卵巢大鼠接受上述劑量的雌二醇后，血漿可產(chǎn)生不同水平的雌二醇，假手術(shù)大鼠皮下注射等量的玉米油，并最后取顳下頜關(guān)節(jié)作為標本。Western blot結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，卵巢切除鼠雌二醇以劑量依賴性模式上調(diào)TRVP1的表達。之后體外提取原代滑膜細胞，使用雌二醇和LPS(脂多糖)處理滑膜細胞。結(jié)果表明雌二醇和LPS均能上調(diào)滑膜細胞TRPV1轉(zhuǎn)錄，單獨應(yīng)用NGF的誘導(dǎo)作用更顯著，抗NGF血清預(yù)處理可以完全阻斷了雌二醇和LPS聯(lián)合治療產(chǎn)生的TRPV1的誘導(dǎo)。同時進行的TRVP1激動劑處理滑膜細胞實驗表明：TRVP1可以上調(diào)COX-2 mRNA(cyclooxygenase，COX，環(huán)氧化物酶)水平。以上結(jié)果表明：雌二醇很可能是通過痛覺相關(guān)基因(TRVP1)來參與TMJ炎癥或疼痛的形成機制，這有利于頜面外科醫(yī)生理解TMD患者疼痛發(fā)生的性別差異。Jie等[15]采用與Wu等[14]相同的造模方式，然后使用谷氨酸構(gòu)建咬肌疼痛模型。結(jié)果表明：與對照組相比，谷氨酸可以顯著降低頭部撤離閾值，且降低程度與濃度呈正相關(guān)，且雌二醇劑量依賴性加重了谷氨酸誘導(dǎo)的頭部撤離閾值的降低，增強谷氨酸誘導(dǎo)的咬肌傷害性反應(yīng)。筆者認為過量激素使用會對大鼠短時間造成不可逆的損害，具體的雌二醇劑量如何把控，目前仍需詳加研究。且大鼠飲食的是否含有豆類等可能會使內(nèi)源性膽固醇升高的食物，實驗中并未詳細說明。Jie等[15]在實驗過程中，為確定動物咬肌注射谷氨酸的適宜濃度，根據(jù)谷氨酸濃度效應(yīng)數(shù)據(jù)計算半最大效應(yīng)濃度(concentration for 50%of maximal effect，EC50)，這樣可以確定最適宜的濃度，以便在保證最佳實驗結(jié)果的前提下，盡量減少對動物的損害，符合愛護實驗動物的基本原則。

1.7 卡拉膠誘導(dǎo)P2X受體是由細胞外ATP激活的配體門控離子通道家族，在傷害感受中起作用。功能性P2X受體在大鼠的一些感覺傳入神經(jīng)上表達，在炎癥介質(zhì)存在下，P2X受體介導(dǎo)的傷害性反應(yīng)也會增強[16]。為了探討內(nèi)源性三磷酸腺苷在顳下頜關(guān)節(jié)痛性致敏中的作用，Oliveira等[17]構(gòu)建了卡拉膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型，分別給予P2X受體激動劑、P2X受體拮抗劑，觀察其對卡拉膠誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)炎性痛敏的影響。實驗結(jié)果表明與對照組相比，卡拉膠預(yù)處理后，5-羥色胺可以顯著增強誘導(dǎo)產(chǎn)生的傷害反應(yīng)，而在應(yīng)用P2X受體拮抗劑后，該誘導(dǎo)作用顯著降低，P2受體拮抗劑與卡拉膠合用可劑量依賴性地降低卡拉膠引起的TMJ痛敏反應(yīng)。顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病受到生物介質(zhì)、社會心理、機械運動、外周和中樞的痛覺信號、關(guān)節(jié)的使用頻率和強度的影響，但對于這些因素之間的相互作用卻知之甚少。而TMD的誘發(fā)因素包括兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)基因多態(tài)性及其報道與疼痛耐受性相關(guān)的改變、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的改變。當其中一個因素與頜骨負荷過載等觸發(fā)因素結(jié)合時，就會產(chǎn)生持久性或長期的TM系統(tǒng)敏化[18]。因此為了研究始發(fā)因素和各種誘導(dǎo)因素對TMD的致病作用及它們之間的相互作用，Phero等[19]研發(fā)了一種咬合功能相關(guān)疼痛測試儀，適用于卡拉膠誘導(dǎo)的咬合功能障礙大鼠，使其分別在感染、無感染、COMT抑制劑處理條件下，評估大張口對于咀嚼功能的影響。測試結(jié)果表明：卡拉膠注射后動物長咀嚼時間小幅度增加，而在經(jīng)地塞米松處理后，該誘導(dǎo)作用被削弱了，此外由卡拉膠引起的強烈炎癥可以增強大張口對咀嚼功能的影響，從而導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)功能障礙，這表明局部炎癥與大張口運動對于誘發(fā)TMD存在協(xié)同作用。據(jù)報道，沒有TMD病史的受試者很快便能適應(yīng)實驗咬合干擾，而有TMD病史的受試者(尤其是有口腔頜面部疼痛史的受試者)臨床癥狀則明顯增加[20]。為了探究先前的疼痛經(jīng)歷是否會加劇咬合干擾引起的咀嚼肌痛覺過敏。Ding等[21]開發(fā)了一種兩次交叉注射卡拉膠建立炎癥性痛覺記憶模型，使用金屬絲抬高咬合，觀察大鼠痛覺過敏相關(guān)行為。結(jié)果表明：第一次注射卡拉膠后第5天，右咬肌(注射側(cè))的頭部撤離閾值明顯降低，在咬合抬高0.4 mm后，頭部撤離閾值降低程度更為明顯，而注射生理鹽水組在抬高咬合后，頭部撤離閾值無明顯變化，結(jié)果表明疼痛記憶可以增強咬合干擾引起的咬肌痛覺過敏。且在拆除頜面金屬絲、恢復(fù)咬合后，卡拉膠注射組較生理鹽水注射組頭部撤離閾值恢復(fù)至正常水平時間明顯延長，根據(jù)以上結(jié)果，初步認為炎性疼痛記憶促進了咬合干擾誘發(fā)的咬肌疼痛。筆者認為：(1)卡拉膠注射為探討炎癥介質(zhì)釋放的時程及抗炎藥物對炎癥介質(zhì)釋放的調(diào)控提供了一種重復(fù)性好、結(jié)果可靠的方法，但Phero等[19]進行的實驗，研究的誘發(fā)因素較多，如何設(shè)置好各相關(guān)因素之間的對照實驗，以及如何設(shè)計聯(lián)合多因素干預(yù)實驗，從而獲得可信的結(jié)果仍是一個不小的挑戰(zhàn)。(2)Ding等[21]以SD大鼠為基礎(chǔ)建立的實驗動物模型存在一些缺點，大鼠口腔小，操作困難，且嚙齒類動物均存在夜磨牙習(xí)慣，因此難以建立相對穩(wěn)定的創(chuàng)傷咬合關(guān)系。豬、猴、犬等體積相對較大的動物，操作起來更為方便，且咀嚼習(xí)慣、食性、TMJ解剖關(guān)系、組織結(jié)構(gòu)等與人體更為相似，更加適合作為咬合紊亂的動物模型，但相對來說，上述動物更加難以獲取，價格較為昂貴。

1.8 福爾馬林誘導(dǎo)福爾馬林作為一種傷害性刺激，最早應(yīng)用于疼痛相關(guān)研究的動物實驗。最早在1987年有學(xué)者曾以福爾馬林為誘導(dǎo)劑，注射入大鼠爪內(nèi)，大鼠產(chǎn)生了雙向傷害性反應(yīng)，嗎啡、哌替啶可以緩解實驗所帶來的痛苦[22]；之后，Shibata等[23]又使用福爾馬林作為誘導(dǎo)劑，廣泛應(yīng)用于動物電生理實驗，從而使實驗動物再現(xiàn)損傷后疼痛的基本特征。Roveroni等[24]將不同濃度的福爾馬林注入大鼠TMJ區(qū)域以創(chuàng)建TMJ實驗性疼痛模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度高于1.5%以上的福爾馬林誘導(dǎo)45 min后，其導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生的行為反應(yīng)(包括頭部回縮和口面部摩擦)更加劇烈，類似于卡拉膠誘導(dǎo)的行為反應(yīng)。在該模型中，通過測量行為傷害性反應(yīng)來評估TMJ痛敏反應(yīng)的劇烈程度，例如摩擦口頜面部區(qū)域并甩頭。15d-PGJ2中文名稱為環(huán)戊烯同類前列腺素，是一種過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)配體，一旦其被激活，可引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)，增強免疫調(diào)劑作用以及神經(jīng)保護作用，Abdalla等[25]已經(jīng)通過相關(guān)實驗：將15d-PGJ2(利用納米技術(shù)封裝15d-PGJ2，從而降低其有效劑量并提高其利用度而制成的膠束系統(tǒng))直接注射入TMJ，可以刺激PPAR-γ，從而發(fā)揮潛在的抗炎作用。為了評估了PL-15dPGJ2膠束系統(tǒng)在福爾馬林誘導(dǎo)的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)急性疼痛模型中的治療效能，Abdalla等[25]將PL-15dPGJ2注射入大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)，再使用福爾馬林誘導(dǎo)，觀察大鼠的行為學(xué)反應(yīng)，并在誘導(dǎo)后的第1、2、3、7、10、14天處死大鼠，取顳下頜關(guān)節(jié)組織行相關(guān)檢查。結(jié)果表明PL-15dPGJ2預(yù)處理可以顯著降低福爾馬林誘導(dǎo)所產(chǎn)生的大鼠傷害性行為反應(yīng)，且PL-15dPGJ2預(yù)處理后可以降低血液外滲和白細胞遷移，維持效果長達7 d，與此同時，PL-15dPGJ2改善了促炎細胞因子和趨化因子的蛋白質(zhì)表達水平。這些結(jié)果提示PL-15d-PGJ2制劑具有確切的抗傷害感受和抗炎作用，是治療顳下頜關(guān)節(jié)或其他關(guān)節(jié)疾病的炎癥性疾病的潛在選擇。筆者認為福爾馬林誘導(dǎo)大鼠作為急性疼痛模型，存在誘導(dǎo)時間短、誘導(dǎo)效果好，且可重復(fù)性高，行為學(xué)反應(yīng)可量化的優(yōu)點。但在福爾馬林誘導(dǎo)的動物學(xué)反應(yīng)中觀察發(fā)現(xiàn)，動物若表現(xiàn)出強烈的摩擦活動行為，而畏縮行為出現(xiàn)頻率就會降低，反之亦然。福爾馬林誘導(dǎo)的摩擦和退縮反應(yīng)僅在濃度高于0.5%時出現(xiàn)，且在濃度為1.5%及其以上時，所誘導(dǎo)產(chǎn)生的下頜骨運動反應(yīng)并未增加，表明福爾馬林可能存在一個最適宜的誘導(dǎo)濃度。

1.9 TNF-α誘導(dǎo)TNF-α是炎癥通路中的一種重要的細胞因子，存在于RA患者的滑膜、滑液及血清中。TNF-α通過與多種組織因子和基質(zhì)蛋白相互作用促進RA的炎癥反應(yīng)、滑膜細胞異常增殖和凋亡、血管翳生成及軟骨與骨的破壞，推動RA炎癥反應(yīng)持續(xù)性進展[26]。Ruscitto等[27]選用8周齡C57BL/6小鼠作為實驗鼠，顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射重組TNF-α，對照組注射等量生理鹽水，處死后進行相關(guān)檢測。結(jié)果表明：TNF-α誘導(dǎo)組大鼠出現(xiàn)了急性炎癥，Adamts5(血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶-5)、IL1-β表達量上調(diào)及細胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)換增加。實驗結(jié)果表明：TNF-α是RA發(fā)生發(fā)展的重要推動和維持因素，因而進一步研究TNF-TNFRs在RA中作用機制和特點以及尋求針對TNF-TNFRs更加有效的治療方法和藥物是十分必要的。筆者認為RA患者血清中存在較高水平的TNF-α及其可溶性受體，且有研究證實TNF-α與類風(fēng)濕因子滴度、C-反應(yīng)蛋白呈正相關(guān)關(guān)系。因此筆者認為TNF-α不僅可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生TMJ-RA(temporomandibular joint rheumatoidarthritis，TMJ-RA)，而且其本身也是RA的重要檢測指標之一，因此如何排除內(nèi)源性TNF-α對誘導(dǎo)實驗的干擾是必須需要考慮的。

1.10 白蛋白誘導(dǎo)環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acid，EETs)是一種內(nèi)源性抗炎化合物，可以減輕炎癥，并具有鎮(zhèn)痛、抗纖維化和降壓作用。而可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolas，sEH)的活性作為EETs生物利用度的主要決定因素之一，可將EETs迅速轉(zhuǎn)化為活性較低的形式，從而降低生物效應(yīng)。抑制sEH酶已被用作降低傷害感受和炎癥的一種策略[28]。Quinteiro等[29]在Wistar大鼠背部皮下注射含有CFA的甲基化的牛血清蛋白(methylated bovine serum albumin，MBSA)乳劑，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生一種以MBSA為抗原的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH)的實驗?zāi)Ｐ?。白蛋白誘導(dǎo)的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎引起了高度傷害性反應(yīng)，白細胞聚集，促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、CINC-1(中性粒細胞趨化因子)、IL-17、IL-23和IFN-γ的表達上調(diào)。TPPU(一種sEH酶抑制劑)外周預(yù)處理可抑制關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)傷害性反應(yīng)和白細胞遷移。此外，TPPU可降低TMJ組織中促炎細胞因子的局部濃度，上調(diào)抗炎細胞因子IL-10的表達。TPPU可顯著降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，INOS)的蛋白表達，但不改變甘露糖C樣受體1(monoclonal antibody to mannose receptor C type 1，MRC1)的表達。該研究證實TPPU外周給藥可減輕顳下頜關(guān)節(jié)實驗性關(guān)節(jié)炎的過敏性痛覺和炎癥，表明抑制sEH酶可能成為減輕關(guān)節(jié)炎疼痛和炎癥病理效應(yīng)的新靶點和新策略[30]。Kato等[31]在DBA大鼠尾部注射牛Ⅱ型血清白蛋白(含有乙酸-完全弗氏佐劑)，并在21 d后進行加強免疫，同時對動物進行關(guān)節(jié)炎癥評分[32]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，實驗組TRAP(tartrate resistant acid phosphatase,抗酒石酸酸性磷酸酶)陽性細胞多核細胞、ALP(alkaline phosphatase，堿性磷酸酶)陽性細胞數(shù)量明顯增高，表面破骨細胞分化活躍同時堿性磷酸酶活性顯著提高；采用熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白相關(guān)基因如Runx2、Alph、Bglap i3表達水平均顯著降低，關(guān)節(jié)炎癥評分也從第21天到第30天持續(xù)走高；關(guān)節(jié)炎癥指標基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase，MMPS)表達上調(diào)、脾脹重量也普遍增大。而在進行OP3-4[一種類似骨保護素(OPG)的肽，OPG上有3個RANKL結(jié)合位點]注射治療后，在OP3-4劑量較高時，會降低關(guān)節(jié)炎評分。結(jié)果表明OP3-4顯著降低了CIA誘導(dǎo)的血清CTX(Ⅰ型膠原羧基端肽序列，反映機體骨代謝的重要標記物)的水平。OP3-4可以防止骨質(zhì)流失，抑制骨吸收，促進骨骼形成。筆者認為白蛋白注射誘導(dǎo)同樣時間長，且往往只能模擬TMD誘發(fā)因素的某一項，且主要聚焦在嚙齒類動物，針對其他動物的實驗研究仍需努力。

1.11 IL-1β誘導(dǎo)有研究發(fā)現(xiàn)顳下頜關(guān)節(jié)疼痛患者關(guān)節(jié)滑液中的IL-1β、IL-1RⅡ明顯高于正常值[33]，I-1β(白介素1-β)可誘導(dǎo)TMD患者中異常分子的增加，主要包括：IL-6、IL-8、RANKL(單核細胞系破骨細胞前體上表達的與RANK作用的一種跨膜蛋白)、MMP3、MMP13等[34]。IL-1β通過促進滑膜細胞和軟骨細胞的合成并釋放前列腺素E(prostaglandin E，PGE)、膠原酶和過量的MMPs，并誘導(dǎo)其釋放磷酸酶A，從而抑制蛋白多糖的合成，間接參與TMD的病因機制。Chu等[35]為了探究細胞周圍基質(zhì)(pericellular matrix，PCM)分子在顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細胞和關(guān)節(jié)盤細胞的合成代謝和分解代謝反應(yīng)中的作用，在促炎分子IL-1β誘導(dǎo)前先用PCM分子預(yù)處理細胞以刺激骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生。結(jié)果表明IL-1β處理后，與基質(zhì)降解相關(guān)的基因如：MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS均表達上調(diào)，而軟骨基質(zhì)基因如：ACAN、COL-1、COMP均表達下調(diào)。這些結(jié)果表明IL-1β的確可以誘導(dǎo)TMJ-OA模型產(chǎn)生。筆者認為TMJ-OA炎癥反應(yīng)過程中，IL-1β是主要的促炎細胞因子，它可以刺激軟骨細胞釋放炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致組織損傷并促進MMPs的產(chǎn)生。IL-1β可能是顳下頜關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)盤病變過程的主要促炎細胞因子，其可能在TMJ低度炎癥反應(yīng)環(huán)境中促進炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)關(guān)節(jié)盤細胞產(chǎn)生MMPs降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。因此筆者認為IL-1β具有誘導(dǎo)效能高、誘導(dǎo)時間短等優(yōu)點。但IL-1β與IL-1α之間還存在交互作用，具體在誘導(dǎo)過程中兩者之間是否互為干擾，目前尚未可知。針對于細胞實驗，IL-1β已經(jīng)有了確切的濃度和誘導(dǎo)效能、但使用IL-β誘導(dǎo)動物產(chǎn)生TMJ-OA的實驗?zāi)壳氨容^少，聚焦于實驗動物的誘導(dǎo)效果，IL-β的表現(xiàn)值得期待。

2 不同機械刺激誘導(dǎo)方法及其評價

2.1 單側(cè)夾板固定誘導(dǎo)支持下頜運動是顳下頜關(guān)節(jié)的主要作用之一，而小型動物顳下頜關(guān)節(jié)的機械特性難以確定，為了確定兔的解剖結(jié)構(gòu)和生理特性、行為學(xué)特征是否可作為TMD實驗動物，Henderson等[36]以新西蘭大白兔為實驗對象，通過牙科酸蝕劑加光固化樹脂將1 mm厚的金屬夾板固定在右側(cè)上下頜磨牙上，6周后處死取材。C-Fos免疫組織化學(xué)(IHC)檢測Fos陽性神經(jīng)元數(shù)量(Fos-LI，以下簡稱Fos陽性神經(jīng)元)可作為傷害性活動的一種量度。番素-O固綠染色觀察纖維軟骨細胞的分布和形狀，結(jié)果顯示夾板組兔子(以下簡稱夾板兔)行為學(xué)反應(yīng)程度弱于對照組，夾板兔組中觀察到了更多的Fos陽性神經(jīng)元，夾板兔組組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)沿著髁突前后徑長軸，糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAGs)的分布中斷，不能覆蓋整個前后徑長度。TMJ上組織的機械探測的敏感性增加、三叉神經(jīng)尾亞核中Fos陽性神經(jīng)元的增加以及TMJ傳入神經(jīng)的興奮性增加。機械超敏反應(yīng)表現(xiàn)中觀察到的變化可能是兔模型的一個重要特征，增加了其與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性。筆者認為本實驗采用兔為實驗動物，是因為兔顳下頜關(guān)節(jié)具有與人類相似的側(cè)向和前后向運動，而且經(jīng)實驗誘導(dǎo)產(chǎn)生的病理改變與人類TMD的病理改變相似，該動物模型是研究人類TMD的理想實驗動物模型。本實驗用金屬夾板加光固化樹脂的方法，造成兔局部咬合抬高的咬合紊亂動物模型，克服了磨耗等因素造成干擾減弱對實驗結(jié)果帶來的影響。

2.2 頜面金屬絲抬高咬合誘導(dǎo)El-Hakim等[37]發(fā)現(xiàn)糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)是免疫球蛋白超家族的細胞表面受體，在多種細胞類型中表達。研究已經(jīng)將RAGE定義為一種模式識別受體，其結(jié)合內(nèi)源性S100/鈣粒蛋白，淀粉樣蛋白β肽和HMGB-1(或兩性霉素)，通過激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響特定的基因表達。具體而言，許多促炎反應(yīng)，例如由蛋白激酸磷酸酶(mitogen activited protein kinase，MAPK)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、活性氧和TNF、IL-1、TGF-β(transforming growth factor-β，轉(zhuǎn)化生長因子-β)等其他促炎介質(zhì)協(xié)調(diào)的炎癥反應(yīng)是由RAGE-配體相互作用引起的。為了研究非侵入性方法構(gòu)建的TMJ-OA動物模型是否有效，以及RAGE在TMJ-OA發(fā)生發(fā)展中的作用。Matias等[38]以C57BL小鼠為實驗對象，使用牙科樹脂加黏結(jié)劑將1.2 mm厚、2.5 mm長的“U”形金屬絲固定在第一臼齒上，U形開口朝向遠中，確認金屬絲無移位后，在第2、4、6、8周處死小鼠取材。組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)：咬合抬高組小鼠(以下簡稱實驗鼠)軟骨顯示出表面顫動，實驗鼠Mankin評分遠高于對照組，差距具有統(tǒng)計學(xué)意義，免疫組化染色結(jié)果顯示：實驗鼠MMP13、TGF-β1、絲氨酸肽酶1(htra serine peptidase 1，HtrA1)遠高于對照組。筆者認為由于錯合模型的機械發(fā)病機制類似于人類OA的發(fā)病過程，所以這種模型是探討TMJ-OA的發(fā)病機制和治療方法的理想選擇。此外該模型還具有造價低、高度可重復(fù)、非侵入性等優(yōu)點。盡管咬合抬高可以誘導(dǎo)動物發(fā)展為早期顳下頜關(guān)節(jié)OA，但這并不能模仿人類疾病的自然發(fā)作和進展，若能創(chuàng)建一種錯頜畸形小鼠模型，以更自然的方式誘導(dǎo)發(fā)生TMJ-OA，以更好地模擬人類疾病的進展，這將是一個全新選擇。

2.3 錯合障礙實驗?zāi)Ｐ蚃iao等[39]通過正畸方法設(shè)計了錯頜畸形，稱為錯合障礙實驗?zāi)Ｐ?experimentally created disordered occlusion，ECDO)。以SD大鼠為實驗對象，將直徑約1 mm的彈性橡皮筋插入左上頜第一和第二磨牙之間以及右下頜第一和第二磨牙之間。這樣，第一磨牙在橡皮筋的彈力作用下向內(nèi)側(cè)移動。一周后，將橡皮筋更換為自固化樹脂以保持間隙直到實驗結(jié)束。初次操作后4周，咬合紊亂程度進一步加重，使用相同的方法向遠中推動左上第三磨牙和右下第三磨牙。在此手術(shù)后的第8周和第12周，可以觀察到明顯的骨髓性骨質(zhì)損失伴隨著髁突軟骨降解，隨后軟骨細胞的凋亡增加，并發(fā)現(xiàn)其與性別有關(guān)并隨時間進行性發(fā)展，并且伴隨著OA樣病變。此外，在發(fā)生降解的關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)了具有增強的吞噬活性的CD163+(清除劑受體半胱氨酸的超家族的富含超家族成員)軟骨細胞數(shù)量增加，這提供了一種治療TMJ-OA的新策略。筆者認為該模型較好地復(fù)刻了人類TMJ-OA進程中軟骨改變、促炎因子分泌增加、組織學(xué)表現(xiàn)，因此可作為研究TMJ-OA的合適模型。然而，Jiao等[39]的實驗結(jié)果表明：OA的發(fā)生發(fā)展可能與性別相關(guān)，但并沒有給出具體的理由，且該種造模時間最長達12周，同時由于大鼠和人類之間的咬合障礙類型和TMJ結(jié)構(gòu)的明顯差異，這種OA樣病變不能完全與人類TMJ-OA相等。

2.4 單側(cè)前牙反合模型Wang等[40]以SD大鼠為實驗對象，將一根金屬管(長約2.5 mm，直徑3 mm)黏結(jié)在大鼠上前牙上，另一金屬管(長約4.5 mm，寬約3.5 mm)黏結(jié)在下前牙上，用力彎曲使金屬管唇傾135°，使用水門汀固定，構(gòu)建了單側(cè)前牙反模型(unilateral anterior crossbite，UAC)。在第3天、1周、2周后處死取材，對實驗組和對照組大鼠均進行組織學(xué)觀察、免疫組化染色、軟骨厚度測量和圖像分析、熒光定量RT-PCR。實驗組中誘導(dǎo)了髁突軟骨中細胞和局部無細胞區(qū)域的不規(guī)則排列。觀察到軟骨細胞的數(shù)量和大小減少，軟骨肥厚層厚度減小；增殖細胞核抗原抗體(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、COLⅡ(typeⅡcollagen，Ⅱ型膠原蛋白)、AGG(aggrecan,蛋白聚集多糖)和TIMP-1(tissue inhibitors of metalloproteinase 1，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1)的mRNA表達水平也有所下降；在不同時間點，MMP3、MMP9和MMP13的mRNA表達水平也有所增加。實驗結(jié)果表明UAC模型可誘導(dǎo)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨退化。咬合調(diào)整對于實現(xiàn)最佳的牙齒咬合和咀嚼功能是必要的[41]，實驗性錯合模型對于誘導(dǎo)咀嚼肌變化的分子學(xué)機制研究，至今鮮有報道。Zhang等[42]以與Wang等[40]相同的造模方法，不同的是，Zhang等[42]主要研究UAC對于提下頜肌-咬肌、降下頜肌-翼外肌的影響。在同樣的時間節(jié)點處死動物后取材，測量咬肌、比目魚肌、翼外肌、趾長屈肌的重量指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3 d～2周內(nèi)，UAC組大鼠與對照組相比，各肌肉的重量均無差異。與對照組相比：(1)UAC組αB-crystallin(αB-晶狀體蛋白，一種熱休克蛋白，可阻止應(yīng)激條件下蛋白質(zhì)聚集，小鼠比目魚肌再加載損傷可促進其表達)由于UAC裝置的存在其表達下調(diào)，在拆除UAC裝置后，表達轉(zhuǎn)而上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；(2)UAC組Desmin(結(jié)蛋白，一種中間絲蛋白，在受傷的骨骼肌纖維中含量增加，受損的肌肉組織被炎癥細胞去除，表明肌肉受傷后正在迅速修復(fù))表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在拆除誘導(dǎo)裝置后也無明顯變化。炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為UAC組炎癥細胞的浸潤和TNF-αmRNA表達的增加及纖維化反應(yīng)，表現(xiàn)為Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的mRNA表達增加。這些反應(yīng)因拆除誘導(dǎo)裝置而部分恢復(fù)。Liu等[43]為了驗證UAC誘導(dǎo)的焦慮和相關(guān)行為，神經(jīng)生理學(xué)和生化變化并探究咬合異常和焦慮之間的神經(jīng)傳導(dǎo)通路，采取了與Wang等[40]一樣的UAC造模方式。造模后UAC組分別進行迷宮測試、開放場測試，使用電流和電壓鉗夾技術(shù)記UAC組和對照組LHb神經(jīng)生理特性；檢測外側(cè)韁核(lateral habenular nucleus，LHb)中囊泡型谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白2(vesicular glutamate transporter 2，VGLUT2)的表達變化，來研究UAC誘導(dǎo)對焦慮的潛在反應(yīng)；使用Western blot(蛋白印跡實驗)檢測三叉神經(jīng)中腦核(mesencephalic nucleus of trigeminal nerve，Vme)中VGLUT2蛋白水平；使用生物素標記的葡聚糖胺作為示蹤劑進行神經(jīng)元束示蹤，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。結(jié)果表明LHb神經(jīng)元活性升高，LHb神經(jīng)元中VGLUT2 mRNA上調(diào)，咬合異常和焦慮之間的神經(jīng)傳導(dǎo)通路與LHb到Vme的神經(jīng)元有關(guān)。該實驗證實了UAC可激活LHb神經(jīng)元以及牙周本體感受通路，為Vme提供興奮性輸入并使大鼠產(chǎn)生焦慮。這些發(fā)現(xiàn)為抑制LHb的活性以減弱TMD的生理和心理影響提供了依據(jù)。為了研究ERK(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2和p38在口面部痛覺過敏中三叉神經(jīng)亞核(Vc)中的作用以及Vc內(nèi)不同細胞中p-ERK1/2和p-p38(磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38抗體)之間的關(guān)系，Jing等[44]采用了Wang等[40]一樣的UAC模型，不同的是在建模前將p-p38抑制劑和ERK1/2抑制劑注射入大鼠體內(nèi)，后在不同時間段測定壓力疼痛閾值(pressure pain threshold，PPT)。并通過免疫熒光、Western blot檢測ERK1/2和p38的表達。結(jié)果顯示：從第1天到第7天，UAC模型誘發(fā)了頜面部痛覺過敏，PPT值在第3天達到峰值。在此期間，ERK1/2在同側(cè)Vc中被激活，表達量在第1天達到峰值。p-p38也在同側(cè)被激活，表達量在第3天上達到峰值。ERK1/2在神經(jīng)元中的表達最多，在小膠質(zhì)細胞中也觀察到表達，但表達量較少，而p-p38在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞中的表達幾乎相等。U0126(ERK1/2抑制劑)預(yù)處理抑制了ERK1/2和p-p38的表達，并抑制了UAC誘導(dǎo)的痛覺過敏。p-p38抑制劑在范圍和時間方面產(chǎn)生了類似的效果。綜合起來，這些數(shù)據(jù)表明UAC通過在Vc中的神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞激活ERK1/2和p-p38來誘導(dǎo)中樞致敏，從而引起口面部痛覺過敏，從而潛在地影響ERK1/2在p-p38激活期間的作用。為了觀察和分析在TMJ-OA的發(fā)生發(fā)展過程中上機械壓力(mechanical pressure，MS)與性激素之間的相互作用，同時利用分子生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TMJ-OA病易感基因，闡明TMJ-OA發(fā)病的部分機制。Ootake等[45]以C57BL/6J小鼠為實驗對象，通過性腺切除加金屬板導(dǎo)致前牙反合的方法誘導(dǎo)TMJ-OA。小鼠切除性腺(OX組)后，通過復(fù)合樹脂將金屬板黏接在前牙舌側(cè)，使小鼠前牙咬合錯亂(MS組)，4周后處死大鼠。與對照組相比，所有實驗組的破骨細胞數(shù)量顯著增加；番紅固綠染色結(jié)果顯示：ORX(orchidectomy，睪丸切除)+MS和OVX(oophorectomy，卵巢切除)+MS組中從表面到成熟軟骨層的軟骨細胞數(shù)量減少，軟骨細胞表面不均勻；MMP-13在軟骨細胞中表達量顯著上調(diào)，與骨形成相關(guān)的Collal、Spp1和Bglap的mRNA水平顯著降低。筆者認為盡管臨床上很少出現(xiàn)單側(cè)前牙反合情況，但UAC模型卻提供了證據(jù)表明前牙反合在TMJ-OA的發(fā)展中有很大作用，并為TMD治療的研究提供了實驗基礎(chǔ)，同時Ootake等[45]創(chuàng)建的動物模型可以評估MS、性激素在TMJ-OA發(fā)生發(fā)展中的作用，還可以研究MS對于性激素在TMD-OA進程中發(fā)揮作用的影響。機械方法誘導(dǎo)的錯合動物畸形模型效果好、可重復(fù)性高、花費少，但它們的病理狀態(tài)并不能完全等同于人類。當前研究出人類和動物有關(guān)于TMD本質(zhì)上到底有多大區(qū)別仍然十分重要，這同時需要花費大量的時間研究。

2.5 結(jié)扎絲誘導(dǎo)咬合紊亂模型有研究表明TGF-β1可能在顳下頜關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎的病因?qū)W中起關(guān)鍵作用。在Zheng等[46]研究中，使用三種不同的嚙齒動物模型TMD大鼠、CED(Camurati-Engelmann，Camurati-Engelmann，卡-恩二氏病)小鼠、老年小鼠，研究TGF-β1信號傳導(dǎo)在TMJ-OA進展中的作用，進一步分析以闡明TGF-β1活性的抑制是否會減弱TMJ-OA進展。具體實驗方法如下：在第一、二磨牙之間插入直徑0.25 mm的正畸結(jié)扎絲，在上頜第一磨牙上形成結(jié)扎絲結(jié)，使TMJ承受異常的機械載荷。該模型早期誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生類OA樣改病變?nèi)缋w維軟骨層明顯減少，鈣化軟骨層變薄，軟骨退化，伴有蛋白多糖的廣泛丟失和軟骨細胞總數(shù)的減少。在顳下頜關(guān)節(jié)成分中也檢測到與年齡相關(guān)的變化，這些都是TMJ-OA患者常見的病理表現(xiàn)。TMD大鼠軟骨下骨組織中TRAP陽性細胞數(shù)明顯增加，Osterix陽性骨祖細胞數(shù)(Osterix，特殊蛋白轉(zhuǎn)錄家族成員，具有鋅指結(jié)構(gòu)，是成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在所有發(fā)育骨的成骨細胞和骨細胞中表達，是成骨細胞分化和骨形成過程中所必需的關(guān)鍵物質(zhì))明顯減少，同時伴有部分軟骨下骨丟失。μCT圖像顯示CED小鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨下骨量分布不均，提示骨形成障礙。TMD大鼠腹腔注射TGF-β受體抑制劑(TβRI)后，軟骨和軟骨下骨髓中磷酸化Smad2/3陽性細胞數(shù)顯著減少，表明TGF-β信號被有效地抑制；值得注意的是，藏紅素O染色Mankin評分和OARSI(國際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會)評分判定，注射TβRI的TMD大鼠軟骨變性得到緩解。此外，注射TβRI后，軟骨下骨髓中TRAP陽性細胞百分率明顯降低，而Osterix陽性細胞百分率明顯增加，骨體積顯著增加，提示抑制TGF-β1信號可以減輕TMJ-OA早期的軟骨退化和骨吸收。筆者認為Zheng等[46]所進行的科學(xué)研究思路清晰，嚴格遵守科研實驗設(shè)計的對照原則，使其實驗結(jié)果更加有說服力，且整個實驗嚴謹、客觀、設(shè)計合理，可成為有關(guān)于TMD-OA相關(guān)科研實驗的典范。但仍有一些瑕疵，TGF-β1在正常TMJ-OA進程中也會產(chǎn)生，如何排除內(nèi)源性TGF-β1的干擾，仍需要考慮。

3 不同手術(shù)誘導(dǎo)方法及其評價

3.1 關(guān)節(jié)盤前移位模型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的軟骨細胞凋亡和ECM降解增加，導(dǎo)致軟骨完整性喪失。此外，有學(xué)者報道，在TMJ-OA的大鼠模型中，ER應(yīng)激誘導(dǎo)髁突軟骨變薄[47]。這些間接證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑與軟骨細胞凋亡過程有關(guān)，并會誘發(fā)OA的進展。然而，目前缺乏直接證據(jù)表明ER應(yīng)激與TMD進展相關(guān)。為了研究髁突軟骨中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達及其在TMD發(fā)展中的潛在作用，Xu等[48]使用外科方法建立成年兔的關(guān)節(jié)盤前移位模型(anterior disc displacement，ADD)，具體方法如下：兔被麻醉后，沿右側(cè)顴弓制備3 cm切口，暴露顴骨-顳骨鱗部傷口。之后分離出整個顴骨，在顴弓最上緣鉆孔，然后用彈性橡膠帶將關(guān)節(jié)盤前部向前拉并固定在孔上。外科模型制備后，可以觀察到軟骨細胞凋亡數(shù)增多，細胞密度下降。ADD組大鼠在手術(shù)后1或2周表現(xiàn)出軟骨退化的變化，伴有蛋白聚糖的丟失，軟骨細胞密度的降低和軟骨厚度的減少。種種證據(jù)表明ADD的確可作為誘導(dǎo)TMJ-OA的可靠方法。屬于HMGB蛋白家族的高遷移率組框2(HMGB2)已被確定為維持人類關(guān)節(jié)軟骨淺表區(qū)(SZ)軟骨細胞存活的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。據(jù)報道，HMGB2基因的缺失將導(dǎo)致OA樣軟骨變化，同時HMGB2缺失的小鼠也表現(xiàn)出更嚴重的早發(fā)性O(shè)A[49]。因此為了驗證HMGB2可以調(diào)整軟骨細胞的存活率從而參與TMD進程中軟骨內(nèi)壓力的刺激傳導(dǎo)，Zhou等[50]使用靜水壓法(hydrostatic method，HP)及ADD法構(gòu)建SD大鼠髁突軟骨細胞的體外模型，HP處理細胞后，β-連環(huán)蛋白(一種轉(zhuǎn)錄共激活劑，可調(diào)節(jié)參與細胞增殖和分化的主要基因，在OA軟骨細胞中發(fā)現(xiàn)總β-連環(huán)蛋白水平顯著增加，則提示W(wǎng)nt/β-連環(huán)蛋白途徑的活化)的mRNA表達降低，而β-連環(huán)蛋白的蛋白表達顯著增加。HMGB2基因的表達上調(diào)，其表達調(diào)節(jié)了軟骨發(fā)育相關(guān)因子Col-Ⅱ、MMP13和β-連環(huán)蛋白的表達。在兔模型中的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，ADD處理后，HMGB2和β-連環(huán)蛋白的表達增加。Col-Ⅱ的表達隨著靜水壓的增加而增加。且在實驗期間，術(shù)后所有動物體質(zhì)量沒有明顯變化。ADD組實驗兔中，1～2周時可以觀察到組織學(xué)TMJ髁突軟骨變薄和細胞排列紊亂，組織學(xué)評分中部分軟骨表面結(jié)構(gòu)缺失。一些髁突軟骨在4周時恢復(fù)其厚度。所有ADD組的兔子的髁突軟骨細胞逐漸重新排列，并且在8周時厚度增加到正常水平，表明軟骨形成加速。筆者認為ADD手術(shù)法要在顴骨上方切開一個切口，并需要顳骨鱗部顴骨連接處造成骨折，手術(shù)方法本身就對結(jié)果產(chǎn)生影響，這是該模型的局限性。而HP處理軟骨細胞后可能會影響β-連環(huán)蛋白的核易位，從而導(dǎo)致mRNA和蛋白質(zhì)表達水平之間的差異，如何提高HP誘導(dǎo)的穩(wěn)定性仍是需要改進的地方。

3.2 關(guān)節(jié)盤切除及穿孔模型IL-37是一種新型抗炎細胞因子，是IL-1家族中新發(fā)現(xiàn)的成員，可抑制炎癥及免疫反應(yīng)[51]。盡管學(xué)者們對IL-37進行了孜孜不倦的研究，但對于IL-37及其變異體在軟骨細胞中的分布卻鮮有報道，關(guān)于IL-37對炎癥信號通路的影響更是知之甚少。Luo等[52]為了研究IL-37及其變異體在軟骨細胞中的表達以及IL-37在炎癥期間如何影響軟骨細胞。以SD大鼠為研究對象，通過手術(shù)方法制造TMJ-OA模型：沿顴弓做一斜形切口。然后，暴露顳下頜關(guān)節(jié)上間隙，從關(guān)節(jié)盤的后外側(cè)拉出關(guān)節(jié)盤，并使用直徑1.5 mm的鉆頭造成穿孔模型。結(jié)果示：手術(shù)組中，Safranin O顯色觀察到蛋白聚糖損失，軟骨著色大大減少，髁突軟骨變薄，形狀扁平，發(fā)生侵蝕和硬化；免疫組化結(jié)果表明Ⅰ型膠原(COLI)和Ⅱ型膠原(COLII)表達下調(diào)；MMP1、MMP9和MMP13表達顯著上調(diào)。關(guān)節(jié)盤穿孔術(shù)結(jié)果顯示大鼠產(chǎn)生了TMJ-OA樣變化。TOLL樣受體(TLR-4)是模式識別受體的一種，其主要位于細胞膜上，可參與先天性免疫反應(yīng)[53]。軟骨細胞、滑膜細胞等可以在應(yīng)激狀態(tài)下激活TLR-4，從而誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生。在關(guān)節(jié)軟骨病變和膝關(guān)節(jié)OA滑膜中檢測到TLR2和TLR4表達上調(diào)，與正常軟骨相比，OA患者軟骨中TLR2、TLR3、TLR4和TLR5的高表達均得到證實，驗證了Toll樣受體(TLRs)在OA進展過程中先天免疫反應(yīng)中的作用[54]。為了研究在關(guān)節(jié)盤切除術(shù)后實驗兔促炎和分解代謝介質(zhì)表達的改變，以及使用TLR-4抑制劑后，TLR-4在TMJ-OA發(fā)生發(fā)展中的作用。Liu等[55]以C57BL/6J小鼠為實驗對象，使用了Lan等[56]的方法：在實驗兔的右側(cè)TMJ上做一個“T”形切口，隨后通過鈍性分離暴露關(guān)節(jié)，取出整個關(guān)節(jié)盤，構(gòu)建了關(guān)節(jié)盤切除模型，部分實驗動物在造模前，提前注射TAK-242(TLR-4抑制劑)。在造模后的第2周、第4周、第6周分別取材送檢。關(guān)節(jié)盤切除組與對照組相比，髁突中軟骨變薄，未礦化骨區(qū)域增大，軟骨細胞減少；TLR4表達量逐漸升高，還發(fā)現(xiàn)軟骨中表達TLR-4的細胞比率與OA評分呈正相關(guān)；Micro-CT顯示：TAK-242注射顯著改善了顳下頜關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)盤切除術(shù)誘導(dǎo)的軟骨蛋白聚糖的減少；免疫組化結(jié)果顯示：在手術(shù)6周后，軟骨中促炎介質(zhì)(IL-1β、TNF-α)和分解代謝介質(zhì)(ADAMTS5，MP13)的表達均上調(diào)。學(xué)者們進行的實驗研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了軟骨內(nèi)骨化的核心機制，遺傳學(xué)研究提供了顳下頜軟骨內(nèi)形成期間以及長骨生長板和骨折愈合過程中軟骨細胞直接分化為成骨細胞和骨細胞的證據(jù)。然而，軟骨細胞向成骨細胞/成骨細胞轉(zhuǎn)化的具體機制尚不清楚[57]。為了研究這些問題，有學(xué)者在尤卡坦小型豬中使用關(guān)節(jié)盤穿孔模型通過手術(shù)誘導(dǎo)TMJ-OA，具體步驟如下：在顴突上方形成斜形切口，使組織抬高并回縮進入顳下頜關(guān)節(jié)上間隙，關(guān)節(jié)盤向后牽引，使用打孔器在顳下頜關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)盤的后外側(cè)部分形成5.0 mm的穿孔，對照組為假手術(shù)組[58]。術(shù)后4周處死動物進行組織學(xué)評估，在實驗組和假手術(shù)組中均測量Ⅱ型膠原陽性成熟區(qū)(MZ)與Ⅰ型膠原淺表區(qū)(SZ)的厚度。兩組動物關(guān)節(jié)盤COLlal和Acan表達均為陽性，進一步證明，與假手術(shù)對照組相比，實驗組模型中髁突軟骨厚度和細胞成熟區(qū)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。組織形態(tài)計量學(xué)分析顯示，實驗組SZ區(qū)域較假手術(shù)組明顯增厚，提示髁突軟組織擴張。HE染色顯示實驗組小豬髁突還伴有軟骨細胞外基質(zhì)的大量喪失，這些數(shù)據(jù)與其他研究表明：軟骨細胞標志物和成骨細胞/骨細胞標志物在頜骨生長和骨折愈合的軟骨向骨轉(zhuǎn)化過程中存在共定位現(xiàn)象，并為小型豬顳下頜關(guān)節(jié)損傷模型中軟骨向骨轉(zhuǎn)化提供了證據(jù)。關(guān)節(jié)盤穿孔的小型豬TMJ髁突軟骨內(nèi)CD31+內(nèi)皮細胞數(shù)量的增加表明血管生成在TMJ-OA病理學(xué)機制或修復(fù)中起著關(guān)鍵作用。此外，與假手術(shù)組相比，關(guān)節(jié)盤穿孔組髁突淺表區(qū)中的脈管束的數(shù)量也更豐富。筆者認為雖然手術(shù)方法可很好地保存關(guān)節(jié)囊和關(guān)節(jié)附屬結(jié)構(gòu)，在某種程度上保留了關(guān)節(jié)機構(gòu)的完整性，但仍然與人TMD的發(fā)生、發(fā)展有相當大差別。大多數(shù)外科方法都可用于大型動物上，并不能廣泛地應(yīng)用于小型動物，同時手術(shù)對于關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞有可能會干擾TMD的自然進程。

4 不同基因工程動物及其評價

4.1 Prg4(蛋白聚集多糖)基因缺失小鼠蛋白聚糖4(Prg4)基因編碼潤滑素是一種黏蛋白樣分子[59]，Prg4與透明質(zhì)酸相互作用，并將其集中在關(guān)節(jié)表面，使關(guān)節(jié)具有較低的摩擦系數(shù)，保護關(guān)節(jié)軟骨免受摩擦引起的損傷[60]。除此之外，Prg4作為一種黏液糖蛋白，還可以抑制軟骨細胞凋亡，對軟骨細胞起到保護作用，是一種維持關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)所必需的細胞外基質(zhì)分子。Bechtold等[61]使用了Matthew Warman博士提供的轉(zhuǎn)基因小鼠，報道了Prg4缺失的小鼠顳下頜關(guān)節(jié)組成結(jié)構(gòu)中異位軟骨數(shù)量更多，Prg4基因缺失小鼠在第3個月時，TMJ顯示出明顯的OA變化，包括關(guān)節(jié)窩頂部和關(guān)節(jié)盤厚度增加，與年齡匹配的對照組相比，髁突頭略有擴大，骨贅樣軟骨從關(guān)節(jié)窩的關(guān)節(jié)面中央部分開始生長，并生長到上關(guān)節(jié)腔。同時，關(guān)節(jié)盤有異位軟骨發(fā)生，這些多余的組織似乎與相對的骨贅相連。12個月后，OA樣改變加重。矢狀面、鳥瞰圖和正視圖顯示，與對照組髁突相比，沿近側(cè)方和前后方向的髁突均增大，顯示出OA樣變化，包括多孔骨表面、骨贅及骨面扁平和凹陷。在Prg4基因缺乏小鼠關(guān)節(jié)盤的內(nèi)側(cè)和外側(cè)也檢測到鈣化組織，并與髁突周圍骨贅的發(fā)展密切相關(guān)。對3～12個月齡Prg4基因缺失型小鼠進行的顳下頜關(guān)節(jié)骨贅/異位軟骨發(fā)育的組織形態(tài)計量學(xué)觀察表明，異位軟骨和骨性改變首先發(fā)生在關(guān)節(jié)窩和髁突，隨后在關(guān)節(jié)盤中形成異位軟骨。筆者認為Prg4基因缺乏小鼠能夠較完美地再現(xiàn)TMJ-OA的相關(guān)表現(xiàn)，有利于從病因?qū)W、病理生理學(xué)機制、臨床表現(xiàn)等方面去更加深入地理解TMD，Prg4基因缺失小鼠的出現(xiàn)為研究TMJ-OA的早期發(fā)病機制和關(guān)節(jié)功能障礙提供了一個獨特而有價值的模型，可為日后研究TMD治療相關(guān)藥物打下堅實的基礎(chǔ)，但Prg4基因缺乏小鼠為什么會有OA樣表現(xiàn)，其潛在的重要致病轉(zhuǎn)化背后的分子機制尚不完全清楚，且小鼠和人的關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)不盡相同，動物實驗結(jié)果能否外推到人類身上，仍存在爭議。

4.2 MRAS基因無效突變動物模型MRAS基因(肌RAS癌基因同源基因)已被證明在細胞發(fā)揮功能過程中起著許多作用，例如分化、細胞骨架重塑和細胞遷移，該基因編碼屬于RAS家族的小型單體GTP酶，控制多種信號通路，如MAPK和PI3K-AKT級聯(lián)等[62]。Smith等[63]將MRAS基因無效突變鼠分為純合型、雜合型，分別在模型小鼠上使用校準的von Frey尼龍單絲，采用Dixon升降法評估戒斷閾值。將細絲貼在后爪足底表面3 s，記錄反應(yīng)。每只小鼠注射20 mL CFA，在基線前(注射CFA前1 d)和注射后3 d、7 d、10 d、14 d和21 d，使用von Frey纖維對小鼠進行機械敏感性測試量化機械性痛覺異常。比較了純合型、雜合子和野生型小鼠后爪注射CFA引起的機械超敏反應(yīng)，所有組在第3天都表現(xiàn)出對Von Frey纖維刺激的戒斷閾值降低，到第21天就消失了[63]。CFA注射前的基線機械閾值和注射3 d后觀察到的最大機械痛覺超敏的基因型差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。在炎癥性疼痛模型中，攜帶MRAs(肌肉RAS癌基因同源)無效突變的雄性小鼠表現(xiàn)出持續(xù)性機械性超敏反應(yīng)。遺傳學(xué)和行為學(xué)研究表明，即基因決定的MRAS的表達有利于減輕TMD疼痛反應(yīng)，這種效應(yīng)是雄性特有的，這可能是導(dǎo)致男性顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病綜合征患者疼痛發(fā)生率較低的原因之一。

4.3 TNF-α受體基因缺失小鼠動物模型TNF-α受體基因具有多態(tài)性，反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者通常具有遺傳和微環(huán)境因素的綜合病因。Mcllwrath等[3]通CFA+結(jié)腸激惹雙重誘導(dǎo)TNF-α受體(R1/R2)基因缺失小鼠，來分析判斷不同野生型、突變型小鼠在同樣刺激下的炎癥表現(xiàn)。結(jié)果表明在缺乏TNF-α信號的情況下。功能性TNFR1/R2的缺乏誘導(dǎo)促炎細胞因子的增加和抗炎細胞因子的減少從而產(chǎn)生異常的炎癥信號。筆者認為Mcllwrath等[3]進行的實驗有利于發(fā)現(xiàn)TMD發(fā)病過程中TNF-α受體所發(fā)揮的作用，以及由其所介導(dǎo)的表達增加的致炎細胞因子種類，從而將這些胞因子可以作為血液生物標志物并可以預(yù)測疾病的進展，并可將針對TNF-α受體相關(guān)藥物作為治療TMD的新目標。但與此同時，該實驗仍具有缺點：福爾馬林誘導(dǎo)僅在雄性大鼠身上進行，無法排除性激素對該實驗的影響，用于測量大鼠離斷機械閾值的方法會導(dǎo)致測量在結(jié)果在雄性動物和雌性動物之間存在不同，從而掩蓋了超敏反應(yīng)本身所存在的性別差異。

4.4 K/BxN類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種自身免疫性疾病，以慢性關(guān)節(jié)炎癥(關(guān)節(jié)腫脹、僵硬和疼痛)為特征，常伴有關(guān)節(jié)外其他表現(xiàn)。全世界約有1%的人口罹患此病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者常常伴有其他合并癥(如心血管疾病)[64]。盡管學(xué)者對RA動物模型進行了大量的科學(xué)研究，但仍然缺乏青少年期的小鼠RA動物模型。在1996年，有學(xué)者報道了KRN轉(zhuǎn)基因動物與非肥胖型糖尿病小鼠(non-obese diabetic mice，NOD)雜交從而得到K/BxN小鼠，它們會出現(xiàn)嚴重的膝關(guān)節(jié)炎和骨骼破壞表型。這種動物模型是通過將K/BxN小鼠的血清(含有高水平的自身抗體)轉(zhuǎn)移至在正常的野生型小鼠體內(nèi)，從而誘發(fā)進展迅速的、表型一致的關(guān)節(jié)炎癥[65]。IL-6和TNF-α既是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中參考的藥物靶點，同時也在K/BxN小鼠的關(guān)節(jié)中過表達。實驗結(jié)果顯示針對于Col-1、Col-2和蛋白多糖的組織學(xué)檢測和免疫熒光檢測表明K/BxN動物的顳下頜關(guān)節(jié)出現(xiàn)軟骨損傷，MicroCT結(jié)果也證實了這一點。Micro-MRI觀察表明上關(guān)節(jié)腔體積增加。同時分離于TMJ小鼠的成纖維細胞樣滑膜細胞可分泌炎性細胞因子(IL-6和IL-1β)，并表達MMPs等降解介質(zhì)。筆者認為K/BxN動物模型與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有臨床相關(guān)性，整個致病過程是自發(fā)的和漸進的，逐漸演變?yōu)槁匝装Y，并呈現(xiàn)對稱分布和聯(lián)合破壞的特點，是探索和研究TMJ自發(fā)性損害的一個重要模型。

4.5 Fas基因缺陷的MRL/LPR小鼠模型MRL/LPR小鼠是由LG、AKR、C3H和C57BL/6幾種不同品系小鼠經(jīng)過一系列雜交至12代所得，在第13代時，篩選出淋巴增生反應(yīng)陽性和陰性的亞系，它們有89%的基因組是相同的。突變基因Faslpr位于19號染色體上，將突變基因?qū)氲狡渌废抵?，即可產(chǎn)生具有不同免疫缺陷疾病表現(xiàn)的新品系，如MRL/MPJ-Faslpr、B6.MRL-Faslpr/j等[66]。而顳下頜關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨易受到自身免疫性疾病、骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的侵襲，其中比較常見的就是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其一大特點是軟骨下松質(zhì)骨轉(zhuǎn)換增強，它是骨吸收和骨形成活動失衡的結(jié)果。迄今為止，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中破骨細胞形成和分子活化機制仍不清楚，為了研究介導(dǎo)骨吸收的破骨細胞的形成和激活過程，Hutami等[67]研究出了一種Fas基因缺陷的MRL/LPR小鼠模型，該模型自發(fā)性地發(fā)展成自身免疫性關(guān)節(jié)炎，特征是炎性細胞浸潤、骨質(zhì)疏松表型以及骨和軟骨組織的破壞。NF-κB信號是許多慢性疾病發(fā)生的信號中心，包括關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、糖尿病和炎癥性腸病。同時，多肽SN50已被證明可以穿過細胞膜并阻斷NF-κB復(fù)合體的核轉(zhuǎn)位的小肽從而阻止NF-κB的激活，與NF-κB復(fù)合物競爭核轉(zhuǎn)位，阻斷NF-κB信號通路[68]。1-磷酸鞘氨醇受體1(S1P1)是破骨細胞前體從循環(huán)中排出進入骨組織所必需的，在S1P1誘導(dǎo)破骨細胞前體細胞遷移和通過rac1向下游傳遞信號過程中發(fā)揮著無可替代的作用。MRL/LPR小鼠髁突組織體外培養(yǎng)可發(fā)現(xiàn)破骨細胞活性增強，且下頜骨髁突由于骨吸收嚴重導(dǎo)致軟骨下骨丟失。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示破骨細胞標記物如TRAP、組織蛋白酶K、RANKL、VEGF和MMP-9的表達均上調(diào)[69]。人工合成的NF-κB抑制肽SN50應(yīng)用于MRL/LPR小鼠時，軟骨下骨小梁丟失減少，破骨細胞生成標志物的產(chǎn)生和鞘氨醇激酶(Sphk)1/S1P1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)均減少。結(jié)果表明，激活破骨細胞前體細胞中的Fas/S1P1信號是顳下頜關(guān)節(jié)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的一個關(guān)鍵因素,靶向NF-κB的p50或p65亞單位可能是抑制破骨細胞活性治療顳下頜關(guān)節(jié)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的有效途徑。筆者認為Fas基因缺陷的MRL/LPR小鼠提供了一種自發(fā)表現(xiàn)與人類RA特征相似的疾病動物模型。然而，介導(dǎo)MRL/LPR小鼠RA發(fā)展和骨吸收的機制尚不清楚。同時由于人類TMD發(fā)病的多因性和復(fù)雜性,單獨應(yīng)用MRL/LPR小鼠模型不能完全揭示人類TMD發(fā)病原因和病理機制，常常需要聯(lián)合其他動物模型才能更好地揭示TMD的病理表現(xiàn)和發(fā)病機制。同時Hutami等[69]僅僅在細胞層次對MRL/LPR小鼠進行研究，如后續(xù)實驗?zāi)茉黾悠鋭游飳W(xué)表現(xiàn)及病理學(xué)研究，將使實驗結(jié)果更加具有科學(xué)性和說服力。

5 展望

隨著人類社會的不斷發(fā)展進步，無論是生物學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、還是毒理學(xué)的需要，任何服務(wù)于人類科學(xué)研究的實驗都不可避免地要開發(fā)、研究和驗證動物模型。怎樣選擇合適的實驗動物來模擬人類疾病的發(fā)病過程、病理改變、臨床表現(xiàn)是重中之重。如果缺乏一個穩(wěn)定的、適合的、便利的實驗動物模型，那么可以說想得到可靠的、能信服于人的實驗結(jié)果簡直是天方夜譚。同樣將結(jié)果外推到人類身上更加難以實現(xiàn)。顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病相關(guān)動物實驗研究滯后于臨床研究，如何設(shè)計出可靠的、穩(wěn)定的實驗動物模型也是每位學(xué)者都應(yīng)著重解決的問題。構(gòu)建顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病動物模型的方法各式各樣，可供選擇的動物種類繁多，如何選擇正確的TMD動物模型，在未來的TMD相關(guān)研究中一定會被解決，隨著相關(guān)實驗的進展深入和相關(guān)文章的陸續(xù)發(fā)表，未來的TMD學(xué)科研究、動物研究、治療方法研究必將會更上一層樓，成為口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和動物實驗學(xué)研究的熱點，從而為TMD的病因?qū)W研究、病理機制研究、臨床表現(xiàn)、治療和預(yù)防提供堅實的實驗基礎(chǔ)，以有利于發(fā)現(xiàn)治療TMD的有效方法，為廣大TMD患者解除病痛。