王旭東，徐建洪，李志勇，王 珺，徐曉菲，常 陽

肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤，也是排名第一的腫瘤相關(guān)致死原因[1]。依據(jù)病理分型，肺癌分為小細胞肺癌(15%)和非小細胞肺癌(85%)，后者又分為三個亞型：肺腺癌、肺鱗狀細胞癌和大細胞肺癌，其中肺腺癌占總體病例的40%左右[2]。據(jù)統(tǒng)計，男性和女性肺癌的5年生存率分別僅為15.5%和20.3%[3]。近年來，隨著診斷和治療技術(shù)的發(fā)展，尤其是靶向治療的應(yīng)用，肺癌的預(yù)后已經(jīng)取得了一定的進步。但是由于缺乏特異性治療靶點和腫瘤耐藥等原因，肺腺癌患者的生存時間依然有待進一步延長。因此，開發(fā)針對肺腺癌的標志物和治療靶點成為重要的研究任務(wù)。

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)家族在進化上相對保守，根據(jù)分子量的不同，HSP蛋白家族可以分為五大家族：分別為HSP40、HSP70、HSP90、HSP105/110和小分子HSP家族等。研究表明，腫瘤細胞表面表達了大量的HSP，包括HSP40、HSP60和HSP70等[4]。在癌癥的基因變異中，HSP家族能夠穩(wěn)定腫瘤變異的或異常表達的基因，向患者免疫系統(tǒng)提供信號，幫助腫瘤免疫逃逸[4]。HSPA4作為HSP70的一員，也廣泛參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[5-8]。HSPA4 rs3088225(A>G)基因變異與鉑化療的肺癌患者生存率顯著相關(guān)[9]。目前，HSPA4在肺腺癌中的研究較少，因此明確HSPA4在肺腺癌發(fā)生發(fā)展乃至轉(zhuǎn)移中的作用具有重要意義。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，探討HSPA4在肺腺癌發(fā)病中的作用，以期為肺腺癌的診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料獲取 在TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載肺腺癌、癌旁組織和正常組織的數(shù)據(jù)集，獲得535例肺腺癌病例和59例正常肺組織mRNA表達譜、一般信息和臨床資料。從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載GSE43448和GSE10072數(shù)據(jù)集中的mRNA表達譜，分別采用Wilcoxon秩和檢驗比較HSPA4在肺腺癌組織和正常肺組織中HSPA4的表達差異情況。對HPA數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)中抗體對肺腺癌和正常組織的染色強度進行綜合評估，用于分析HSPA4在蛋白水平的表達情況[10]。

1.2 HSPA4表達與肺腺癌腫瘤分期的相關(guān)性及其診斷和預(yù)后價值 應(yīng)用R包ggplot2分析HSPA4與肺腺癌腫瘤中包括TMN分期和病理分期指標的相關(guān)性。分別應(yīng)用R包survival 并利用K-M圖展示TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中HSPA4不同表達組的全因死亡率(overall survival，OS)、無進展生存期(progess free interval，PFI)和疾病特異性生存率(disease specific survival, DSS)，并以GSE13213數(shù)據(jù)集OS生存率進行驗證。應(yīng)用pROC包，timeROC包和survival包，分析HSPA4在肺腺癌中的診斷和預(yù)后價值。以列線圖展示包括TNM分期、HSPA4表達在內(nèi)的多種因素在肺腺癌1年、3年和5年預(yù)測價值。

1.3 HSPA4在肺腺癌中的基因變異 選取cBioportal數(shù)據(jù)庫(www. cBioportal.org)中3個肺腺癌數(shù)據(jù)集，分別是Lung Adenocarcinoma(MSKCC,Science 2015)、Lung Adenocarcinoma (Broad ,Cell 2012)、 Lung Adenocarcinoma (TCGA, PanCancer Altas ) 分析HSPA4基因在肺腺癌中的變異情況[11]。

1.4 HSPA4基因中的DNA甲基化信息 基因甲基化是表觀遺傳學(xué)重要的基因表達調(diào)節(jié)方式，我們利用MethSurv數(shù)據(jù)庫(https://biit.cs.ut.ee/methsurv/)分析TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中HSPA4基因甲基化情況，并且評價了HSPA4基因CpG甲基化在肺腺癌中的預(yù)后價值[12]。

1.5 HSPA4與肺腺癌腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤和免疫檢查點的關(guān)系 利用R包GSVA包分析了HSPA4與肺腺癌中多種免疫細胞浸潤情況的相關(guān)性，同時考察了HSPA4在肺腺癌中的表達與免疫檢查點CD274表達的相關(guān)性。

1.6 GO、KEGG和GSEA富集分析 應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)獲得HSPA4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，以評分大于0.9為標準[13]。應(yīng)用GO、KEGG分析HSPA4及其相關(guān)基因的功能和通路富集分析。GSEA分析選擇帶注釋的基因集(c2.cp.v7.2.symbols.gmt)作為參考數(shù)據(jù)集，每個分析運行1000次基因組排列，分析HSPA4相關(guān)基因富集通路。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用R(v.3.6.3)平臺分析數(shù)據(jù)，應(yīng)用非參數(shù)秩和檢驗行兩組間差異比較；應(yīng)用Spearman相關(guān)檢驗分析兩因素相關(guān)性；應(yīng)用Kaplan-Meier曲線進行生存分析，組間生存率以Cox回歸檢驗。均以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HSPA4在肺腺癌中mRNA和蛋白表達水平 在TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中，與正常肺組織(59例)(5.882±0.197)相比，肺腺癌組(535例)表達(6.184±0.537)顯著升高(P<0.001)；而與癌旁正常肺組織(59例)表達(5.882±0.197)相比，相對應(yīng)的肺腺癌組(59例)表達(6.396±0.482)顯著升高(P<0.001)。為了確認HSPA4在肺腺癌中的表達差異，我們在GSE43458和GSE10072兩個數(shù)據(jù)集進行驗證。在數(shù)據(jù)集GSE43458中，與正常肺組織(30例)表達(9.020±0.164)相比，肺腺癌組(80例)表達(9.241±0.385)顯著升高(P<0.001)；在數(shù)據(jù)集GSE10072中，與正常肺組織(49例)表達(8.425±0.295)相比，肺腺癌組(58例)表達(8.919±0.386)顯著升高(P<0.001)。利用HPA數(shù)據(jù)庫獲得HSPA4在正常肺組織和肺腺癌組織中的表達情況：在HPA00023抗體組中正常肺組織均無染色；而肺腺癌組織中中等染色4例(4/12)，低染色4例(4/12)，無染色4例(4/12)(圖1)。

圖1 熱休克蛋白A4在正常肺組織(A)及肺腺癌(B)中的表達情況(免疫組化)

2.2 HSPA4高表達與肺腺癌分期的相關(guān)性 在T分期中，與正常肺組織相比，HSPA4表達在T1+T2+T3分期及T4分期顯著升高，T4分期表達較T1+T2+T3分期明顯升高(表1)。HSPA4表達與N、M及病理分期也顯著相關(guān)(表1)。根據(jù)K-M曲線所示，HSPA4高表達的肺腺癌患者與低表達者相比具有更差的OS(P=0.004)、PFI(P=0.021)和DSS(P=0.012)(圖2A-C)。我們利用GEO數(shù)據(jù)集GSE13213臨床生存數(shù)據(jù)進一步證實HSPA4高表達組較低表達組的預(yù)后更差(OS，P=0.006)(圖2D)。受試者工作曲線ROC圖顯示，曲線下面積AUC為0.810，表明HSPA4能夠較好地區(qū)分肺腺癌腫瘤組織和正常組織；時間依賴性ROC曲線1、3、5年曲線下面積分別為0.605、0.583、0.553(圖3)。列線圖展示了TNM分期、HSPA4等對肺腺癌患者1、3、5年生存率的預(yù)測，表明HSPA4具有一定的判斷預(yù)后的作用(圖4)。

表1 LUAD數(shù)據(jù)集中HSPA4表達與肺腺癌臨床階段的關(guān)系

2.3 HSPA4在肺腺癌中的基因改變情況 在cBioportal數(shù)據(jù)庫中選取了3個數(shù)據(jù)集，分別是Lung Adenocarcinoma(MSKCC,Science 2015)、Lung Adenocarcinoma (Broad ,Cell 2012)、 Lung Adenocarcinoma (TCGA,PanCancer Altas)，共計784位患者。結(jié)果顯示，HSPA4基因總體改變率為2.2%。

2.4 HSPA4基因在肺腺癌患者中DNA甲基化情況 MethSurv數(shù)據(jù)庫分析13個CpG位點中cg05996250、cg0747441、cg10645426和cg11250576等4個探針甲基化程度較高，同時cg05996250(HR=1.526，P=0.014)、cg02067788(HR=1.526，P=0.022)、cg24159723(HR=0.692，P=0.021)等3個CpG位點探針顯示HSPA4的高甲基化與肺腺癌的不良預(yù)后相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 肺腺癌患者HSPA4高表達組與低表達組的預(yù)后比較

圖3 ROC曲線顯示HSPA4對肺腺癌的診斷和預(yù)測價值

圖4 列線圖展示HSPA4水平與相關(guān)臨床因素預(yù)測1、3、5年肺腺癌患者生存率

2.5 HSPA4表達與肺腺癌中免疫細胞浸潤的相關(guān)性 在肺腺癌中，HSPA4表達與輔助性T細胞2(r=-0.282，P<0.001)、中央記憶型T細胞(r=0.154，P<0.001)、輔助性T細胞(r=0.135，P=0.002)等免疫細胞正相關(guān)；而與B 細胞(r=-0.220，P<0.001)、漿細胞樣樹突狀細胞(r=-0.187，P<0.001)、濾泡輔助性T細胞(r=-0.136，P-=0.002)、CD8 T細胞(r=-0.134，P=0.002)、細胞毒性細胞(r=-0.129，P=0.003)、CD56表達水平較高自然殺傷細胞(r=-0.119，P=0.006)、T細胞(r=-0.092，P=0.033)等免疫細胞呈負相關(guān)。同時我們考察了HSPA4在肺腺癌中與免疫檢查點CD274之間的關(guān)系，結(jié)果顯示HSPA4與CD274表達正相關(guān)，并具有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.144，P<0.001)(圖5)。

圖5 HSPA4表達與免疫檢查點CD274表達的關(guān)系

2.6 GO、KEGG和GSEA通路富集分析 依據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫建立HSPA4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，評分最高的10個相關(guān)蛋白為E3泛素蛋白連接酶CHIP(E3 ubiquitin-protein ligase CHIP，STUB1)、應(yīng)激誘導(dǎo)的磷酸蛋白1(stress-induced-phosphoprotein 1，STIP1)、Hsc70相互作用蛋白(Hsc70-interacting protein，ST13)、α-突觸蛋白(Alpha-synuclein，SNCA)、熱休克蛋白90α(Heat shock protein HSP 90-alpha、HSP90AA1)、DnaJ同源亞家族B成員6(DnaJ homolog subfamily B member 6，DNAJB6)、Dnaj熱休克蛋白40家族成員B1(Dnaj hsp40 member b1，DNAJB1)、BAG家族分子伴侶調(diào)節(jié)器1(BAG family molecular chaperone regulator 1，BAG1)、BAG家族分子伴侶調(diào)節(jié)器2(BAG family molecular chaperone regulator2，BAG2)、BAG家族分子伴侶調(diào)節(jié)器3(BAG family molecular chaperone regulator3，BAG3)，評分均大于0.99。KEGG通路富集分析顯示HSPA4及相關(guān)除了參與細胞對熱的反應(yīng)等生物學(xué)過程外，還參與了抗原處理和提呈(hsa04612，antigen processing and presentation)等細胞通路。HSPA4與HSP90AA1在肺腺癌患者中表達呈正相關(guān)(r=0.564，P<0.001，圖6)，同時HSP90AA1的高表達與肺腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)(P=0.009，圖7)。GSEA通路富集分析顯示：HSPA4及其相關(guān)蛋白被富集于FceRI介導(dǎo)的NF-κB活化(FCERI_MEDIATED_NF_KB_ACTIVATION)、FcgR3A 介導(dǎo)的IL10的合成(FCGR3A_MEDIATED_IL10_SYNTHESIS)、B細胞受體介導(dǎo)的B細胞信號通路(SIGNALING_BY_THE_B_CELL_RECEPTOR_BCR)、抗體激活B細胞受體導(dǎo)致的第二信使的產(chǎn)生(ANTIGEN_ACTIVATES_B_CELL_RECEPTOR_BCR_LEADING_TO_GENERATION_OF_SECOND_MESSENGERS)、FceRI介導(dǎo)的鈣離子流通(FCERI_MEDIATED_CA_2_MOBILIZATION)、FCGR的活化(FCGR_ACTIVATION)、CD22介導(dǎo)的B細胞受體的控制等信號通路(CD22介導(dǎo)的B細胞受體調(diào)節(jié))，并與上述通路負相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(NES<-1，校正P<0.05，F(xiàn)DR<0.25)。

圖6 肺腺癌中HSPA4與HSP90AA1表達的關(guān)系

圖7 HSP90AA1不同表達組在肺腺癌中的生存分析

3 討 論

研究表明，HSPA4表達于多種器官，且參與了包括腫瘤發(fā)生、發(fā)展在內(nèi)的多種生物過程，作為HSP70家族成員之一，還具有促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用[14]。在本研究中，我們利用TCGA和GEO數(shù)據(jù)確認了HSPA4在肺腺癌中較正常肺組織表達明顯升高，并且以HPA數(shù)據(jù)庫資料證實了HSPA4在蛋白水平的表達明顯升高。HSPA4高表達與肺腺癌患者的TMN分期和病理分期等密切相關(guān)，HSPA4表達升高提示患者的預(yù)后更差。同時，HSPA4具有一定的診斷和預(yù)測能力，能夠預(yù)測患者1、3和5年生存率，說明HSPA4具有成為肺腺癌診斷、治療乃至預(yù)后的生物標志物和靶點的潛力。

包括突變和缺失等在內(nèi)的基因變異與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，因此我們利用cBioportal數(shù)據(jù)庫資料研究了HSPA4基因變異與肺癌發(fā)生之間的關(guān)系，結(jié)果顯示有2.2%的肺腺癌患者HSPA4基因發(fā)生了變異。DNA甲基化也是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展重要的因素之一，因此我們利用MethSurv數(shù)據(jù)庫資料研究了HSPA4基因DNA甲基化情況，結(jié)果提示包括cg02067788、cg24159723、cg05996250在內(nèi)的CpG位點甲基化水平升高與肺腺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，其中cg05996250探針CpG位點甲基化水平也是最高的。

目前肺腺癌的治療手段包括手術(shù)、放療、化療和靶向治療等，免疫治療作為一種新的治療手段，近年來越來越受到關(guān)注[15]。在肺部腫瘤微環(huán)境中大約2/3的免疫細胞是T和B細胞[16]。對肺癌浸潤性T細胞的影響已經(jīng)進行了廣泛的研究，肺癌最成功的免疫治療方法是阻斷浸潤腫瘤的T細胞上調(diào)的抑制性受體——免疫檢查點的抗體，從而增強患者的T細胞對腫瘤細胞的作用[17]。然而，只有一部分患者對這些藥物表現(xiàn)出持久的反應(yīng)，而且治療耐藥性也很常見。新的證據(jù)表明，B細胞在腫瘤微環(huán)境中不僅僅是一個旁觀者，它也具有關(guān)鍵的作用，然而這種作用可能是特定的，由于B細胞由不同的亞型組成，具有獨特的效應(yīng)功能，可能導(dǎo)致抗腫瘤或促進腫瘤的效果。因此，各種B細胞亞型之間的平衡會影響B(tài)細胞對腫瘤免疫的凈影響[18]。本研究表明，HSPA4與B細胞、CD8+T細胞、細胞毒性細胞、T細胞等重要的免疫細胞均呈負相關(guān)，提示HSPA4的表達可能與腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制具有密切關(guān)系。CD274為程序性死亡蛋白配體1(PD-L1，CD274)已被確定為免疫抑制受體編程性死亡-1(PD1/PDCD1)配體，并已證明在誘導(dǎo)和維持腫瘤免疫耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19, 20]。本研究表明，HSPA4的表達與CD274正相關(guān)，進一步提示HSPA4在肺腺癌腫瘤免疫耐受中發(fā)揮了重要作用。

本研究進一步利用GO、KEGG和GSEA數(shù)據(jù)庫分析HSPA4相關(guān)基因在肺腺癌發(fā)病中的作用機制，HSPA4及其相關(guān)基因不僅參與了對熱等不良刺激的反應(yīng)，而且還富集于抗原提呈過程、FceRI介導(dǎo)的NF-κB活化、FcgR3A 介導(dǎo)的IL-10的合成、B細胞受體介導(dǎo)的B細胞信號通路、B細胞活化第二信使通路、FceRI介導(dǎo)的鈣離子流通、FCGR的活化、CD22介導(dǎo)的B細胞受體的控制等信號通路，并對上述通路負調(diào)節(jié)，進一步提示HSPA4在肺腺癌腫瘤形成過程中參與了腫瘤免疫抑制和免疫逃逸等。

本研究明確了HSPA4在肺腺癌中高表達，且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、診斷乃至預(yù)后具有密切的關(guān)系，同時HSPA4的高表達還與腫瘤微環(huán)境中的免疫逃逸等具有密切的關(guān)系。由此我們認為，HSPA4可能具有作為肺腺癌新的腫瘤標志物和治療靶點的潛力，值得我們進一步的深入研究。