李 偉，曾一文，王 婧，胡可勝，楊 莉

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期常見的并發(fā)癥之一，危害母體及胎兒健康[1,2]。許多學者認為，胰島素耐受是發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)，但是具體機制仍不清楚。糖代謝胰島素信號通路中最重要的是IRS-PI3K-AKT途徑，葡萄糖轉運體4(glucose transporter，GLUT4)是該通路的效應因子之一[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是細胞內產生的核苷酸長度18～22 nt的非編碼保守RNA，通過結合核苷酸的3′非翻譯序列等發(fā)揮作用[4]。研究顯示，miRNA廣泛參與了人體生理病理過程。GDM患者血清miRNA的表達與正常妊娠者的表達譜存在明顯差異[5]，這些miRNA大多參與調節(jié)糖代謝中的胰島素信號通路[6]。miR-22還可能是調節(jié)血糖和脂類代謝的關鍵因子[7,8]，但是調節(jié)糖代謝的具體機制并不清楚。本研究對miR-22在GDM胎盤組織和高糖培養(yǎng)HTR8/Svneo細胞的表達情況進行分析，驗證miR-22的潛在靶基因。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2018-01至2019-01在我院招募志愿者共150人。75例妊娠糖尿病孕婦組(GDM組)的胎盤組織作為觀察組，75例正常妊娠孕婦(HC組)作為對照組。排除標準：(1)妊娠前有高血壓、糖尿病、甲狀腺功能障礙、先天性心臟病、肝炎；(2)雙胎妊娠、早產、胎兒畸形或染色體異常；(3)合并急性細菌或病毒感染，應激。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，倫理審查編號【2018】第012號，所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR8/SVneo細胞(中原合聚生物科技有限公司)；人肝正常細胞(L-02)(尚恩生物)；TaKaRa PrimeScript Ⅱ第1鏈cDNA合成試劑盒和Misccript SYBR PCR試劑盒(日本，TaKaRa)；Lipofectamine 2000 轉染試劑(賽默飛世爾科技)；Opti-MEMI 無血清培養(yǎng)基(上海語純生物科技)；CFX96 Touch實時PCR檢測系統(tǒng)(美國，Bio-Rad)；分光光度計(美國賽默飛，NanoDropLite)。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 在孕中期(20～24周)產檢當天空腹采集靜脈血測定空腹血糖、空腹胰島素水平，根據(jù)穩(wěn)態(tài)模型法計算胰島素抵抗指數(shù)。組織取樣：胎兒分娩后，在胎盤中央帶取材，-80 ℃冷凍保存用于后續(xù)分析。

1.3.2 細胞培養(yǎng) 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR8/SVneo細胞在普通RPMI-1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清，雙抗)常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)期生長細胞，接種于6孔板(3×105/孔)，實驗分組：對照組(培養(yǎng)液葡萄糖濃度：5.57 mmol/L)，高糖組1(培養(yǎng)液葡萄糖濃度：10.0 mmol/L；HGl)，高糖組2(培養(yǎng)液葡萄糖濃度：30.0 mmol/L；HG2)，高糖組3(培養(yǎng)液葡萄糖濃度：50.0 mmol/L；HG3)。

1.3.3 miRNA22檢測 用TRIZOL試劑從胎盤組織(140 mg)，HTR8/SVneo細胞(5×106)提取總RNA。分光光度計(NanoDrop)檢測總RNA的量和質量。RT-PCR法檢測miR-22，引物：GAAGCUGCCAGUUGAAG；采用cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒在PCR檢測系統(tǒng)進行QRT-PCR。以U6 snoRNA作為內源性對照，用比較定量循環(huán)法(Ct)測定miR-22的相對表達(2-ΔΔCt)。

1.3.4 蛋白表達 (1)細胞轉染：HTR8/Svneo細胞轉染前1 d，消化HTR8/SVneo細胞，以1∶3的比例各接種3個25 ml培養(yǎng)瓶，轉染當天制備ASO-LipofectAmineTM2000復合體。取miR-22類似物、抑制劑稀釋至200 μl Opti-MEMI無血清培養(yǎng)液中，混合均勻，轉染至高糖處理HTR8/Svneo細胞。(2)Western blot：細胞轉染48 h后，提取組織和細胞蛋白，SDS-PAGE10%分離膠電泳分離蛋白，轉膜，一抗(羊抗人IRS、羊抗人PI3K、羊抗人AKT和羊抗人GLUT4)室溫下孵育2 h，TBS洗滌后二抗(辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG)孵育1.5 h，化學發(fā)光法顯影，圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.3.5 體外葡萄糖消耗實驗 (1)構建質粒：查詢數(shù)據(jù)庫http://www.targetscan.org，發(fā)現(xiàn)通路中有兩個基因SLC2A4(Glut4)、AKT1受miR-22調控作用明顯，根據(jù)3′非翻譯序列設計SLC2A4、AKT1野生型和突變型序列，通過Takara酶將野生型和突變型片段克隆至psiCHECK2質粒。(2)質粒轉染：質粒用Lipofectamine 2000 轉染到細胞中，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌1遍。(3)葡萄糖消耗實驗：HTR8/Svneo細胞質粒轉染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取上清培養(yǎng)液，用葡萄糖試劑盒測定培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，計算葡萄糖的消耗量。

1.3.6 GLUT4基因檢測 (1)質粒構建與轉染：方法同1.3.5；(2)基因檢測：HTR8/Svneo細胞接種到24孔板(細胞濃度為 1×105/ml )，將HTR按順序將miRN A(20 pmol)、質粒(0.48 μg)和Opti-MEM(50 μl)、lipo2000(2 μl)和Opti-MEM(50 μl)混合后靜置孵育，24 h后，加入細胞裂解液100 μl，振蕩器上室溫裂解。避光條件下分別檢測兩種熒光素熒光值，計算得到相對熒光素值(RLU)。

2 結 果

2.1 一般情況 平均年齡：HC組(26.46±2.1)歲，GDM組(27.54±2.8)歲；孕前體重指數(shù)(BMI)：HC組(24.09±2.31)kg/m2，GDM組(25.17±1.65)kg/m2，差異均無統(tǒng)計學意義。兩組胰島素抵抗指數(shù)：HC組1.62±0.71，GDM組3.03±1.06，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 miR-22表達 qPCR檢測兩組胎盤組織中miR-22的轉錄水平變化情況，發(fā)現(xiàn)miR-22在HC組表達明顯高于GDM組(P<0.001)，并且與胰島素抵抗指數(shù)呈負相關(R=-0.398，P<0.01)(圖1 A)。以梯度高糖培養(yǎng)HTR8/Svneo細胞模擬GDM條件下的胎盤組織，qPCR檢測miR-22表達變化，發(fā)現(xiàn)隨著葡萄糖濃度增高細胞miR-22表達降低，HG1組、HG2組、HG3組分別為0.85±0.12、0.73±0.06、0.39±0.16，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1B)。

圖1 miR-22的轉錄水平表達情況

2.3 蛋白表達 Western blot分析GDM和HC組胎盤組織胰島素信號通路相關蛋白，發(fā)現(xiàn)GDM組織中的IRS、PI3K、AKT和GLUT4表達明顯低于HC組(圖2A)。轉染miR-22類似物的高糖培養(yǎng)HTR8/Svneo細胞的GLUT4表達明顯高于HC組，轉染miR-22抑制物高糖培養(yǎng)細胞HTR8/Svneo細胞的GLUT4表達明顯低于HC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在miR-22類似物或抑制物轉染HTR8/Svneo細胞中IRS、PI3K、Akt表達均低于HC組，miR-22表達與GLUT4表達呈正相關差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖2B)。

圖2 胰島素信號通路蛋白表達

2.4 GLUT4基因檢測 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測slc2a4(GLUT4基因)、 AKT野生型和突變型質粒與miR-22相互作用，結果顯示，miR-22類似物組的熒光值明顯低于類似物對照組[(0.68±0.09)vs(1.06±0.25)]、而miR-22抑制劑組明顯高于抑制劑對照組[(1.87±0.18)vs(1.06±0.12)](圖3)，提示miR-22明顯降低了野生型slc2a4的熒光素活性，而對AKT沒有作用。

2.5 葡萄糖攝取 細胞轉染miR-22類似物，miR-22過表達，細胞的體外葡萄糖攝取率(0.89±0.09)%明顯高于對照組[(0.76±0.11)，P<0.05]；miR-22受抑制時，葡萄糖攝取率(0.45±0.06)%明顯低于對照組。提示細胞過表達miR-22，有促進體外細胞攝取葡萄糖的作用。

圖3 miR-22和SLC2A4相互作用的雙熒光素酶

3 討 論

GDM主要的發(fā)病機制是胰島素抵抗，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA表達與胰島素抵抗密切相關[5,6,9]。本研究首次報道m(xù)iR-22在GDM胎盤組織中和體外高糖培養(yǎng)細胞中表達均明顯降低，并且miR-22表達與胰島素抵抗指數(shù)呈負相關，提示miR-22可能參與了胎盤組織胰島素抵抗。當胰島素抵抗發(fā)生時，糖代謝IRS/PI3K/AKT通路被阻斷。有趣的是，細胞體外高糖處理與miR-22的表達也呈負相關，因此探討miR-22對胰島素信號轉導中IRS-PI3K-AKT通路蛋白的調控作用具有重要意義。

GLUT4是由SLC2A4基因編碼的蛋白，在胰島素信號激活后可以從胞質轉移至細胞膜[10]，促進葡萄糖的攝取。GLUT4在胎盤組織主要定位于合體滋養(yǎng)細胞質及細胞膜中[11]。本研究western blot結果顯示，在GDM胎盤組織，IRS、GLUT4等表達明顯下調,與馮衛(wèi)紅等[12]研究的結果一致。低表達的GLUT4與明顯下降的miR-22參與的胰島素抵抗可能密切相關。miRNA可能同時對多個靶點有調節(jié)作用，生信分析提示胰島素信號通路中的GLUT4和AKT基因可能是miR-22的靶基因，本研究進一步的雙熒光素酶報告實驗證實miR-22在胰島素信號通路中主要調節(jié)靶點是GLUT4。在GDM中GLUT4 表達下降可能是胰島素信號轉導通路出現(xiàn)障礙的重要原因。體外細胞葡萄糖攝取實驗結果提示高表達的miR-22可以促進葡萄糖的攝取，從而在胰島素耐受中發(fā)揮保護作用。傳統(tǒng)的觀點認為，miRNA在細胞內通過與目標mRNA的3′UTR結合， 導致靶mRNA的翻譯受到抑制或降解從而發(fā)揮轉錄后抑制基因表達的作用。Shi等[13]發(fā)現(xiàn)， miR-222在GDM婦女產后網(wǎng)膜脂肪組織中表達上調，功能實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠3T3-L1脂肪細胞中miR-222的表達增加抑制了雌激素受體及Glut4的表達，從而表現(xiàn)出糖代謝障礙、胰島素抵抗。miRNA的作用模式不僅僅限于轉錄后抑制mRNA翻譯，Vasudevan等[14.15]發(fā)現(xiàn) miRNA不總是基因表達的負調控因子，在一些條件下miRNA 也可通過影響mRNA穩(wěn)定性元件或者結合到mRNA5'UTR而上調基因表達。此外，miRNA還可能通過在細胞核內作用而正向調節(jié)基因；Huaping等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-320在細胞核內以一個小激活RNA的角色促進CD36的轉錄，從而正向調節(jié)基因的表達。據(jù)此推測，本研究中miR-22有可能是通過核內和其他的機制調節(jié)GLUT4的表達，當然這需要進一步的研究來證實。

本研究發(fā)現(xiàn)，GDM胎盤組織和體外高糖培養(yǎng)細胞miR-22表達降低，而細胞過表達的miR-22能夠增高GLUT4表達并能增強體外細胞攝取葡萄糖能力，miR-22可能通過調節(jié)GLUT4基因表達而參與調控胰島素抵抗過程，提示miR-22可能在GDM發(fā)病機制起重要作用。