周素珍，邢 莉，范金波*，王長(zhǎng)霞，呂長(zhǎng)鑫

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 錦州益多樂(lè)乳業(yè)有限公司 遼寧錦州 121018）

類胡蘿卜素與人類的健康有緊密的聯(lián)系。人和動(dòng)物均不可以實(shí)現(xiàn)其在身體內(nèi)部合成，只能經(jīng)由食物的途徑攝取[1]。有研究證明類胡蘿卜素在抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、降脂[4]、抗糖尿病[5]、增強(qiáng)免疫力[6]和預(yù)防心腦血管疾病[7]等方面展示了巨大潛力。

在研究蛋白質(zhì)與小分子互作機(jī)制時(shí)，人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是最普遍使用的模型蛋白[8]。HSA 是單肽鏈的蛋白，其結(jié)構(gòu)中有3 個(gè)同源結(jié)構(gòu)域（I、II、III），每個(gè)結(jié)構(gòu)域又可細(xì)分為A 和B 兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，獨(dú)特的結(jié)構(gòu)能實(shí)現(xiàn)和內(nèi)源及外源性的小分子化合物結(jié)合，并跟隨血液循環(huán)對(duì)小分子實(shí)現(xiàn)靶向遞送[9-10]。在體外模擬的生理?xiàng)l件下，對(duì)天然活性成分和HSA 的結(jié)合進(jìn)行研究，有利于在分子水平上探索天然活性成分在體內(nèi)的作用機(jī)制。

在人體血漿中含量最高的類胡蘿卜素包括β-胡蘿卜素（β-CA）、番茄紅素（LYC）、葉黃素（LUT）[11]。它們具有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病等多種生理活性。又因類胡蘿卜素種類繁多，各自的功能也會(huì)有所不同。β-CA 是合成維生素A 的前體[12]，LUT 是構(gòu)成人體視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域的重要物質(zhì)[13]，LYC 對(duì)心血管疾病具有一定的預(yù)防功能[14]。然而，水溶性差，受光、熱、氧的影響易異構(gòu)化，限制了類胡蘿卜素應(yīng)用[15]。

目前，關(guān)于酚類化合物、藥物等與HSA 相互作用的研究較為多，而有關(guān)比較不同類胡蘿卜素與HSA 結(jié)合的報(bào)道較少。本文以HSA 為載體蛋白，選取3 種類胡蘿卜素為配體分子，通過(guò)熒光光譜技術(shù)探究3 種類胡蘿卜素與HSA 相互作用的機(jī)制，為類胡蘿卜素的活性開(kāi)發(fā)、靶向遞送提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HSA（純度≥98%），購(gòu)自上海伊卡生物科技有限公司；LUT（純度≥98%）、β-CA（純度≥98%）、LYC（純度≥98%），購(gòu)自上海萌芽生物科技有限公司；保泰松（PHE，純度≥99%）和布洛芬（IBU，純度≥99%），購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；試驗(yàn)用水為超純水，磷酸氫二鈉、無(wú)水乙醇、二甲基亞砜（DMSO）、檸檬酸等均為分析純級(jí)，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000 熒光分光光度計(jì)，日本日立高新技術(shù)公司；FE20PH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Milli-Q Reference 型超純水機(jī)，德國(guó)默克密理博有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制 磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）用檸檬酸、磷酸氫二鈉配制，濃度為0.2 mol/L，HSA溶液用PBS 緩沖液配制成1.2×10-4mol/L 的儲(chǔ)備液。LUT、PHE 用無(wú)水乙醇配制，濃度為7.2×10-4mol/L。IBU 用PBS 緩沖液配制，濃度為7.2×10-4mol/L。β-CA、LYC 用DMSO 配制，濃度為7.2×10-4mol/L。以上試劑均存放于4 ℃的冰箱中備用。

1.3.2 LUT/β-CA/LYC 與HSA 相互作用的熒光光譜測(cè)定

1.3.2.1 熒光發(fā)射光譜 先將一定體積PBS 緩沖溶液加入離心管，然后加入30 μL 的HSA，最后加入一定體積的LUT、β-CA、LYC，得到混合溶液3 mL，靜置30 min，使之充分反應(yīng)，最后使HSA 濃度為1.2×10-6mol/L，LUT、β-CA、LYC 的濃度為0，6×10-6，12×10-6，18×10-6，24×10-6，30×10-6，36×10-6，42×10-6mol/L。設(shè)定反應(yīng)溫度為298 K、310 K，激發(fā)和發(fā)射光柵分別設(shè)置為2.5 nm 和5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，290～450 nm 范圍內(nèi)記錄熒光光譜。

1.3.2.2 同步熒光光譜 設(shè)Δλ 分別為60 nm 和15 nm，在310 K、激發(fā)光柵2.5 nm、發(fā)射光柵5 nm 條件下，在波長(zhǎng)250～350 nm 范圍測(cè)定同步熒光光譜。

1.3.2.3 三維熒光光譜 固定HSA 的濃度為1.2×10-6mol/L，LUT、β-CA、LYC 的濃度為6×10-6mol/L，在310 K、200～350 nm 的激發(fā)波長(zhǎng)和250～500 nm 發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量HSA 以及加入LUT、β-CA、LYC 后的三維熒光。

1.3.3 LUT/β-CA/LYC 與人血清白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)分析 參照1.3.2 節(jié)的方法，先加入PHE/IBU，使其濃度為6.0×10-6mol/L，然后加入LUT/β-CA/LYC 后續(xù)操作與1.3.2 節(jié)相同。

1.3.4 分子對(duì)接 采用AutoDock vina 4.0 軟件研究LUT、β-CA、LYC 與HSA 對(duì)接。HSA（ID：1HA2）來(lái)源于RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)，LUT（CID：5281243）、β -CA（CID：5280489）、LYC（CID：446925）結(jié)構(gòu)來(lái)源于PubChem。通過(guò)Pymol 軟件去除HSA 結(jié)構(gòu)中存在的水，并添加H 原子。網(wǎng)格大小保持在82×104×80，間距為1 ?，以覆蓋整個(gè)受體分子。HSA 設(shè)為剛性對(duì)接，配體設(shè)為柔性對(duì)接。其它對(duì)接參數(shù)保持默認(rèn)，選擇結(jié)合能最低的對(duì)接構(gòu)象進(jìn)行評(píng)估。對(duì)接后相互作用力的分析是用Discovery Studio v17.2.0 進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)均重復(fù)設(shè)3 組，結(jié)果表示為xˉ±s，采用Origin V9.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 類胡蘿卜素對(duì)HSA 的熒光猝滅作用

圖1 為在298 K 和310 K 時(shí)，加入LUT（圖1a）、β-CA（圖1b）和LYC（圖1c）前、后的HSA 熒光發(fā)射光譜圖。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm 時(shí)，HSA 的最大發(fā)射波長(zhǎng)（λmax）在340 nm 處。隨著LUT、β-CA 和LYC 濃度的遞增，HSA 的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，且峰形無(wú)顯著變化，峰值分別下降了35.4%，72.7%和62.8%。這些結(jié)果表明LUT、β-CA 和LYC可以與HSA 發(fā)生相互作用，并且對(duì)HSA 內(nèi)源熒光強(qiáng)度的猝滅能力為β-CA>LYC>LUT。在加入LUT、β-CA 后，HSA 的λmax均發(fā)生了2 nm 的微弱藍(lán)移，而加入LYC 后最大吸收峰未發(fā)生移動(dòng)，這說(shuō)明LUT、β-CA 的存在，改變了熒光發(fā)色團(tuán)附近的微環(huán)境，疏水性增強(qiáng)。

圖1 LUT（a）、β-CA（b）、LYC（c）對(duì)HSA 熒光猝滅作用Fig.1 Fluorescence quenching of HSA by LUT（a），β-CA（a）and LYC（c）

2.2 熒光猝滅機(jī)理和結(jié)合常數(shù)

通常用熒光猝滅機(jī)理來(lái)研究HSA 和小分子之間的相互作用。熒光猝滅類型主要分為靜態(tài)和動(dòng)態(tài)[16-17]。通過(guò)Stern-Volmer 方程（1）和Acharya方程（2）分析熒光猝滅機(jī)理。

式中，F(xiàn)0——未加入LUT/β-CA/LYC 時(shí)HSA的熒光強(qiáng)度；F——加入LUT/β-CA/LYC 時(shí)HSA的熒光強(qiáng)度；[Q]——LUT/β-CA/LYC 的濃度，mol/L；Kq——雙分子猝滅速率常數(shù)，L/（mol·s）；τ0為熒光團(tuán)的平均壽命，其值為10-8s；Ksv為猝滅常數(shù)，L/mol；Ka——結(jié)合常數(shù)，L/mol；n——結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，個(gè)。

由表1 可知，R2的值越接近于1，數(shù)據(jù)越精確。根據(jù)方程（1），可計(jì)算不同條件下LUT/β-CA/LYC 與HSA 結(jié)合的猝滅常數(shù)Ksv。如表1所示，在HSA 中分別加入LUT、β-CA、LYC 后，Ksv的值與溫度呈正相關(guān)，而Kq均遠(yuǎn)大于2×1010L/（mol·s）（生物分子的最大散射碰撞猝滅常數(shù)），說(shuō)明LUT、β-CA、LYC 均對(duì)HSA 產(chǎn)生靜態(tài)猝滅，即LUT、β-CA、LYC 與HSA 結(jié)合形成了復(fù)合物[18]。根據(jù)方程（2），分別計(jì)算出LUT、β-CA、LYC 與HSA 結(jié)合常數(shù)都在104～106數(shù)量級(jí)，證明LUT、β-CA、LYC 與HSA 的結(jié)合能力均較強(qiáng)[19]，結(jié)合能力β-CA＞LYC＞LUT。如表1所示，HSA 與LUT、β-CA、LYC 的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）均在1 附近，因此可以推斷LUT、β-CA、LYC 均與HSA 均有單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

表1 LUT、β-CA、LYC 與HSA 相互作用的常數(shù)Table 1 Interaction constants of LUT，β-CA，LYC with HSA

2.3 熱力學(xué)性質(zhì)和作用力類型

熱力學(xué)參數(shù)采用Van't Hoff 方程（3）和熱力學(xué)方程（4）計(jì)算。

式中，K1——T1時(shí)蛋白與小分子的結(jié)合常數(shù)，K；K2——T2時(shí)蛋白與小分子的結(jié)合常數(shù)，L/mol；ΔH——焓變，kJ/mol；ΔG——吉布斯自由能變，kJ/mol；ΔS——熵變，J/（mol·K）；R——?dú)怏w摩爾常數(shù)，8.314 J/（mol·K）。

從理論上講，當(dāng)ΔH<0 且ΔS>0，主要作用力為靜電相互作用；當(dāng)ΔH>0，ΔS<0 時(shí)，主要作用力為靜電相互作用和疏水相互作用；當(dāng)ΔH<0，ΔS<0時(shí)，主要作用力為氫鍵與范德華力；ΔH>0，ΔS>0時(shí)，主要作用力為疏水相互作用[20]。由表2，LUT、β-CA、LYC 分別與HSA 結(jié)合時(shí)，ΔH>0，ΔS>0，ΔG增加（ΔG<0），熵變化的正值表明水分子以有序的方式排列在HSA 附近，LUT、β-CA、LYC 的相互作用使其隨機(jī)化排列[21]。ΔH為正值證實(shí)了HSA-類胡蘿卜素復(fù)合物的形成本質(zhì)上是吸熱的。ΔG的值由熱力學(xué)方程計(jì)算，其值為負(fù)表明LUT、β-CA、LYC 與HSA 的相互作用是自發(fā)的[22]。ΔS和ΔH均為正值，表明LUT、β-CA、LYC 主要通過(guò)疏水相互作用與HSA 結(jié)合，進(jìn)一步說(shuō)明了LUT、β-CA、LYC可以與HSA 發(fā)生反應(yīng)形成復(fù)合物。

表2 LUT、β-CA、LYC 與HSA 相互作用的熱力學(xué)常數(shù)Table 2 Thermodynamic constants for the interaction between LUT，β-CA，LYC with HSA

2.4 LUT、β-CA、LYC 與HSA 相互作用的同步熒光光譜

采用同步熒光光譜技術(shù)對(duì)熒光團(tuán)氨基酸殘基Trp 和Tyr 的微環(huán)境變化進(jìn)行分析。Tyr 的微環(huán)境信息在Δλ=15 nm 處獲得，而Trp 的微環(huán)境信息在Δλ=60 nm 處獲得[23]。HSA 中氨基酸殘基的λmax與環(huán)境的疏水性有關(guān)。若λmax 藍(lán)移，則HSA 暴露于疏水環(huán)境，其極性降低，反之亦然[24]。因此，可以通過(guò)觀察λmax的偏移判斷HSA 構(gòu)象的變化。

圖2所示的同步熒光光譜，伴隨LUT 濃度的升高，熒光發(fā)射光譜中記錄的Tyr 和Trp 的熒光強(qiáng)度逐漸降低，Trp 的熒光強(qiáng)度降低更顯著。Tyr殘基的λmax向長(zhǎng)波長(zhǎng)（約1 nm）方向移動(dòng)，這反映出Trp 殘基處附近的環(huán)境極性更強(qiáng)，更容易在溶劑里暴露；相反，Trp 殘基λmax的輕微藍(lán)移（約1 nm）表明其附近暴露的環(huán)境疏水性增強(qiáng)。伴隨β-CA 的加入，Trp 殘基的λmax未出現(xiàn)明顯移動(dòng)，Tyr殘基的λmax紅移了1 nm。LYC 逐漸加入后，Δλ＝60 nm 時(shí)，λmax略微藍(lán)移1 nm。以上結(jié)果可以推測(cè)出LUT、β-CA、LYC 均與HSA 發(fā)生相互作用，并且使HSA 的構(gòu)象發(fā)生了變化。

圖2 LUT（a）、β-CA（b）、LYC（c）與HSA 相互作用的同步熒光光譜Fig.2 Synchronous fluorescence spectra of HSA without and with LUT（a），β-CA（b）and LYC（c）

2.5 LUT、β-CA、LYC 與HSA 相互作用的三維熒光光譜

三維熒光光譜可同時(shí)獲取激發(fā)和發(fā)射的兩個(gè)不同維度的熒光強(qiáng)度信息，從而更全面、更直觀地觀察HSA 的結(jié)構(gòu)變化[25]。對(duì)于熒光光譜，峰a 主要反映色氨酸由于n→π*躍遷引起的光譜變化，峰b反映π→π*引起的HSA 多肽骨架的光譜變化[26]。

圖3 為HSA 以及LUT、β-CA、LYC 分別與HSA 結(jié)合后的三維熒光光譜圖。HSA 的熒光團(tuán)Trp 和Tyr 殘基在波長(zhǎng)280 nm 處激發(fā)，由峰a 表示（λex=278 nm，λem=340 nm）。多肽骨架的特征峰由峰b 表示（λex=228 nm，λem=340 nm），熒光強(qiáng)度分別為8 331 和4 510。峰b 的λmax藍(lán)移了2 nm。峰b 強(qiáng)度降低及藍(lán)移，表明HSA 中熒光基團(tuán)周圍的微環(huán)境非極性增強(qiáng)。隨著LUT 的加入，HSA 的峰a 和峰b 的熒光強(qiáng)度分別降低了3.2%和2.8%，峰a 強(qiáng)度降低，表明LUT 的加入使HSA 多肽鏈發(fā)生變化，進(jìn)而改變了HSA 的構(gòu)象；峰b 的λmax藍(lán)移2 nm，反映出HSA 熒光團(tuán)殘基的微環(huán)境被改變，非極性增強(qiáng)。隨著β-CA 的加入，HSA 的峰a和峰b 的熒光強(qiáng)度分別降低了19.52%和65.81%，峰b 的λmax 藍(lán)移4 nm，這表明β-CA 的加入改變了HSA 熒光團(tuán)殘基的微環(huán)境。隨著LYC 的加入，HSA 的峰a 和峰b 的熒光強(qiáng)度分別降低了13.42%和64.66%。以上結(jié)果均表明LUT 或β-CA 或LYC的加入，使得HSA 的構(gòu)象發(fā)生了變化。

圖3 HSA 及LUT、β-CA（c）、LYC 與HSA 相互作用的三維熒光光譜圖Fig.3 Three-dimensional fluorescence spectra of HSA（a），and the interaction of LUT，β-CA，LYC with HSA

2.6 LUT、β-CA、LYC 與HSA 結(jié)合位點(diǎn)的分析

位點(diǎn)1 和位點(diǎn)2 是HSA 的主要藥物結(jié)合位點(diǎn)。已建立的特異性位點(diǎn)標(biāo)記通常用于了解分子與HSA 的確切結(jié)合位點(diǎn)[27]。保泰松（PHE）作為IIA子域（Sudlow's site I）的既定位點(diǎn)標(biāo)記，布洛芬（IBU）作為IIIA 子域（Sudlow's site II）位點(diǎn)的熒光探針[28]。進(jìn)行位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)更加深入了解LUT、β-CA、LYC 與HSA 上這些位點(diǎn)的結(jié)合。

圖4 表示兩個(gè)熒光探針對(duì)于LUT/β-CA/LYC與HSA 結(jié)合熒光光譜的影響。如圖4所示，IBU的存在，對(duì)LUT/β-CA/LYC 與HSA 的結(jié)合沒(méi)有產(chǎn)生影響，從內(nèi)插圖可以看出IBU 的存在對(duì)HSA 猝滅率影響不大，表明LUT/β-CA/LYC 與HSA 的結(jié)合位點(diǎn)與IBU 的不同，說(shuō)明LUT/β-CA/LYC 與HSA 的結(jié)合不在亞結(jié)構(gòu)域IIIA 附近。而PHE 的存在，降低了LUT/β-CA/LYC 與HSA 的結(jié)合，表明LUT/β-CA/LYC 與HSA 的結(jié)合位點(diǎn)與PHE 的相同，在亞結(jié)構(gòu)域IIA 附近（Sudlow's site I）。

圖4 PHE 或IBU 存在下，LUT、β-CA、LYC 對(duì)HSA 熒光光譜的影響Fig.4 Fluorescence quenching of HSA by LUT，β-CA and LYC at the present of PHE or IBU

2.7 分子模擬

分子對(duì)接技術(shù)能在短時(shí)間內(nèi)提供小分子與生物大分子的結(jié)合的詳細(xì)信息，在新治療藥物的開(kāi)發(fā)中發(fā)揮積極作用[29]。利用Autodock vina 軟件分析LUT、β-CA、LYC 在HSA 上可能存在的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于每種配體，Autodock vina 分析出10 種對(duì)接結(jié)果，根據(jù)結(jié)合能最小的部位選取最佳構(gòu)象。LUT、β-CA、LYC 與HSA 結(jié)合得出的ΔG分別為-38.11 kJ/mol，-43.07 kJ/mol，-45.62 kJ/mol，由圖5可知，LUT 結(jié)合在site I 位點(diǎn)，位于主熒光Trp214附近，主要作用力為疏水相互作用與Lys195、Ala291、Trp214、Leu198、Lys199、Phe211、Ala210等殘基形成。β-CA 位于IA 與IIA 之間，主要作用力為疏水相互作用，與Leu251、Ala258、Leu284、Pro152、Leu22、Phe27、Val23 等殘基形成。LYC 位于IA 與IIA 之間，與Ala258、Pro152、Leu283、Phe27、Leu251、Val46、Phe49 等殘基形成疏水相互作用，并且為主要表現(xiàn)力。以上分析與位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)和計(jì)算的熱力學(xué)常數(shù)的結(jié)果一致。

圖5 LUT、β-CA、LYC 與HSA 的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)氨基酸及作用力Fig.5 Predicted binding sites，the binding sites amino acids and interaction forces of between LUT，β-CA，LYC with HSA

3 結(jié)論

采用熒光光譜法研究了3 種類胡蘿卜素LUT、β-CA、LYC 與HSA 的結(jié)合作用，經(jīng)過(guò)分析計(jì)算出相關(guān)信息，采用同步熒光結(jié)合三維熒光研究3 種類胡蘿卜素對(duì)HSA 構(gòu)象的影響，采用位點(diǎn)Marker 試驗(yàn)結(jié)合分子對(duì)接分析結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明，LUT、β-CA、LYC 對(duì)HSA 均產(chǎn)生猝滅作用，表現(xiàn)為靜態(tài)猝滅，其中β-胡蘿卜素對(duì)HSA 有最強(qiáng)的猝滅作用，最大的結(jié)合常數(shù)，說(shuō)明β-胡蘿卜素與HSA 更容易結(jié)合；熱力學(xué)參數(shù)分析表明LUT、β-CA、LYC 與HSA 主要通過(guò)疏水相互作用結(jié)合；同步熒光結(jié)合三維熒光結(jié)果說(shuō)明3 種類胡蘿卜素影響了HSA 的構(gòu)象；位點(diǎn)研究表明，LUT、β-CA、LYC 與HSA 的結(jié)合位點(diǎn)位于亞結(jié)構(gòu)域ⅡA 附近。研究證明，LUT、β-CA、LYC 均可以與HSA 結(jié)合，這將為探究類胡蘿卜素體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，活性保護(hù)載體開(kāi)發(fā)提供思路。