王虎玄，彭中花，王 聰，朱亞南，孫宏民

（陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 西安 710021）

魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是一種常見的食品腐敗酵母，具有嗜糖、耐酸等生理特性，可引起濃縮水果汁、蜂蜜、果醬等腐敗變質(zhì)[1]。團隊前期從濃縮蘋果汁（70°Brix，pH 3.5）和濃縮海紅果汁（68°Brix，pH 3.4）中均分離出魯氏接合酵母，并證實該菌能夠在兩種濃縮汁中生長，可見其污染能力極強，危害較大[2-3]。魯氏接合酵母污染，不僅改變食品外觀，影響風(fēng)味，降低營養(yǎng)價值，而且能代謝食品中糖分產(chǎn)氣，造成食品脹包。尤其是玻璃、金屬等密封包裝，嚴重脹包會導(dǎo)致包裝爆裂，對消費者安全危害極大?；诖?，開發(fā)高效、安全的控制方法，及時預(yù)防、消除食品加工與貯存中魯氏接合酵母污染，具有重要的意義。

食品加工與貯存中主要通過添加食品防腐劑控制微生物污染，然而，當前應(yīng)用廣泛的食品防腐劑大多是化學(xué)合成品，具有抗菌效果差，可被微生物降解以及對人體具有潛在毒性等應(yīng)用弊端。隨著人們對食品營養(yǎng)健康與質(zhì)量安全要求的提高，開發(fā)天然、高效的新型食品防腐劑引起全球相關(guān)科研工作者的廣泛關(guān)注[4-5]。香芹酚（圖1）是牛至、百里香等植物精油中的活性成分，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準為“公認安全”的抗菌物質(zhì)，也被列入我國GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》，作為香精香料允許在食品中添加。研究表明，香芹酚對微生物具有高效抗菌活性，這種高效抗菌作用與香芹酚的疏水性及其結(jié)構(gòu)中酚羥基的親水性有關(guān)[6]。團隊前期以山梨酸鉀、苯甲酸鈉等傳統(tǒng)食品防腐劑為參比，從多酚類、黃酮類、醌類等數(shù)十種植物源天然化合物中篩選對魯氏接合酵母具有高效抗菌活性的化合物，發(fā)現(xiàn)香芹酚具有強大的抗菌作用[7]。此外，團隊前期研究發(fā)現(xiàn)香芹酚對蘋果汁（30°Brix，pH 3.5）中高污染量魯氏接合酵母【約6.3 lg（CFU/mL）】的生長表現(xiàn)出比山梨酸鉀、苯甲酸鈉、多羥基肉桂酸等更強的抑制活性[1]?？梢钥闯?，香芹酚作為一種潛在的天然食品防腐劑，在高效控制魯氏接合酵母污染方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，香芹酚具體通過何種途徑對魯氏接合酵母發(fā)揮高效抗菌活性，尚不完全清楚。

圖1 香芹酚結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of carvacrol

細胞死亡包括程序性死亡（細胞凋亡）和非程序死亡（細胞壞死）。目前有關(guān)香芹酚抗菌機制的研究主要聚焦在微生物細胞壞死方面，包括香芹酚損傷微生物細胞屏障結(jié)構(gòu)與功能，破壞核酸和蛋白質(zhì)合成與功能，干擾細胞能量代謝等[8-9]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)一些天然物質(zhì)如殼聚糖、聚賴氨酸、姜黃素等可通過誘導(dǎo)微生物細胞凋亡發(fā)揮抗菌活性[10-11]。那么，在香芹酚對魯氏接合酵母發(fā)揮抗菌活性的過程中，是否存在程序性死亡（細胞凋亡）尚不清楚。

本文通過測定抑菌圈直徑、最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，并采用掃描電鏡觀察魯氏接合酵母細胞形態(tài)變化，明確香芹酚對魯氏接合酵母的抗菌活性。通過檢測細胞凋亡系列典型生化和形態(tài)特征以及凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄水平變化，揭示香芹酚誘導(dǎo)魯氏接合酵母凋亡的抗菌機制。研究結(jié)果旨在為充分解析香芹酚的抗菌機制提供新思路，也為新型食品防腐劑的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌株 魯氏接合酵母模式菌株ATCC 2623，購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），保存于-70 ℃。

1.1.2 試劑 二甲基亞砜（DMSO）、氯化鈉、D-山梨醇、戊二醛、無水乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、葡萄糖，均為分析純級，天津市科密化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；香芹酚（≥99.9%）、溶壁酶、兩性霉素B，上海源葉生物科技有限公司；AnnexinV-FITC/PI 檢測試劑盒、活性氧試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、Caspase 抑制劑Z-VADFMK、一步法TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒、Fluo-3AM 鈣離子熒光探針、BeyoFastTMSYBR Green One-Step qRT-PCR Kit，碧云天生物技術(shù)有限公司；香芹酚母液（10 mg/mL）：取香芹酚原液溶于DMSO 中，稀釋定容至20 mL，0.22 μm 有機濾膜過濾，4 ℃保存待用。

1.1.3 儀器 Beckmancoulter-xl.mcl 流式細胞儀，美國Thermo 公司；Victor Nivo 酶標儀，芬蘭PerkinElmer 公司；Phenom Pro-臺式掃描電鏡，飛納科學(xué)儀器（上海）有限公司；Mygo Pro-實時熒光定量PCR，美國BioRad 公司；TGL-16B 離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；PL-203 電子天平，梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；XFH-50CA 滅菌鍋，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；PWSIO-002 恒溫培養(yǎng)箱，重慶試驗設(shè)備廠；Vortex-2 渦旋混勻儀，上海瀘析實業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種復(fù)蘇 將凍存的魯氏接合酵母ATCC 2623 從-70 ℃冰箱中取出，融化后將菌液轉(zhuǎn)移至YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min 培養(yǎng)24 h。取微量培養(yǎng)液接種于YPD 平板進行培養(yǎng)，確認無雜菌后挑單菌落接種于YPD 液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h 后，再次轉(zhuǎn)接于YPD 液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期（細胞濃度約1.0×106CFU/mL）后用于后續(xù)試驗。

1.2.2 抑菌圈測定 使用牛津杯進行抑菌圈測定[12]。向平板中倒入一層YPD 半固體培養(yǎng)基，待其凝固后，用無菌鑷子將牛津杯（d= 8 mm）垂直放在培養(yǎng)基表面。YPD 固體培養(yǎng)基降至35 ℃左右，加入酵母菌液（終濃度約2×104CFU/mL），混勻后倒入平板。待YPD 固體培養(yǎng)基凝固后拔出牛津杯，向牛津杯孔中加入100 μL 香芹酚溶液（10 mg/mL）。28 ℃培養(yǎng)48 h 后測量抑菌圈直徑。

1.2.3 MIC 及MFC 測定 采用雙倍稀釋法測定MIC 和MFC[13]。用YPD 培養(yǎng)液將香芹酚母液（10 mg/mL）連續(xù)雙倍稀釋至不同質(zhì)量濃度（10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.156，0.078 mg/mL）。向96 孔板中分別加入100 μL 不同質(zhì)量濃度香芹酚溶液和100 μL 菌液（終濃度約5×105CFU/mL），香芹酚終質(zhì)量濃度分別為5，2.5，1.25，0.625，0.31250.156，0.078，0.039 mg/mL。28 ℃培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。觀察孔中溶液顏色，無顏色變化孔所對應(yīng)的香芹酚最低質(zhì)量濃度為香芹酚對魯氏接合酵母的MIC 值。吸取MIC 以上質(zhì)量濃度處理的菌液進行YPD 平板涂布，28 ℃培養(yǎng)48 h 后觀察有無菌落形成，無菌落形成的最低質(zhì)量濃度為MFC。

1.2.4 魯氏接合酵母形態(tài)觀察 收集對數(shù)生長期魯氏接合酵母細胞，PBS 洗滌3 次，離心（8 000 r/min，5 min）收集細胞。不同濃度（0、MIC、MFC）香芹酚處理魯氏接合酵母細胞4 h 后，離心收集細胞。戊二醛（2.5%）固定過夜，PBS 洗滌3 次后進行乙醇梯度脫水（30%，50%，70%，90%，100%），離心收集細胞，自然風(fēng)干后掃描電鏡觀察。

1.2.5 魯氏接合酵母脫壁處理 由于熒光探針不能透過酵母細胞壁進入胞內(nèi)，后續(xù)細胞凋亡系列典型生化和形態(tài)特征檢測前需進行酵母脫壁處理。參考蔡瑾[14]的方法進行魯氏接合酵母脫壁處理。收集對數(shù)生長期魯氏接合酵母細胞，PBS 洗滌3 次后重懸于PBS 中。酵母懸液加入香芹酚（終濃度分別為0、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC），處理（28 ℃，200 r/min）4 h，離心收集細胞（8 000 r/min，5 min）。PBS 洗滌3 次后加入溶壁酶（終濃度為200 U/mL），28 ℃處理45 min 后離心收集細胞。PBS 洗滌后離心得到魯氏接合酵母原生質(zhì)體細胞。

1.2.6 胞內(nèi)活性氧（ROS）水平檢測 取1.2.5 節(jié)處理好的魯氏接合酵母原生質(zhì)體細胞（約1.0×106CFU），加入終濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA 探針，渦旋混勻，28 ℃振蕩孵育30 min 后離心收集細胞。PBS 洗滌并重懸魯氏接合酵母細胞，采用流式細胞儀（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）檢測DCF 熒光細胞的百分比和熒光強度。設(shè)置兩性霉素B 處理組（0.1 mg/mL）為陽性對照。

1.2.7 胞內(nèi)鈣濃度檢測 取1.2.5 節(jié)處理好的魯氏接合酵母原生質(zhì)體細胞（約1.0×106CFU），加入終濃度為5 μmol/L 的Fluo-3AM 探針，渦旋混勻，28 ℃振蕩孵育60 min 后離心收集細胞。PBS 洗滌并重懸魯氏接合酵母細胞，繼續(xù)孵育30 min 以確保Fluo-3AM 在胞內(nèi)完全轉(zhuǎn)化成Fluo-3。采用酶標儀（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）檢測熒光強度。設(shè)置兩性霉素B 處理組（0.1 mg/mL）為陽性對照。

1.2.8 線粒體膜電位（MMP）檢測 取1.2.5 節(jié)處理好的魯氏接合酵母原生質(zhì)體細胞（約1.0×106CFU），加入0.5 mL JC-1 染色工作液，渦旋混勻，28 ℃振蕩孵育20 min 后離心收集細胞。JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌并重懸魯氏接合酵母細胞，流式細胞儀（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）檢測線粒體膜電位水平。設(shè)置兩性霉素B 處理組（0.1 mg/mL）為陽性對照。

1.2.9 半胱氨酸蛋白酶活性檢測 參考蔡瑾的方法[14]進行半胱氨酸蛋白酶活性檢測。采用半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Z-VAD-FMK，終濃度20 μmol/L）預(yù)處理對數(shù)生長期魯氏接合酵母細胞（約1.0×106CFU）1 h，PBS 洗滌后離心收集細胞。MIC 濃度香芹酚處理魯氏接合酵母細胞4 h，PBS 洗滌3 次后將細胞重懸于生理鹽水（0.9%）中，連續(xù)10 倍梯度稀釋，取10 μL 不同稀釋度細胞懸液點接于YPD 平板。28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察魯氏接合酵母生長情況。

1.2.10 磷酯酰絲氨酸（PS）外翻檢測 取1.2.5 節(jié)處理好的魯氏接合酵母原生質(zhì)體細胞（約1.0×106CFU），加入195 μL AnnexinV-FITC 結(jié)合液重懸細胞，再加入5 μL AnnexinV-FITC 工作液，最后加入10 μL 碘化丙啶（PI）工作液，渦旋混勻后室溫避光孵育30 min。采用流式細胞儀檢測（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）FITC 熒光細胞百分比和熒光強度。設(shè)置兩性霉素B 處理組（0.1 mg/mL）為陽性對照。

1.2.11 細胞核DNA 片段化檢測 取1.2.5 節(jié)處理好的魯氏接合酵母原生質(zhì)體細胞（約1.0×106CFU），將細胞用免疫染色固定液在20 ℃固定30 min，PBS 洗滌后離心收集細胞。采用免疫染色通透液重懸細胞，4 ℃孵育10 min，PBS 洗滌后離心收集細胞。加入50 μL TUNEL 檢測液（5 μL TdT酶和45 μL 熒光標記物），28 ℃避光孵育60 min，PBS 洗滌并重懸細胞。采用流式細胞儀（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）檢測綠色熒光細胞的百分比和熒光強度。設(shè)置兩性霉素B 處理組（0.1 mg/mL）為陽性對照。

1.2.12 凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄水平檢測 取1.2.5 節(jié)處理好的魯氏接合酵母原生質(zhì)體細胞（約1.0×106CFU），按照試劑盒說明書提取總RNA，并采用BeyoFastTM SYBR Green One-Step qRTPCR Kit 進行cDNA 合成和qRT-PCR 檢測。PCR體系為20 μL（10 μL PCR 緩沖液、2 μL 聚合酶混合物、2 μL 正向引物、2 μL 反向引物、2 μL 模板、2 μL 去離子水）。首先進行cDNA 合成（50 ℃，30 min），隨后進行qRT-PCR 檢測（95 ℃預(yù)變性2 min；40 個循環(huán)：95 ℃變性17 s，60 ℃退火30 s；72℃延長1 min）。采用2-△△Ct法計算目的基因相對轉(zhuǎn)錄水平。用于qRT-PCR 的引物由上海碧云天生物科技有限公司設(shè)計并合成，引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR 引物的序列Table 1 Sequence of primers used for qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以均值±標準差（n=3）表示。采用SPSS 軟件進行方差分析，P<0.05表示差異顯著（Duncan's 多重比較）。

2 結(jié)果與討論

2.1 香芹酚對魯氏接合酵母的抑菌活性

香芹酚對魯氏接合酵母的抑菌圈直徑為（13.67 ± 0.58）mm（圖2），MIC 和MFC 分別為0.156 mg/mL 和0.3125 mg/mL，說明香芹酚對食品腐敗酵母魯氏接合酵母具有一定抑菌活性?；谠撛囼灲Y(jié)果，與其它植物源活性物質(zhì)如阿魏酸（MIC=17 mg/mL）、對香豆酸（MIC=1.23 mg/mL）、肉桂酸（MIC=0.35 mg/mL）、香草醛（MIC＞2.28 mg/mL）、檸檬醛（MIC=0.17 mg/mL，MFC=0.34 mg/mL）、檸檬烯（MIC=0.66 mg/mL，MFC=2.64 mg/mL）以及丁香酚（MIC=0.43 mg/mL，MFC=0.86 mg/mL）等相比[15-16]，香芹酚對魯氏接合酵母具有較強的抑菌活性。團隊前期研究也發(fā)現(xiàn)香芹酚對蘋果汁（30°Brix，pH 3.5）中高污染量魯氏接合酵母【約6.3 lg（CFU/mL）】的生長表現(xiàn)出比山梨酸鉀、苯甲酸鈉、多羥基肉桂酸等更強的抑制活性[1]。香芹酚是牛至、百里香等植物精油中的活性成分，對微生物具有高效抗菌活性，這種高效抗菌作用與香芹酚的疏水性及其結(jié)構(gòu)中酚羥基的親水性有關(guān)[6]。因此，香芹酚在高效防控食品中魯氏接合酵母污染方面具有重要的應(yīng)用價值。在后續(xù)實際應(yīng)用中，以聚乳酸、聚乙烯醇等可降解材料為基材，以香芹酚為抗真菌劑，制備食品活性包裝膜。通過香芹酚的緩釋持續(xù)抑制魯氏接合酵母在濃縮果汁等食品表面的生長，不僅可解決香芹酚水溶性差、易揮發(fā)等應(yīng)用弊端，還可避免香芹酚無法在高黏度濃縮果汁等食品表面有效分散的問題。

圖2 香芹酚對魯氏接合酵母生長的影響Fig.2 Effect of carvacrol on the growth of Z.rouxii

2.2 香芹酚對魯氏接合酵母細胞形態(tài)的影響

如圖3所示，空白對照組（圖3a）中魯氏接合酵母細胞形態(tài)為典型的出芽酵母，外觀橢圓形、飽滿、表面光滑無凹陷；MIC（圖3b）或MFC（圖3c）香芹酚處理后，魯氏接合酵母細胞形態(tài)產(chǎn)生褶皺，表明香芹酚影響魯氏接合酵母細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu)，也進一步證明香芹酚對魯氏接合酵母具有抗菌活性。此外，MFC 香芹酚處理后魯氏接合酵母細胞完整性良好，未出現(xiàn)明顯細胞破裂，初步推斷香芹酚可能并不通過誘導(dǎo)魯氏接合酵母細胞壞死發(fā)揮抗菌活性。

圖3 香芹酚對魯氏接合酵母細胞形態(tài)的影響Fig.3 Effect of carvacrol on the cell morphology of Z.rouxii

2.3 香芹酚對魯氏接合酵母胞內(nèi)ROS 含量的影響

采用熒光探針（DCFH-DA）檢測胞內(nèi)活性氧水平。DCFH-DA 本身沒有熒光，進入細胞后被胞內(nèi)酯酶水解生成DCFH，DCFH 可被胞內(nèi)ROS 氧化生成DCF。DCF 具有熒光，通過流式細胞儀可對DCF 熒光細胞的百分比及熒光強度進行檢測。如圖4所示，空白對照及陽性對照組中DCF 熒光細胞的百分比分別為（2.68 ± 0.03）%，（63.87 ±1.89）%；經(jīng)1/4MIC、1/2MIC 和MIC 香芹酚處理后，DCF 熒光細胞的百分比分別顯著提高至（10.27 ± 0.48）%，（14.60 ± 0.76）%和（52.77 ±2.58）%（P<0.05）；并且DCF 熒光強度隨著香芹酚質(zhì)量濃度升高逐漸升高（圖譜逐漸右移）。上述結(jié)果表明香芹酚可通過濃度依賴的方式促進魯氏接合酵母胞內(nèi)活性氧的累積。

圖4 香芹酚對魯氏接合酵母胞內(nèi)活性氧的影響Fig.4 Effect of carvacrol on the intracellular ROS in Z.rouxii

線粒體是產(chǎn)生ROS 等啟動細胞凋亡信號分子的主要細胞器，在細胞凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。ROS，尤其是羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2-），被廣泛認為是真菌細胞中與許多凋亡途徑相關(guān)的關(guān)鍵細胞死亡調(diào)節(jié)因子[11]。系統(tǒng)生物學(xué)和細胞調(diào)控通路分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗真菌藥物在不同藥物靶標相互作用的模式下均能觸發(fā)羥自由基的形成，最終引發(fā)細胞凋亡[17]。胞內(nèi)ROS 過量累積被認為是最早參與細胞凋亡的生理變化之一，其通過氧化核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子對細胞活力產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致一系列的凋亡反應(yīng)[18]。ROS 誘導(dǎo)的細胞損傷已被證明是天然活性物質(zhì)（槲皮素、姜黃素、殼聚糖等）對霉菌（黃曲霉、毛狀角囊菌等）和酵母菌（白色念珠菌、釀酒酵母等）發(fā)揮抗菌活性過程中常見的生化現(xiàn)象和主要的抗菌方式[11，19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)香芹酚以劑量依賴的方式誘導(dǎo)魯氏接合酵母胞內(nèi)ROS 水平顯著增加?；诖耍琑OS 水平升高是否引發(fā)魯氏接合酵母細胞氧化應(yīng)激并觸發(fā)凋亡尚待進一步確認。后續(xù)通過測定MMP 去極化、PS 外翻、DNA 片段化等系列典型凋亡特征，進一步探討香芹酚對魯氏接合酵母的抗菌機制。

2.4 香芹酚對魯氏接合酵母胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

Fluo-3AM 是最常用的檢測胞內(nèi)Ca2+濃度的熒光探針之一。Fluo-3AM 進入細胞后，被細胞內(nèi)酯酶裂解形成Fluo-3，與胞質(zhì)Ca2+結(jié)合產(chǎn)生熒光，采用酶標儀檢測其熒光強度即可表征胞內(nèi)Ca2+濃度。如圖5所示，與空白對照組相比，經(jīng)1/4 MIC、1/2 MIC 和MIC 香芹酚處理后，魯氏接合酵母細胞熒光強度隨著香芹酚濃度的增加而顯著升高（P< 0.05），表明香芹酚可促進魯氏接合酵母胞內(nèi)Ca2+濃度升高。

圖5 香芹酚對魯氏接合酵母胞內(nèi)鈣離子濃度的影響Fig.5 Effect of carvacrol on the level of intracellular calcium in Z.rouxii

胞內(nèi)Ca2+在調(diào)控細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。在正常細胞中，約80%的Ca2+儲存在液泡、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等鈣庫中。當細胞受到外源性凋亡刺激后，Ca2+從鈣庫釋放到細胞質(zhì)中，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+水平升高。此時線粒體依賴其膜電位的變化吸收胞質(zhì)Ca2+，導(dǎo)致線粒體Ca2+超載，繼而擾亂線粒體內(nèi)氧化還原反應(yīng)和ATP 合成，引發(fā)MMP 去極化、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）的形成與開放、線粒體細胞色素C（cyt c）釋放、基因調(diào)控的信號級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生以及最終的細胞凋亡[21-22]。哺乳動物細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+可通過蘭尼堿受體（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+通道）泄漏，導(dǎo)致線粒體Ca2+超載和細胞凋亡[23]。外源性刺激構(gòu)巢曲霉細胞后引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致Ca2+通過鈣通道從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔釋放到胞質(zhì)中，最終造成凋亡[24]。在酵母細胞中，液泡中Ca2+儲存量相對較高，液泡被認為是酵母胞內(nèi)主要鈣庫。因此，液泡鈣通道可能在調(diào)控胞質(zhì)和線粒體Ca2+紊亂引發(fā)的凋亡中扮演重要角色。此外，胞內(nèi)Ca2+超載也可能與ROS 增加有關(guān)。ROS 氧化脂質(zhì)后，細胞膜通透性增強，引發(fā)胞外Ca2+內(nèi)流[25]。目前，Ca2+在天然活性物質(zhì)誘導(dǎo)釀酒酵母、黃曲霉、灰葡萄孢等微生物凋亡研究中受到越來越多的關(guān)注[19，24]。本研究發(fā)現(xiàn)香芹酚以劑量依賴的方式引發(fā)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，提示胞內(nèi)Ca2+超載可能是香芹酚誘導(dǎo)魯氏接合酵母凋亡的早期信號。

2.5 香芹酚對魯氏接合酵母細胞MMP 的影響

熒光探針JC-1 被廣泛用于線粒體膜電位水平的檢測。對正常細胞而言，JC-1 進入細胞后聚集在線粒體基質(zhì)中，形成紅色熒光J-聚合物（圖6流式細胞圖C2 象限）；當MMP 去極化引發(fā)細胞凋亡時，J-聚合物從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，形成綠色熒光JC-1 單體（圖6 流式細胞圖C4 象限）；通過檢測J-聚合物與JC-1 單體熒光細胞數(shù)比值（FL2/FL1）的變化趨勢可表征MMP 是否發(fā)生去極化。如圖6所示，空白對照及陽性對照組MMP 去極化細胞的百分比分別為（9.37±0.71）%和（64.4±1.06）%；經(jīng)1/4 MIC、1/2 MIC 和MIC 香芹酚處理后，MMP 去極化細胞百分比分別顯著提高至（23.20±0.85）%，（42.17±0.82）%和（65.03±1.37）%（P<0.05）；并且JC-1 單體熒光強度隨著香芹酚質(zhì)量濃度升高逐漸升高（圖譜逐漸右移）。對FL2/FL1 進行計算，如圖6f所示，空白對照及陽性對照組FL2/FL1 分別為9.58 ± 0.85 和0.49 ± 0.05；經(jīng)香芹酚處理后，F(xiàn)L2/FL1 分別顯著降低至3.25±0.12，1.36±0.05 和0.52±0.03（P<0.05）。上述結(jié)果表明香芹酚可通過質(zhì)量濃度依賴的方式促進魯氏接合酵母MMP 去極化。

圖6 香芹酚對魯氏接合酵母線粒體膜電位的影響Fig.6 Effects of carvacrol on the MMP in Z.rouxii

MMP 通常是表征線粒體能量偶聯(lián)狀況的敏感指標，凋亡細胞胞內(nèi)ROS 水平升高和Ca2+紊亂可觸發(fā)MMP 去極化[25]。MMP 去極化表明線粒體功能出現(xiàn)障礙，通常伴有線粒體腫脹、線粒體脊線缺失、氧化磷酸化鏈解偶聯(lián)、胞內(nèi)ATP 合成受到抑制等[11，26]。此外，MMP 去極化促進線粒體MPTP形成和開放，引發(fā)促凋亡因子如cyt c、Aif1p（凋亡誘導(dǎo)因子）等釋放到細胞質(zhì)中，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子損傷，最終造成細胞凋亡[18]。因此，MMP 去極化被認為是最早的細胞凋亡事件之一。本研究發(fā)現(xiàn)香芹酚通過降低MMP 引發(fā)魯氏接合酵母線粒體不可逆去極化，這可能是由于線粒體中ROS 過度積累和線粒體Ca2+超載，啟動線粒體線性過度和去能，最終導(dǎo)致MMP 崩潰[14]。

2.6 香芹酚對魯氏接合酵母細胞 半胱氨酸蛋白酶活性的影響

采用泛半胱氨酸蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK檢測半胱氨酸蛋白酶活性。Z-VAD-FMK 穿透細胞膜進入胞內(nèi)后可抑制由半胱氨酸蛋白酶激活導(dǎo)致的細胞凋亡。結(jié)果如圖7所示，與空白對照組相比，MIC 香芹酚雖可顯著抑制魯氏接合酵母生長，但Z-VAD-FMK 預(yù)處理可減弱香芹酚的抑菌活性，說明香芹酚可激活魯氏接合酵母細胞半胱氨酸蛋白酶，也表明香芹酚可能依賴半胱氨酸蛋白酶誘導(dǎo)魯氏接合酵母凋亡。

圖7 香芹酚對魯氏接合酵母半胱氨酸蛋白酶活性的影響Fig.7 Effect of carvacrol on the action of metacaspase in Z.rouxii

半胱氨酸蛋白酶是細胞質(zhì)中一類結(jié)構(gòu)相似的家族蛋白，其重要的共同特征是活性位點都含有半胱氨酸，因此被稱為半胱氨酸蛋白酶。該酶保守的半胱氨酸側(cè)鏈通過特異性裂解與天冬氨酸接觸的蛋白底物驅(qū)動催化反應(yīng)，一些半胱氨酸蛋白酶的活化被認為是參與哺乳動物細胞凋亡的關(guān)鍵過程之一[27]。雖然在真菌細胞中未發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶，但其結(jié)構(gòu)同源物已被發(fā)現(xiàn)在真菌、原生動物和植物細胞中具有觸發(fā)凋亡的作用[28]。半胱氨酸蛋白酶的激活可開啟多種凋亡現(xiàn)象，包括凋亡蛋白酶水解信號的級聯(lián)觸發(fā)、細胞骨架坍塌和DNA片段化等，因此被認為是早期凋亡的典型生化標志之一[21]。通過序列比對，團隊前期在魯氏接合酵母ATCC 2623 基因組中發(fā)現(xiàn)一個編碼序列（ZYRO0F10802g）與釀酒酵母中編碼半胱氨酸蛋白酶的Yca1基因序列高度相似，提示魯氏接合酵母中可能也存在半胱氨酸蛋白酶（未發(fā)表）。本研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚影響魯氏接合酵母線粒體穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致胞內(nèi)ROS 和Ca2+水平升高以及線粒體MMP 去極化。因此，推測線粒體紊亂引發(fā)線粒體cyt c 釋放到細胞質(zhì)中與半胱氨酸蛋白酶結(jié)合，繼而激活半胱氨酸蛋白酶，開啟凋亡進程，最終導(dǎo)致魯氏接合酵母凋亡。

2.7 香芹酚對魯氏接合酵母細胞PS 的影響

采用Annexin V-FITC 和PI 雙染法檢測PS外翻。當細胞發(fā)生早期凋亡時，細胞膜上的PS 由質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻到外側(cè)，可通過檢測胞外PS 暴露表征早期凋亡。Annexin V-FITC 是一種用熒光基團FITC 標記的磷脂結(jié)合蛋白，對PS 具有很強的親和力。PI 染料不能透過正常細胞的完整細胞膜，然而當細胞壞死后發(fā)生破裂，PI 進入胞內(nèi)使細胞染色。采用Annexin V-FITC 和PI 對細胞進行雙染，通過流式細胞儀可區(qū)分正常細胞（圖8 流式細胞圖B3 象限）、凋亡細胞（圖8 流式細胞圖B4 象限）和壞死細胞（圖8 流式細胞圖B2 象限）。如圖8所示，空白對照及陽性對照組FITC 熒光細胞的百分比分別為（2.6±0.08）%，（78.90±0.65）%；經(jīng)1/4MIC、1/2MIC 和MIC 香芹酚處理后，F(xiàn)ITC 熒光細胞百分比分別顯著提高至（16.17 ± 0.25）%，（69.17±0.74）%和（83.47±0.82）%（P<0.05），說明香芹酚可通過質(zhì)量濃度依賴的方式引發(fā)魯氏接合酵母細胞PS 外翻。此外，不同質(zhì)量濃度香芹酚處理后PI 熒光細胞百分比顯著低于陽性對照組（圖8f），說明香芹酚主要引起魯氏接合酵母凋亡，并未導(dǎo)致細胞壞死（細胞破裂）。

圖8 香芹酚對魯氏接合酵母磷脂酰絲氨酸的影響Fig.8 Effects of carvacrol on the PS in Z.rouxii

哺乳動物和真菌細胞早期凋亡時，細胞膜磷脂雙分子層的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化。正常生理條件下，磷脂不對稱分布于細胞膜內(nèi)外側(cè)，PS 主要分布于細胞膜內(nèi)側(cè)。磷脂的不對稱分布主要由細胞膜上的兩種酶維持。ATP 依賴的氨基磷脂轉(zhuǎn)位酶（Translocase）特異性將PS 和磷脂酰乙醇酰胺（PE）轉(zhuǎn)運到細胞膜內(nèi)小葉，同時ATP 依賴的轉(zhuǎn)位酶（Floppase）則將PS 和磷脂酰膽堿（PC）轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜外小葉，然而轉(zhuǎn)位酶的轉(zhuǎn)運速率比氨基磷脂轉(zhuǎn)位酶慢10 倍，導(dǎo)致細胞膜磷脂的不對稱分布[29]。由于細胞凋亡過程中氨基磷脂轉(zhuǎn)位酶活性大幅下降，膜脂的不對稱性被破壞，造成PS 外翻[21]。因此，PS 外翻已成為凋亡細胞的重要形態(tài)標志之一。本研究通過Annexin V-FITC 和PI 雙染檢測發(fā)現(xiàn)香芹酚誘導(dǎo)PS 暴露于魯氏接合酵母細胞膜外小葉，表明香芹酚可能引發(fā)魯氏接合酵母細胞早期凋亡。

2.8 香芹酚對魯氏接合酵母細胞DNA 的影響

采用TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）法進行DNA 斷裂檢測。細胞發(fā)生凋亡時，胞內(nèi)一些DNA 內(nèi)切酶被激活，剪斷基因組DNA，導(dǎo)致大量的DNA 斷裂。暴露的3'-OH 在末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）的催化下加上綠色熒光探針熒光素（FITC）標記的dUTP（Fluorescein-dUTP），從而通過流式細胞儀檢測發(fā)生DNA 斷裂細胞的百分比。如圖9所示，空白對照及陽性對照組FITC熒光細胞的百分比分別為（1.60±0.03）%和（4.26±0.07）%；經(jīng)1/4 MIC、1/2 MIC 和MIC 香芹酚處理后，F(xiàn)ITC 熒光細胞的百分比顯著提高至（2.44 ±0.06）%，（5.66 ± 0.05）%和（10.44 ± 0.08）%（P<0.05），說明香芹酚通過濃度依賴的方式誘導(dǎo)魯氏接合酵母細胞DNA 斷裂。

圖9 香芹酚對魯氏接合酵母DNA 的影響Fig.9 Effects of carvacrol on DNA in Z.rouxii

細胞受到凋亡誘導(dǎo)信號刺激時，線粒體MPTP打開并釋放凋亡誘導(dǎo)因子Aif1p。在易位到細胞核后，Aif1p 通過其DNA 結(jié)合域直接作用于基因組DNA，與來自線粒體的另一種細胞死亡誘導(dǎo)因子Nuc1p 協(xié)同導(dǎo)致DNA 片段化[30]。在酵母細胞中，Aif1p 不僅誘導(dǎo)不依賴半胱氨酸蛋白酶的凋亡，而且還與半胱氨酸蛋白酶和cyt c 協(xié)同作用誘導(dǎo)凋亡。DNA 損傷還與胞內(nèi)ROS 積累有關(guān)，ROS 通過誘導(dǎo)生成丙二醛損傷DNA[21]。此外，一些植物源化合物通過類似于EB 插入DNA 的方式影響DNA結(jié)構(gòu)，或通過靜電作用與DNA 相互作用，造成DNA 損傷[31]。DNA 損傷進一步導(dǎo)致凋亡小體的形成和細胞體積的減小，最終引發(fā)凋亡。因此，DNA片段化被認為是晚期細胞凋亡的細胞學(xué)標志。本研究發(fā)現(xiàn)香芹酚可導(dǎo)致魯氏接合酵母胞內(nèi)ROS水平升高、線粒體紊亂以及半胱氨酸蛋白酶激活，提示魯氏接合酵母DNA 片段化可能是由ROS 氧化、線粒體凋亡誘導(dǎo)因子切割以及半胱氨酸蛋白酶激活核酸內(nèi)切酶共同作用的結(jié)果。整體來看，本研究表明香芹酚在魯氏接合酵母早期和晚期凋亡中對細胞生化和形態(tài)變化有顯著影響，香芹酚通過半胱氨酸蛋白酶依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)魯氏接合酵母凋亡。

2.9 香芹酚對魯氏接合酵母凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄的影響

以18S rDNA為內(nèi)參，采用qRT-PCR 檢測香芹酚對魯氏接合酵母凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果如圖10所示，與空白對照相比，MIC 香芹酚處理導(dǎo)致促凋亡因子Yca1、Dnm1、Cyc1、Nuc1與Ndi1 相對表達量上調(diào)1～4 倍，進一步證實香芹酚可誘導(dǎo)魯氏接合酵母凋亡。

圖10 香芹酚對魯氏接合酵母凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄的影響Fig.10 Effects of carvacrol on the transcription level of key regulators of apoptosis in Z.rouxii

酵母細胞凋亡不僅表現(xiàn)出與哺乳動物細胞相似的形態(tài)和生化特征，而且具有相似的關(guān)鍵調(diào)控因子。YOR197W 蛋白Yca1p 被認為是釀酒酵母中哺乳動物半胱氨酸蛋白酶的同源蛋白，在誘導(dǎo)細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[32]。AMID 是一種位于哺乳動物細胞線粒體外膜的凋亡誘導(dǎo)蛋白，可在細胞核周圍聚集并引發(fā)染色體收縮。位于線粒體膜內(nèi)的NADH 脫氫酶Ndi1p 是AMID 的酵母同源物，具有促進酵母凋亡的功能[33]。EndoG 是哺乳動物細胞編碼核基因的一種DNA 酶，參與線粒體DNA 復(fù)制。凋亡刺激時，EndoG 從線粒體轉(zhuǎn)移到細胞核，導(dǎo)致DNA 片段化。Nuc1p 是EndoG 的酵母同源物，是位于線粒體上的細胞死亡誘導(dǎo)因子。與EndoG 類似，在凋亡過程中，Nuc1p 轉(zhuǎn)移到細胞核中切割DNA，引起DNA 斷裂[34]。線粒體分裂是哺乳動物細胞凋亡的原因之一，受線粒體分裂蛋白Drp1p 的調(diào)控。在不同死亡因素的刺激下，Drp1的酵母同源物Dnm1 在線粒體破裂和降解之前可誘導(dǎo)凋亡[14]。在本研究中，MIC 香芹酚處理導(dǎo)致Yca1、Dnm1、Nuc1、Ndi1 和Cyc1 轉(zhuǎn)錄上調(diào)，進一步證實香芹酚通過半胱氨酸蛋白酶依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)魯氏接合酵母凋亡。

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)研究了植物源活性物質(zhì)香芹酚對食品腐敗酵母魯氏接合酵母的抗菌活性，并首次從細胞凋亡的角度深入解析了其潛在的抗菌機制。結(jié)果表明，香芹酚可能通過半胱氨酸蛋白酶依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)魯氏接合酵母凋亡（圖11），從而發(fā)揮高效抗菌活性：香芹酚誘導(dǎo)魯氏接合酵母胞內(nèi)ROS 和Ca2+水平升高，是魯氏接合酵母細胞凋亡的早期信號；香芹酚誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS 和Ca2+水平升高可能直接影響線粒體穩(wěn)態(tài)并損傷DNA，導(dǎo)致MMP 去極化；MMP 去極化可能促進線粒體cyt c 釋放到細胞質(zhì)中，導(dǎo)致半胱氨酸蛋白酶激活，從而觸發(fā)細胞凋亡進程，包括PS 外翻和DNA 片段化等。本研究表明香芹酚在食品防腐保鮮方面具有重要的應(yīng)用價值。

圖11 香芹酚誘導(dǎo)魯氏接合酵母凋亡的潛在機制Fig.11 The potential mechanism of carvacrol-induced apoptosis in Z.rouxii