孫廣玲，劉俊麗，吳 迪，劉雨新，姜 嬌，2，3，宋育陽，2，3*

（1 西北農林科技大學葡萄酒學院 陜西楊凌 712100 2 西北農林科技大學合陽葡萄試驗示范站 陜西合陽 715300 3 西北農林科技大學寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗示范站 寧夏永寧 750104）

羧酸是糖酵解和三羧酸循環(huán)等中央代謝途徑的中間體，在所有細胞的代謝中起著關鍵作用。酵母羧酸代謝的研究在食品以及制藥和生物醫(yī)學等行業(yè)均非常重要[1-2]，其中關于羧酸轉運蛋白的探究更是酵母羧酸代謝研究的關鍵環(huán)節(jié)。

酵母羧酸轉運蛋白雖有很長的研究歷史，但主要集中于一元酸和二元酸的轉運方面，關于三羧酸轉運體方面的研究目前仍相對欠缺。首個乳酸攝取轉運蛋白在產朊假絲酵母（Candida utilis）[3]和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[4]中被發(fā)現(xiàn)，相關基因被命名為JEN1[5]，經綠色熒光蛋白定位，發(fā)現(xiàn)其在酵母細胞膜上發(fā)揮功能且受葡萄糖抑制[6]，且轉錄因子Sok2p 也參與其調控[7]。其次從乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）中鑒定出兩個JEN1同源物，一個編碼單羧酸乳酸和丙酮酸的單羧酸轉運蛋白（KlJEN1），另一個編碼二元羧酸蘋果酸和琥珀酸的二羧酸轉運蛋白（KlJEN1）[8-9]，在白色念珠菌（Candida albicans）中也存在類似的轉運蛋白[10]。這些JEN1同源物的系統(tǒng)發(fā)育分析表明羧酸轉運蛋白存在兩個功能簇，分別包含功能特征的單羧酸和二羧酸兩種功能的轉運蛋白[1-2]。近幾年，發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）編碼的6 個JEN家族基因序列與單羧酸、二羧酸和三羧酸（乳酸、丙酮酸、富馬酸、蘋果酸、琥珀酸和檸檬酸）的轉運均有關系[11]。畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）存在兩種PkJEN 蛋白均具有轉運二元羧酸的功能，可有效將琥珀酸、富馬酸和L-蘋果酸等羧酸導入細胞[12]。另外，在1986年Osothsilp 等[13]于粟酒裂殖酵母中第一次發(fā)現(xiàn)酵母中存在蘋果酸轉運蛋白。酵母中羧酸滲透酶基因命名為MAE1[14]。解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）的Gpr1（TC 2.A.96.1.2）是第一個在酵母中鑒定的AceTr家族成員[15]，研究顯示與乙酸敏感性、細胞和菌落形態(tài)、細胞壽命有關[16]，轉錄受葡萄糖抑制，通過熒光顯微鏡定位在質膜上[17]。然而，酵母中關于檸檬酸轉運體的研究較少，Cássio 等[18-19]在1991年首次在產朊假絲酵母中發(fā)現(xiàn)檸檬酸的高親和力和低親和力轉運系統(tǒng)。雖并未對其進行基因定位，但研究證明轉運系統(tǒng)受到葡萄糖抑制。解脂耶氏酵母中同樣發(fā)現(xiàn)了可將檸檬酸轉進胞內的檸檬酸轉運蛋白[11]。近期，在畢赤酵母中發(fā)現(xiàn)PJEN2-2 蛋白的392WCVQGGLGVVPS 403 片段具有明顯的檸檬酸轉運活性[12]。以上的研究結果均表明非釀酒酵母中羧酸轉運蛋白依舊存在巨大的探索空間。

東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）是一種非釀酒酵母，可以在高酸條件下生長，并被用于生產各種有機酸[20-22]，并且以東方伊薩酵母為基礎模型研究遺傳工具箱等研究也有了一定的進展。前期篩選獲得的東方伊薩酵母具有良好降酸能力[23]，可應用于獼猴桃、柑橘、山楂等高酸果酒的釀造?；卺劸莆⑸锏纳锝邓岱椒?，因其具有對酒質負面影響小、成本低、操作簡單等特點，受到果酒釀造行業(yè)的高度關注，是現(xiàn)代果酒綠色釀造的重要發(fā)展方向。如今，生物信息學已經成為動植物[25]、真菌[26]以及人類[27-28]乃至于細菌和病毒[29]等分子機制研究的熱點分析工具。本文利用生物信息學技術手段對東方伊薩酵母羧酸轉運蛋白進行探索，并運用基因工程手段于去除內源性羧酸轉運蛋白的釀酒酵母中進行驗證與鑒定。本試驗結果對羧酸轉運蛋白基因的研究提供理論依據(jù)和技術支持，對解析非釀酒酵母及其降酸機理具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及引物 本研究所用到引物序列如表1所示，已經構建成功的重組酵母及攜帶的質粒信息如表2所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the study

（續(xù)表1）

表2 本研究構建的質粒及重組酵母菌株Table 2 Plasmids and recombinant yeast strains constructed in this study

（續(xù)表2）

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 葡萄糖，廣東光華科技股份有限公司；胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸粉，奧博星生物技術有限公司；氯化鈉、乳酸，四川西隴科學有限公司；無氨基酵母氮源（YNB）、瓊脂、蘋果酸，Solarbio 公司；檸檬酸，Aladdin 公司；潮霉素抗生素、G418 抗生素、氨芐青霉素溶液，上海源葉生物科技有限公司；尿嘧啶（URA），TAKARA 公司。

YPD 培養(yǎng)基配制方法如下：20 g/L 葡萄糖、20 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母浸粉；YPL 培養(yǎng)基配制方法如下：10 g/L 乳酸、20 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母浸粉；YPM 培養(yǎng)基配制方法如下：10 g/L 蘋果酸、20 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母浸粉；YPC 培養(yǎng)基配制方法如下：10 g/L 檸檬酸、20 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母浸粉；LB 培養(yǎng)基配制方法如下：10 g/L 氯化鈉、10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母浸粉，加入去離子水配置液體LB 培養(yǎng)基，20 g/L 瓊脂配置固體LB 培養(yǎng)基；LB-AMP 培養(yǎng)基配制方法如下：在LB 培養(yǎng)基基礎上添加體積分數(shù)為1‰氨芐青霉素溶液；SD-URA培養(yǎng)基配制方法如下：20 g/L 的葡萄糖、1.7 g/L 的YNB、0.77 g/L 的URA，pH 值調至6.8，加入20 g/L瓊脂配置固體SD-URA 培養(yǎng)基。YPD-G418 培養(yǎng)基：以YPD 為基礎，每毫升添加1 μL 質量濃度為200 mg/mL 的G418 抗生素；YPD-Hyg 培養(yǎng)基：以YPD 為基礎，每毫升添加3 μL 質量濃度為100 mg/mL 的潮霉素抗生素。

1.2 儀器與設備

DYY-10C 型電泳儀，北京市六一儀器廠；C1000 型PCR 儀，BioRAD 公司；LC-10ATVP 型液相色譜儀，日本島津公司；Lecia TCS SP 8 型生物激光共聚焦顯微鏡，德國萊卡公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學挖掘與分析

1.3.1.1 NCBI 比對 通過NCBI 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），檢索解脂耶氏酵母編碼具有轉運不同羧酸功能的質膜羧酸轉運體基因片段。對東方伊薩酵母膜基因組BLAST 比對，篩選東方伊薩酵母候選編碼細胞膜羧酸轉運蛋白編碼基因[30]。

1.3.1.2 跨膜螺旋預測 通過TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測候選羧酸轉運蛋白編碼基因跨膜螺旋結構[31]。

1.3.1.3 系統(tǒng)進化樹構建 系統(tǒng)發(fā)育樹是生物信息學中尋找物種間進化關系的重要方法。通過MEGA 7.0 軟件制作[32-33]候選羧酸轉運蛋白編碼基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 候選片段質粒重構 將質粒pY26 進行雙酶切，以pYES2-eGFP為模板，通過同源臂引物PY-eGFP-F、PY-eGFP-R；EcoRⅠ-eGFP-F、eGFP-R 擴增不同同源臂eGFP基因；以東方伊薩酵母GS1-1基因組為模板，使用帶有同源臂的引物PM1-f 和PM1-r、PM2-f 和PM2-r、PM3-f 和PM3-r、PM4-f 和PM4-r、PM5-f 和PM5-r 分別擴增候選羧酸轉運蛋白編碼片段M1、M2、M3、M4、M5 的DNA 序列，并以東方伊薩酵母GS1-1基因組為模板，使用同源臂引物L-eM1-F 和e-M1-R、GS linker-M2-F 和e-M2-R、GS linker-M3-F 和e-M3-R、GS linker-M4-F 和e-M4-R、GS linker-M5-F 和e-M5-R 分別擴增GS linker-M1、GS linker-M2、GS linker-M3、GS linker-M4、GS linker-M5 的DNA 序列。將帶有同源臂的eGFP 分別與GS linker-M1、GS linker-M2、GS linker-M3、GS linker-M4、GS linker-M5 DNA 序列通過Overlap 體系進行連接，形成帶有同源臂的eGFPGS linker -M1、eGFP-GS linker -M2、eGFP-GS linker-M3、eGFP-GS linker-M4、eGFP-GS linker-M5 DNA 序列。將帶有同源臂的eGFP序列、候選羧酸轉運蛋白（M1、M2、M3、M4、M5）、綠色熒光蛋白片段與候選檸檬酸轉運蛋白連接片段（eGFPGS linker -M1、eGFP-GS linker -M2、eGFP-GS linker-M3、eGFP-GS linker-M4、eGFP-GS linker-M5）的DNA 序列及線性化質粒骨架同源重組連接，構建成功的質粒轉入感受態(tài)DH5α 后，通過LB-Amp 培養(yǎng)基進行篩選，菌落PCR 驗證后，活化陽性菌株提取的質粒后進行PCR 驗證，將驗證正確的重組質粒送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.3 雙缺失菌株的構建 為去除單倍體釀酒酵母BY4741 中JEN1和ADY2負責羧酸轉運的基因，使用Cre-LoxP 系統(tǒng)敲除。通過引物JLKL-F、JLKL-R 和引物ALHL-F、ALHL-R 分別從質粒pUG6 和pUG6SH 擴增構建帶有JEN1基因兩側同源臂的loxP-KanMX-loxP 和帶有ADY2基因兩側同源臂的loxP-HphMX-loxP。ScJEN1的兩端同源臂由釀酒酵母基因組DNA 擴增，隨后在loxPKanMX-loxP 模塊的兩側連接以生成JEN1基因敲除框。從釀酒酵母基因組DNA 擴增的ScADY2片段與loxP-HphMX-loxP 模塊連接以生成ADY2基因敲除框，雙缺失菌株構建流程如圖1所示。

圖1 雙缺失菌株構建流程圖Fig.1 Flow chart for the construction of double deletion strains

通過醋酸鋰轉化法[34]，根據(jù)圖2 分別進行ADY2、JEN1基因的敲除并驗證。破壞ADY2基因，使用帶有潮霉素（Hyg）標記基因的BY4741，隨機挑取在YPD-Hyg 平板上生長的單菌落，提取基因組DNA，以基因組DNA 為模板，用引物對QADY2 -F 和 QADY2 -R、ADY2HpHMX -F 和ADY2HpHMX-R、ADY2QY-F 和ADY2QY-R 對單敲除菌株進行PCR 驗證。通過YPD-Hyg 培養(yǎng)基篩選成功敲除的陽性菌株，下文稱為B△A。通過上述方法破壞B△A 中的JEN1基因，使帶有G418 標記基因，隨機挑取在YPD-G418 平板上生長的單菌落，提取基因組DNA，以基因組DNA 為模板，用引物對QJEN1-F 和QJEN1-R、JEN1Kan-MX-F 和JEN1KanMX-R、JEN1QY-F 和JEN1QYR 對雙敲除候選菌株進行PCR 驗證。通過YPDHyg-G418 培養(yǎng)基篩選成功敲除的陽性菌株稱為B△A△J。

圖2 缺陷型菌株敲除原理及驗證流程圖Fig.2 Defective strain knockout principle and verification flow chart

1.3.4 重構質粒的轉化 經過PCR 驗證成功的大腸桿菌單菌落，使用LB-AMP 液體培養(yǎng)基增殖擴培并進行質粒提取。采用醋酸鋰轉化法[34]，將已連接成功的重組質粒pY26-ZL1、pY26-ZL2、pY26 -ZL3、pY26 -ZL4、pY26 -ZL5、pY26 -eGFP、pY26-eGFP-ZL1、pY26-eGFP-ZL2、pY26-eGFPZL3、pY26-eGFP-ZL4、pY26-eGFP-ZL5 分別轉入BY4741 及雙敲除菌株B△A△J 后涂布至SD-URA、SD-URA-G418-Hyg 固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿在30 ℃下孵育2～3 d，挑取單菌落活化，提取酵母內質粒進行PCR 驗證。

1.3.5 綠色熒光蛋白定位 使用激光共聚焦顯微鏡觀察酵母內轉化質粒展示效果。用50 mL 的SD-URA-G418-Hyg 液體培養(yǎng)基于30 ℃培養(yǎng)重組酵母48 h 后，取5 μL 菌液制片[35]。

1.3.6 表型驗證 相應培養(yǎng)基活化酵母單菌落，采用血球計數(shù)板計數(shù)，以1×107CFU/mL 接種量分別接種至YPD、YPL、YPM、YPC 液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)120 h。

1.3.7 有機酸含量的測定 采用高效液相色譜法測定發(fā)酵過程中及發(fā)酵結束后有機酸含量[23]。

2 結果與分析

2.1 候選羧酸轉運蛋白的確定及生物信息學分析

已有研究表明[11]，解脂耶氏酵母中存在6 個編碼質膜羧酸轉運體的基因片段，將東方伊薩酵母質膜基因組與該6 個基因片段進行比對，獲得5 個高分匹配片段，具體見表3。

表3 東方伊薩酵母候選質膜檸檬酸轉運蛋白Table 3 I.orientalis suspected plasma membrane citrate transporter

由表4 可知候選羧酸轉運蛋白的長度，5 條候選羧酸轉運蛋白均含有10 條跨膜螺旋數(shù)，根據(jù)跨膜螺旋預期的氨基酸數(shù)，預測為跨膜蛋白，通過蛋白質的前60 個氨基酸中跨膜螺旋的預期氨基酸數(shù)目，判斷候選羧酸轉運蛋白在膜上的概率均大于96%，綜上所述，篩選得到的5 條候選羧酸轉運蛋白存在位于質膜的跨膜螺旋。

表4 跨膜螺旋預測結果數(shù)據(jù)表Table 4 Data table of prediction results of transmembrane spiral

對所篩選5 組基因繪制系統(tǒng)進化樹，進化樹如圖3所示。圖中起始節(jié)點代表共同祖先，分支的節(jié)點代表假定祖先，分支長度反應互相之間的同源關系，數(shù)值代表該節(jié)點下樹結構的置信程度。由于多篇文獻[2，11-12]對非釀酒酵母質膜羧酸轉運體的研究均始于膜蛋白組與釀酒酵母SCJEN1序列的比對，故構建系統(tǒng)進化樹是非常必要的。進化樹除了反映5 個片段與釀酒酵母SCJEN1具有高度同源性以外，還可以看到2、4 片段相近，其次與5 號片段次接近，而與1、3 片段較近；這代表它們很可能執(zhí)行不同功能，比如一個轉運二羧酸一個轉運三羧酸。5 組片段都與乳酸克魯維酵母的KLJEN2有極高的的同源性，提示本試驗所篩選片段很可能執(zhí)行二、三羧酸質膜轉運功能，說明質膜羧酸轉運蛋白的多樣化很可能是非釀酒酵母代謝功能多樣化的一個基礎。

圖3 基于部分已驗證為羧酸轉運蛋白片段的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on partially verified fragments of carboxylic acid transporters

2.2 PCR 擴增及質粒重構結果

目標片段PCR 反應體系反應結束后進行凝膠電泳驗證，擴增片段特異性初步鑒定良好。菌落PCR 凝膠電泳電泳結果良好。在生工生物工程（上海）股份有限公司進行的測序結果正確。

2.3 羧酸轉運蛋白重組菌的獲得

為驗證單敲除、雙敲除菌株構建結果，根據(jù)圖1、2 敲除原理及驗證方式，進行敲除框擴增驗證，電泳條帶JEN1LKL PCR 和ADY2LHL PCR 分別為1 839 bp，1 921 bp，電泳條帶長度正確，說明正確構建BΔA 工程菌；由于電泳驗證條帶長度正確，表明BΔAΔJ 雙敲除菌株構建成功。根據(jù)驗證成功獲得雙敲除缺陷型菌株。

通過驗證陽性轉化菌株，電泳條帶長度正確，為正確陽性轉化菌株，為后續(xù)表型驗證提供基礎材料。

2.4 利用激光共聚焦顯微鏡羧酸轉運蛋白的定位

為了進一步探究成功轉化的羧酸轉運蛋白的定位，在激光共聚焦顯微鏡下觀察重組酵母中綠色熒光蛋白所在的位置。如圖4所示，對照組中的B-PY26、BΔAΔJ-PY26 沒有觀察到綠色熒光；BPY26-eGFP、BΔAΔJ-PY26-eGFP表達的綠色熒光蛋白滯留在細胞質中；試驗組重組酵母BeGFP-ZL1、B-eGFP-ZL4、B-eGFP-ZL5、BΔAΔJeGFP-ZL1、BΔAΔJ-eGFP-ZL4、BΔAΔJ-eGFP-ZL5綠色熒光蛋白定位于細胞膜。本研究結果與以往羧酸轉運蛋白利用熒光顯微鏡定位結果相一致[6-7，17]。

圖4 GFP 在重組酵母中的定位Fig.4 Localization of GFP in recombinant yeasts

2.5 表型及特異性驗證

為了確定候選羧酸轉運蛋白的轉運功能及轉運特異性，不同碳源條件下培養(yǎng)重組菌株，在吸光值為600 nm 下測定的菌體細胞密度，菌株生長量如圖5所示。在以葡萄糖為唯一碳源的條件下酵母菌株生長狀態(tài)良好，東方伊薩酵母GS1-1 在葡萄糖為唯一碳源條件下菌體細胞密度約是以羧酸為唯一碳源時菌株量的3 倍，說明在不同羧酸條件下，菌體細胞密度均受到羧酸不同程度的抑制。陰性對照BY4741、陰性對照BAJ 在羧酸為唯一碳源條件時幾乎無法正常生長，表明該菌株內不存在相應羧酸轉運蛋白，或存在相應轉運蛋白但缺少代謝途徑中重要的調控因子。

圖5 不同碳源條件下菌株生長量Fig.5 Growth of strains under different carbon sources

相同碳源條件下，不同菌株生長量如下表5可知，葡萄糖為碳源，菌株生長量無顯著性差異，說明插入候選片段對各菌株在基本培養(yǎng)基條件下生長無影響且生長狀態(tài)良好；乳酸條件下，陽性對照菌株GS1-1 與其它菌株存在顯著性差異，陰性對照與工程菌無顯著性差異，說明候選片段與乳酸的轉運代謝無關；蘋果酸條件下，BZL4 與陽性對照菌株GS1-1 無顯著性差異且與BY4741 存在顯著性差異，BAJZL5 與陽性對照菌株GS1-1 無顯著性差異且與BAJ 存在顯著性差異，表明候選片段4、5 與蘋果酸的轉運代謝相關；檸檬酸條件下，陽性對照菌株GS1-1 與其它菌株存在顯著性差異，BZL3 菌株與陰性對照BY4741 菌株呈現(xiàn)顯著性差異，且與陽性對照GS1-1 也存在顯著性差異。BAJZL1 菌株與陰性對照BAJ 菌株呈現(xiàn)顯著性差異，且與陽性對照GS1-1 也存在顯著性差異，表明候選片段1、3 與檸檬酸的轉運代謝相關。

表5 相同碳源條件下菌株生長量及其單因素分析Table 5 Strain growth and its single factor analysis under the same carbon source condition

不同羧酸條件下菌株羧酸含量及降酸率分析結果見表6。不同菌株在羧酸培養(yǎng)基中，降酸羧酸含量呈現(xiàn)差異顯著。蘋果酸條件下，BAJZL3、BAJZL4 和BAJZL5 與陰性對照BAJ 存在顯著性差異，且上述3 株工程菌株降酸率均為40%以上；檸檬酸條件下，BAJZL1 與陰性對照BAJ 檸檬酸含量存在顯著性差異，且上述工程菌株檸檬酸含量與陽性對照GS1-1 存在顯著性差異。綜上，根據(jù)相同碳源不同菌株菌株生長量（OD600nm）的顯著性分析以及結合相同碳源羧酸含量顯著性數(shù)據(jù)分析可知，目的片段4 為蘋果酸羧酸轉運蛋白；目的片段1 是檸檬酸轉運蛋白。

表6 不同菌株在不同碳源條件下降酸效果Table 6 The acid reduction effect of different strains under different carbon source conditions

為探究菌株生長量（OD600nm）及菌株降酸率是否存在關聯(lián)性，根據(jù)雙變量Pearson 檢驗相關性數(shù)據(jù)分析可知，二者呈現(xiàn)大致相同的變化趨勢，二者呈極顯著（r=0.528**，P<0.01）即菌株生長狀況越好，其降酸能力越強。因此，在發(fā)酵結果驗證中，可通過觀察菌株生長狀況來大致確定菌株的降酸能力。

3 結論

生物信息學技術手段可有效挖掘東方伊薩酵母潛在的羧酸轉運蛋白，且分析數(shù)據(jù)可靠，對于挖掘鑒定潛在片段具有一定參考意義。本試驗在雙敲除羧酸轉運蛋白的釀酒酵母中進行東方伊薩酵母候選羧酸轉運蛋白的驗證，根據(jù)綠色熒光蛋白定位，發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮功能區(qū)域為細胞膜上，符合先前對于羧酸轉運蛋白在酵母體內的定位分析。確定候選片段4 為蘋果酸羧酸轉運蛋白；候選片段1是檸檬酸轉運蛋白。本文成功利用生物信息學手段，挖掘并鑒定到東方伊薩酵母潛在的二、三羧酸轉運蛋白片段，拓展了酵母羧酸轉運蛋白家族成員，進一步解析了東方伊薩酵母的降酸機制，為探索非釀酒酵母的降酸機理奠定了理論基礎。