師 聰，陳學(xué)紅，李 茹，王雅楠，解春芝

（徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院 江蘇徐州 221018）

覆盆子（Rubus idaeusL.）屬于薔薇科懸鉤子屬的一種植物，主要分布于我國安徽、江蘇、浙江等地[1]。覆盆子為藥食同源[2]，有很長的使用歷史，具有抗衰老、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂等作用[3]。另外，還可以調(diào)節(jié)人的生殖系統(tǒng)功能，起到補(bǔ)腎固精、助陽縮尿的作用[4]。覆盆子具有很高的藥用及保健價(jià)值，近年來被應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)[5]。

覆盆子中不僅含有人體所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，還含有許多重要的生物活性成分[6]。黃酮類和酚酸類化合物是覆盆子中主要活性成分，目前對于覆盆子中主要活性成分的研究，通常用有機(jī)溶劑提取后，測定提取物中總酚和總黃酮含量，并在體外評價(jià)其抗氧化活性[7-8]。然而，人體胃腸道消化過程與有機(jī)溶劑提取活性成分的過程區(qū)別很大，前者是在胃的酸性環(huán)境和腸弱堿性環(huán)境中，通過體內(nèi)消化酶的消化作用，使活性物質(zhì)釋放出來[9]，而后者依據(jù)的是相似相溶的原理。體外模擬胃腸消化系統(tǒng)是一種基于人體生理消化機(jī)能，用來模擬食物在胃腸中消化的生物學(xué)研究，具有操作簡單、易行、試驗(yàn)周期較短的優(yōu)點(diǎn)[10-11]。許多研究者采用體外模擬胃腸消化方法評價(jià)食物的抗氧化活性[12-14]。目前關(guān)于覆盆子在體外模擬胃腸消化過程中抗氧化成分及其活性的變化未見報(bào)道。本文通過模擬胃腸消化系統(tǒng)，評價(jià)覆盆子總黃酮和總酚在模擬胃腸消化過程中的釋放規(guī)律，采用DPPH 自由基清除能力、羥自由基清除能力和總還原能力評價(jià)其抗氧化能力，為覆盆子的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

覆盆子，天側(cè)堂旗艦店；沒食子酸、胃蛋白酶、蘆丁、DPPH、胰酶，上海宸鴻生物技術(shù)有限公司；硝酸鋁、氯化鈉、鹽酸、福林酚、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇，華歐試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-BA 雙功能數(shù)顯恒溫振蕩器，上海子期實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；752N 紫外-可見分光光度計(jì)，森亞儀器儀表公司；TD4 臺式離心機(jī)，上海坤誠科學(xué)儀器有限公司；FE28 酸度計(jì)，曉曉儀器公司；FA2104N 電子天平，蘇州江東精密儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 體外模擬胃消化 參考王智能等[15]的方法并略有修改。稱取胃蛋白酶3.2 g 和氯化鈉2.0 g于燒杯中，用鹽酸和水混合溶液溶解，調(diào)節(jié)溶液的pH=1.2，再定容至1 000 mL，靜置過夜后，即得胃消化液。胃消化處理：稱取1.0 g 覆盆子樣品，按固液比1∶15 加入模擬胃消化液，充分混勻，置于37℃、120 r/min 的恒溫振蕩器中分別振蕩0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，在4 500 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15 min 后，收集上清液備用。用不加胃蛋白酶的溶液作胃酸對照組，用氯化鈉溶液做空白對照組。

1.3.2 體外模擬腸消化 參考李杰等[16]的方法并略有修改。稱取6.8 g 的磷酸二氫鉀于燒杯中，加入250 mL 水溶解，然后加入190 mL 0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液，再加入10 g 胰酶，調(diào)節(jié)溶液的pH=7.5±0.1，最后定容至1 000 mL，即得模擬腸消化液。腸消化處理：稱取1.0 g 覆盆子樣品，按固液比1∶15 加入模擬腸消化液，待充分混勻后，置于37℃、120 r/min 的恒溫振蕩器中分別振蕩0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，在4 500 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15 min 后，收集上清液備用。用不加胰酶的溶液作空白對照組。

1.3.3 覆盆子總黃酮含量檢測 采用NaNO2-Al（NO3）3法測定總黃酮含量[17]。在波長510 nm 處測定不同含量蘆丁溶液的吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=10.439x+0.0011（R2=0.9997），x為蘆丁溶液的含量，y為蘆丁溶液吸光度，不同含量蘆丁與吸光度的線性關(guān)系良好。根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中總黃酮含量，最終表示為每克干樣品中蘆丁（RE）含量。

1.3.4 覆盆子總酚含量檢測 采用福林-酚法的測定總酚含量[18]，在波長765 nm 處測定不同沒食子酸吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=98.143x+0.0146（R2=0.9973），x為沒食子酸含量，y為沒食子酸溶液吸光度，不同含量的沒食子酸與吸光度的線性關(guān)系良好。根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中總酚含量，最終表示為每克干樣品中沒食子酸（GAE）含量。

1.3.5 覆盆子胃腸消化產(chǎn)物抗氧化活性

1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力 參考文獻(xiàn)[19]和[20]的方法，在5 mL 試管中，加入2 mL 的0.04 mg/mL DPPH 溶液，再移入2 mL 樣品溶液混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm 處測定吸光度記為A1；按上述步驟，吸取2 mL 無水乙醇和2 mL 樣品溶液混勻，測定吸光度記為A2；用無水乙醇代替樣品溶液，測定吸光值為A0。DPPH 自由基清除率公式如下：

1.3.5.2 羥自由基清除能力 采用水楊酸法，利用Fenton 反應(yīng)測定羥自由基清除能力[21-22]，在10 mL 試管中，加入6 mmol/L H2O2溶液和相同濃度的FeSO4溶液各1 mL，再移取1 mL 樣品溶液于10 mL 試管中混勻，室溫反應(yīng)10 min，最后向試管中加入6 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液3 mL 混勻，在波長510 nm 處測定吸光度值記為A2；按上述步驟，用等體積的去離子水代替樣品溶液，測定吸光度記為A0；用等體積去離子水代替水楊酸作對照組，測定吸光度記為A1。羥自由基清除率公式同式（1）。

1.3.5.3 總還原力 采用普魯士藍(lán)還原法[23-25]，吸取1 g/100 mL K3Fe（CN）6溶液和樣品溶液各1 mL 于5 mL 試管中混合均勻，50 ℃條件下反應(yīng)20 min 后用10%三氯乙酸終止反應(yīng)，再向試管中加入0.1 g/100 mL 氯化鐵溶液0.4 mL 靜置顯色10 min，在波長700 nm 處測定吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有指標(biāo)測定均重復(fù)3 次，采用Microsoft office Excel 2013 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Sigma Plot 10.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 覆盆子體外模擬胃腸消化中總黃酮釋放量的變化

模擬胃消化過程中總黃酮的釋放量如圖1所示，在胃消化0.5 h 內(nèi)，總黃酮釋放量顯著升高之后趨于穩(wěn)定，胃液消化總黃酮釋放量大于胃酸總黃酮釋放量，空白對照在消化過程中總黃酮釋放量沒有顯著變化，這表明在總黃酮的釋放過程中，胃蛋白酶起主要作用，同時(shí)胃酸也能促進(jìn)總黃酮的釋放。模擬胃消化3 h 過程中，覆盆子總黃酮最大釋放量為22.90 mg RE/g，為模擬胃消化0 h 總黃酮釋放量（9.04 mg RE/g）的2.53 倍，為胃酸對照組總黃酮釋放量最大值（11.39 mg RE/g）的2.01倍，為空白對照組總黃酮釋放量最大值（11.12 mg RE/g）的2.06 倍。模擬胃酸消化最大總黃酮釋放量（11.39 mg RE/g）為胃酸消化0 h 的1.26 倍。模擬腸消化過程中總黃酮釋放量如圖2所示，在模擬消化過程中，腸液消化組和空白對照組總黃酮釋放量整體呈下降趨勢，腸液消化組的總黃酮釋放量始終大于空白對照組，這表明胰酶可以促進(jìn)總黃酮釋放。體外模擬腸消化過程中覆盆子總黃酮最大釋放量為14.52 mg RE/g，為模擬腸消化0 h 總黃酮釋放量（16 mg RE/g）的0.91 倍，為空白對照組最大總黃酮釋放量（12.74 mg RE/g）的1.14 倍。

圖1 覆盆子體外模擬胃消化過程中總黃酮釋放量的變化Fig.1 Changes of total flavonoids release during gastric digestion simulated by raspberry in vitro

圖2 覆盆子體外模擬腸消化過程中總黃酮釋放量的變化Fig.2 Changes of total flavonoids release during intestinal digestion simulated by raspberry in vitro

覆盆子總黃酮雖在模擬胃消化過程中釋放量增加，在模擬腸消化過程中總黃酮釋放量降低，但總黃酮釋放量仍大于空白對照。這與從彥麗等[26]在梨的模擬消化研究中的結(jié)果相似，總黃酮主要在胃消化過程中釋放，在腸消化過程出現(xiàn)大量降解?？赡苁怯捎谠诘蚿H 值的環(huán)境下，分子之間的作用力減小促進(jìn)了總黃酮的釋放。另外，胃蛋白酶和胰酶都可以水解蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)共價(jià)和非共價(jià)結(jié)合的黃酮類物質(zhì)可能被釋放出來[27]。模擬腸消化總黃酮釋放量降低，這可能是由于胰酶與結(jié)合態(tài)的酚類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致酸性多酚大量降解，也可能異構(gòu)為其它堿性條件下穩(wěn)定的形式，釋放的總黃酮小于降解的總黃酮，導(dǎo)致總黃酮含量降低[6]。

2.2 覆盆子體外模擬胃腸消化中總酚釋放量的變化

模擬胃消化過程中總酚釋放量的變化如圖3所示，在模擬胃消化和胃酸消化過程中，覆盆子總酚釋放量明顯上升。模擬胃消化組最大總酚釋放量為37.5 mg GAE/g，為模擬胃消化0 h 總酚釋放量（30.57 mg GAE/g）的1.23 倍，為胃酸對照組總酚釋放量最大值（35.8 mg GAE/g）的1.05 倍，為空白對照組總酚釋放量最大值（33.8 mg GAE/g）的1.11 倍。模擬胃酸消化最大總酚釋放量（35.80 mg GAE/g）為胃酸消化0 h 的1.17 倍。模擬胃液消化總酚釋放量大于胃酸消化大于空白對照，這表明胃蛋白酶和胃酸同樣可以促進(jìn)總酚的釋放。覆盆子體外模擬腸消化過程中總酚釋放量的變化如圖4所示，腸液消化和空白對照組總酚釋放量整體呈下降趨勢，腸液消化組的總酚釋放量大于空白對照組，這表明胰酶同樣能夠促進(jìn)總酚釋放。體外模擬腸消化3 h 后，覆盆子總酚釋放量為34.12 mg GAE/g，為模擬腸消化0 h 總酚釋放量（36.88 mg GAE/g）的0.93 倍，為空白對照組消化3 h后總酚釋放量（26.7 mg GAE/g）的1.28 倍。

圖3 覆盆子體外模擬胃消化過程中總酚釋放量的變化Fig.3 Changes of total polyphenol release during gastric digestion simulated by raspberry in vitro

圖4 覆盆子體外模擬腸消化過程中總酚釋放量的變化Fig.4 Changes of total polyphenol release during intestinal digestion simulated by raspberry in vitro

覆盆子在體外模擬胃消化過程中總酚釋放量增加，在模擬腸消化過程中總酚釋放量降低，這與從彥麗等[28]研究的柑橘體外模擬胃腸消化總酚釋放變化規(guī)律一致。模擬消化后總酚釋放量提高的原因可能是由于較低的pH 值及模擬胃的蠕動均可以降低覆盆子粒徑，分子間的作用力減小，有利于總酚的釋放[28]。另外，一部分與多酚氫鍵或疏水結(jié)合的蛋白質(zhì)被胃蛋白水解，促進(jìn)了結(jié)合多酚的釋放[29]。在模擬腸消化過程中胰酶雖可能繼續(xù)使結(jié)合態(tài)多酚釋放為游離態(tài)，但是酚酸不穩(wěn)定容易降解在堿性環(huán)境條件下，因此腸液消過程中的總酚釋放量沒有增加。在腸消化空白組，可能由于結(jié)合態(tài)多酚的釋放已經(jīng)平衡，酚酸降解導(dǎo)致總酚的含量降低[9]。

2.3 覆盆子體外模擬胃腸消化中DPPH 自由基清除率的變化

體外模擬胃消化過程中DPPH 自由基清除率大小的變化如圖5所示，模擬胃消化組和胃酸對照組DPPH 自由基清除率逐漸增加。在模擬胃消化3 h 過程中，DPPH 自由基清除率最大為95.25%，為胃消化0 h（92.55%）的1.03 倍，為胃酸最大清除率（94.58%）的1.01 倍，為空白對照組最大清除率（94.09%）的1.01 倍。模擬胃酸消化最大DPPH自由基清除率（94.58%）為胃酸消化0 h 的1.02倍。模擬胃液消化組的DPPH 自由基清除率大于胃酸對照組和空白對照組。在模擬腸消化過程中如圖6所示，覆盆子腸液消化組在1 h 內(nèi)清除率達(dá)到最大值為74.08%，為腸消化0 h（68.52%）的1.08 倍，1 h 后趨于穩(wěn)定，而空白對照組在消化0.5 h 出現(xiàn)顯著性下降，隨后上升并趨于穩(wěn)定，自由基清除率最大值為67.29%。

圖5 覆盆子在體外模擬胃消化中DPPH 自由基清除率的變化Fig.5 DPPH free radical scavenging rate of raspberry in vitro simulated gastric digestion

圖6 覆盆子在體外模擬腸消化中DPPH 自由基清除率的變化Fig.6 DPPH radical scavenging rate of raspberry in vitro simulated intestinal digestion

2.4 覆盆子體外模擬胃腸消化中羥自由基清除率的變化

體外模擬胃消化過程中羥自由基清除率大小的變化如圖7所示，在模擬胃環(huán)境消化0.5 h 內(nèi)，模擬胃消化組和胃酸對照組羥自由基清除率顯著增大，消化2 h 模擬胃消化組清除率達(dá)到最大為44.14%，為胃消化0 h（36.31%）的1.22 倍，為胃酸對照組最大清除率（40.84%）的1.08 倍，為空白對照組最大清除率（38.4%）的1.15 倍。模擬胃酸消化最大羥自由基清除率（40.84%）為胃酸消化0 h的1.12 倍。羥自由基清除率大小為模擬胃液消化組大于胃酸對照組及空白對照組。在模擬腸環(huán)境消化階段如圖8所示，覆盆子腸液消化組在0.5 h內(nèi)清除率達(dá)到最大值為40.17%，為腸消化0 h（37.47%）的1.07 倍，隨后清除率下降并趨于穩(wěn)定。而空白對照組在消化0.5 h 出現(xiàn)顯著性下降，隨后趨于穩(wěn)定，且模擬腸消化組的羥自由基清除率大于空白對照組。

圖7 覆盆子在體外模擬胃消化中羥自由基清除率的變化Fig.7 Hydroxyl free radical scavenging rate of raspberry in vitro simulated gastric digestion

圖8 覆盆子在體外模擬腸消化中羥自由基清除率的變化Fig.8 Hydroxyl free radical scavenging rate of raspberry in vitro simulated gastric digestion

2.5 覆盆子體外模擬胃腸消化中總還原力的變化

體外模擬胃消化過程中總還原力的變化如圖9所示，在模擬胃消化過程中，模擬胃消化組和胃酸對照組總還原力逐漸增大。模擬胃消化組最大吸光度值為0.706，為胃消化0 h 吸光度值（0.528）的1.34 倍，為胃酸最大吸光度值（0.696）的1.01倍，為空白對照組最大吸光度（0.657）的1.07 倍。模擬胃酸消化最大吸光度值（0.696）為胃酸消化0 h 的1.32 倍。在模擬腸消化過程中如圖10所示，覆盆子腸液消化組在2 h 內(nèi)逐漸增大，并達(dá)到最大吸光度值為0.79，為腸消化0 h（0.646）的1.22 倍，隨后趨于穩(wěn)定，腸空白對照組在消化1.5 h 吸光度值達(dá)到最大0.709，模擬腸消化組總還原力大于空白對照組。

圖9 覆盆子在體外模擬胃消化中總還原力的變化Fig.9 Reduction force of raspberry in vitro simulated gastric digestion

圖10 覆盆子在體外模擬腸消化中總還原力的變化Fig.10 Reduction force of raspberry in vitro simulated intestinal digestion

3 結(jié)論

通過對覆盆子進(jìn)行體外模擬胃腸消化，測定消化過程中總酚和總黃酮的釋放及抗氧化活性的變化發(fā)現(xiàn)，在模擬胃消化過程中，胃蛋白酶和胃酸均可以促進(jìn)總黃酮和總酚的釋放及抗氧化活性的提高，與消化0 h 相比，覆盆子胃消化總黃酮和總酚最大釋放量分別是其2.53 倍和1.23 倍，DPPH和羥自由基最大清除率以及最大總還原力分別是其1.03，1.22 倍和1.34 倍。模擬胃酸消化總黃酮、總酚、總還原力、DPPH 和羥自由基清除率最大分別是其1.26，1.17，1.32，1.02 倍和1.12 倍。在模擬腸環(huán)境消化階段，胰酶可以促進(jìn)總酚和總黃酮的釋放及抗氧化活性的提高，與消化0 h 相比，總黃酮和總酚最大釋放量分別是其0.91 倍和0.93 倍，DPPH 和羥自由基最大清除率以及最大總還原力分別是其1.08，1.07 倍和1.22 倍?？寡趸钚允求w系中所有抗氧化物質(zhì)發(fā)揮協(xié)同和拮抗作用的結(jié)果，由于覆盆子消化產(chǎn)物是一個(gè)混合組分，目前的研究并不能闡明其中具體的活性組分及其作用機(jī)制，因此有必要對其進(jìn)行分離純化，利用高效液相色譜測定結(jié)構(gòu)，并使用核磁共振技術(shù)從分子結(jié)構(gòu)層面對其抗氧化機(jī)制進(jìn)行分析。