范金波，麻 奧，周素珍，王長(zhǎng)霞，呂長(zhǎng)鑫

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 錦州益多樂(lè)乳業(yè)有限公司 遼寧錦州 121018）

功能性乳制品作為一種有利于養(yǎng)成健康飲食習(xí)慣的商品，在預(yù)防慢性病方面受到日益關(guān)注。其不僅含有植物多酚、維生素等保持人體健康的附加成分，還富含乳蛋白、鈣、活性肽等關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物。

β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，β-Lg）約占總?cè)榈鞍椎?%～12%，與α-乳白蛋白（α-Lactalbumin，α-La）同屬于乳清蛋白[1-2]。作為乳酪生產(chǎn)過(guò)程中回收的副產(chǎn)品，可廣泛獲得，且相對(duì)廉價(jià)[3]。β-Lg 的“花萼”空腔可以運(yùn)載甘油三酯、維甲酸和視黃醇等疏水小分子[4-5]。β-Lg 外表面的疏水口袋、Trp19-Arg124 附近、β-桶孔徑和二聚體的單體-單體交界面也被認(rèn)為是結(jié)合親水性和兩親性配體的潛在位點(diǎn)[6-7]。

二酮類多酚姜黃素（Curcumin，Cur）、芪類多酚白藜蘆醇（Resveratrol，Res）、黃酮類多酚槲皮素（Quercetin，Que）、酯類多酚咖啡酸-β-苯乙醇酯（Caffeic acid phenylethyl ester，CAPE）和苯丙烷類多酚綠原酸（Chlorogenic acid，CGA）在內(nèi)的多酚類化合物具有抗炎抗氧化、降壓降脂以及阻止癌癥細(xì)胞起始、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等眾多藥理作用，然而，氧、光、熱不穩(wěn)定的特點(diǎn)導(dǎo)致多酚在體內(nèi)半衰期短，并且較差的水溶性使其生物利用度受限，因此常將其裝入兩親性共聚物膠束的疏水核心來(lái)發(fā)揮有益功效[8-17]。

莧菜紅（Amaranth，Ama）是一種合成偶氮類染料，廣泛應(yīng)用于紅色或棕色食品中，包括軟飲料、蛋糕混合物、冰淇凌、谷類食品、葡萄酒、沙拉醬和咖啡[18]。然而，Ama 與人體內(nèi)的某些藥物（如阿司匹林、苯甲酸）接觸時(shí)，可引起敏感人群的過(guò)敏和哮喘反應(yīng)[19]。此外，有充分的證據(jù)表明，食用合成偶氮染料，其含有的偶氮（N=N）官能團(tuán)和芳香環(huán)結(jié)構(gòu)可被還原裂解成芳香胺，具有致癌毒性[20]。

功能性乳制品廣受青睞，而在多酚類有益物質(zhì)被人體吸收的同時(shí)，為其外觀色澤加分的著色劑也在一定程度上危害健康。借助控制載體蛋白-有害色素復(fù)合物的解離來(lái)抑制其人體吸收，成為蛋白小分子互作研究需攻克的重點(diǎn)。通過(guò)熒光光譜法結(jié)合分子對(duì)接研究多酚和Ama 與β-Lg 的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，不僅可改善配體的溶解性和穩(wěn)定性，達(dá)到控制釋放的作用，還可以延申到發(fā)揮多酚類物質(zhì)生物活性的同時(shí)，降低有害添加劑對(duì)人體健康的影響研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-Lg（純度≥95%），合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；Ama、Cur、Res、Que、CAPE、CGA（純度≥98%），上海生工生物工程有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（分析純級(jí)），天津市北辰方正試劑廠；無(wú)水乙醇（分析純級(jí)），天津市天力化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水皆為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000 熒光分光光度計(jì)，日本日立高新技術(shù)公司；XH-2000-I 旋渦混合器，天津市泰斯特儀器有限公司；ML104 電子天平、FE20K 實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Milli-Q HX7000 型超純水機(jī)，德國(guó)默克密理博有限公司。

1.3 方法

1.3.1 莧菜紅、多酚與β-乳球蛋白的分子對(duì)接 以分子對(duì)接模擬預(yù)測(cè)多酚、Ama 與β-Lg 結(jié)合的相應(yīng)位點(diǎn)。β-Lg 的3D 結(jié)構(gòu)采用RCSB PDB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)站中的5IO5 并去除水分子；Ama（CID：13506）、Cur（CID：969516）、Res（CID：445154）、Que（CID：5280343）、CAPE（CID：5281787）、CGA（CID：1794427）的3D 結(jié)構(gòu)來(lái)自PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)。Autodock Vina v4.0 軟件用于分子對(duì)接模擬。設(shè)置對(duì)接區(qū)域（x=91，y=58，z=89）以覆蓋整個(gè)β-Lg 單體的結(jié)合位點(diǎn)，β-Lg 剛性對(duì)接，配體柔性對(duì)接，其它參數(shù)均默認(rèn)。選擇對(duì)接分?jǐn)?shù)中的最低能量構(gòu)象，利用Pymol 結(jié)合Discovery Studio 2017 v2.0 做圖，Adobe Photoshop CS6 與PowerPoint 2013 軟件美化圖像[21]。

1.3.2 溶液配制 參考但倩譽(yù)[22]的方法并稍作修改，以二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉配制成10 mmol/L 的PBS 磷酸緩沖溶液（pH 7.4），4℃冷藏條件下有效期一個(gè)月。并以此緩沖液配制200 μmol/L 的β-Lg 溶液，以及1 mmol/L 的Ama、Cur、Res、Que、CAPE、CGA 溶液（除Ama 外均用70%乙醇溶液預(yù)溶），現(xiàn)配現(xiàn)用（如需暫存置于4℃冰箱）。

1.3.3 莧菜紅、多酚對(duì)于β-乳球蛋白的熒光猝滅

1.3.3.1 莧菜紅和多酚與β-乳球蛋白相互作用的熒光測(cè)定 參考張婕[23]的方法并稍作修改，將β-Lg 溶液以及一定量的Ama、多酚溶液與離心管中的PBS 緩沖溶液混合，在旋渦混合器上充分震蕩。每管溶液總體積為3 mL，β-Lg 濃度均為20 μmol/L，Ama、多酚濃度分別為0，2，6，10，14，20，30，40 μmol/L，即配體蛋白比為0，0.1∶1，0.3∶1，0.5∶1，0.7∶1，1.0∶1，1.5∶1，2∶1。上述樣品每種配制兩組，分別于25，37 ℃反應(yīng)30 min 后取出。

熒光掃描按如下條件進(jìn)行：每次取300 μL 配制好的樣品潤(rùn)洗標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿3 次，取2 mL 樣品于比色皿中利用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光掃描。固定激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)300 nm～500 nm，激發(fā)、發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度為700 nm/min。

1.3.3.2 熒光內(nèi)濾效應(yīng)的消除 熒光內(nèi)濾效應(yīng)指由于熒光體的高濃度或存在其它吸光物，熒光體和吸光物吸收激發(fā)、發(fā)射光而減弱熒光的現(xiàn)象[24]。因此，有必要從熒光數(shù)據(jù)中消除這種影響。使用式（1）可消除熒光內(nèi)濾效應(yīng)，其中Fc和Fm分別為校正熒光和測(cè)量熒光，A1和A2分別是Ama 或多酚在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下的吸光度[24]。

1.3.3.3 猝滅常數(shù)計(jì)算 利用Stern-Volmer（2）方程對(duì)所得熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，以求得猝滅速率常數(shù)Kq和Stern-Volmer 猝滅常數(shù)Ksv[25]。

式中，F(xiàn)0——猝滅劑加入前熒光體的熒光強(qiáng)度峰值；F——猝滅劑加入后熒光體的熒光強(qiáng)度峰值；[Q]——猝滅劑濃度，mol/L；τ0——未加猝滅劑時(shí)熒光體的平均壽命，10-8s；Ksv——Stern-Volmer猝滅常數(shù)；Kq——生物分子猝滅速率常數(shù)。

1.3.3.4 結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)計(jì)算 假設(shè)蛋白質(zhì)上存在n個(gè)獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)，采用Hill 方程（3）計(jì)算結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[25]。

式中，Ka——表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.3.3.5 熱力學(xué)常數(shù)計(jì)算 分子間作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等[26]。由Van's Hoff 方程（4）和熱力學(xué)方程（5）可計(jì)算出焓變?chǔ)、吉布斯自由能ΔG和熵變?chǔ)[27]。

式中，R——摩爾氣體常數(shù)，8.314 J/（mol·K）；T——試驗(yàn)溫度，K；K1——T1溫度下對(duì)應(yīng)的表觀結(jié)合常數(shù)；K2——T2溫度下對(duì)應(yīng)的表觀結(jié)合常數(shù)；ΔG——吉布斯自由能，kJ/mol；ΔH——焓變，kJ/mol；ΔS——熵變，J/（mol·K）。1.3.4 莧菜紅和多酚與β-乳球蛋白的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn) 試驗(yàn)樣品分為兩組，分別為pH 7.4 組和pH 3.0 組，其中pH 3.0 組所用PBS 緩沖溶液用0.5 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值（下同），后續(xù)操作一致[22]。

首先在離心管中加入PBS 緩沖溶液，每個(gè)離心管中溶液總體積為3 mL，再加入β-Lg 溶液并輕輕搖勻，β-Lg 濃度均為20 μmol/L，最后依次加入Ama 和多酚（多酚和Ama），前者濃度均為14 μmol/L，后者濃度分別為0，2，6，10，14，20，30，40 μmol/L，每次加入配體后在旋渦混合器上充分混勻后反應(yīng)30 min。

熒光掃描條件同1.3.3.1 節(jié)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)均重復(fù)3 次，日立FL Solution 2.1 軟件用于數(shù)據(jù)采集，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用IBM SPSS Statistics 25.0 軟件進(jìn)行顯著性差異分析，差異水平P<0.05 為顯著，采用Origin 9.0 軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 配體與β-乳球蛋白的分子對(duì)接

在分子對(duì)接模擬結(jié)果中，綠色鍵代表氫鍵，粉色鍵代表疏水相互作用。由圖1a 可知，Ama 結(jié)合于β-Lg的疏水空腔的“入口”處，主要通過(guò)氫鍵與Lys69、Asn88、Asn90、Asn109 和Ser116 結(jié)合。Cur（圖1b）與Ama 的結(jié)合位點(diǎn)接近，同樣結(jié)合于β-Lg“桶口”處，被Ile71、Ile84、Asn90、Met07 4 個(gè)氨基酸殘基包圍，主要通過(guò)疏水相互作用與Ile71、Ile84 結(jié)合。Res（圖1c）的結(jié)合位點(diǎn)也在“β-桶口”附近，并通過(guò)疏水相互作用與Leu39、Pro38、Met107 3 個(gè)氨基酸殘基結(jié)合。Que（圖1d）和CAPE（圖1e）均通過(guò)疏水相互作用結(jié)合于β-Lg 的“桶底”，且由于氨基酸殘基偏向一側(cè)，可以判斷此時(shí)二者結(jié)合于疏水空腔的外部。圖1f 顯示了CGA的結(jié)合位點(diǎn)位于β-Lg 的外表面，作用力主要是氫鍵。6 種配體與β-Lg 結(jié)合的吉布斯自由能分別為-40.32（Ama），-31.54（Cur），-32.15（Res），-35.63（Que），-37.44（CAPE），-36.96 kJ/mol（CGA）。

圖1 Ama 和5 種多酚與β-Lg 的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)、氨基酸殘基及作用力Fig.1 Predicted binding sites，the binding sites amino acids and interaction forces of Ama with five polyphenols on β-Lg

分子對(duì)接的結(jié)果表明Cur 和Res 與β-Lg 結(jié)合的位點(diǎn)與Ama 的結(jié)合位點(diǎn)接近（Cur、Res、Ama均與Asn90 結(jié)合，Res、Ama 皆與Leu39 結(jié)合），若Cur 或Res 與Ama 同時(shí)與β-Lg 相互作用時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用彼此影響與β-Lg 的結(jié)合，而Que、CAPE 和CGA 因結(jié)合位置遠(yuǎn)離Ama 的結(jié)合位點(diǎn)，將不會(huì)對(duì)Ama 結(jié)合于β-Lg 之上造成影響。

2.2 莧菜紅、多酚對(duì)β-乳球蛋白熒光光譜的影響

分子對(duì)接結(jié)果從5 種多酚類物質(zhì)中篩選出了與Ama 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)的Cur 與Res，為驗(yàn)證分子對(duì)接的結(jié)果并進(jìn)一步選擇與Ama 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力強(qiáng)的多酚，進(jìn)行β-Lg 與Ama、多酚相互作用的熒光光譜檢測(cè)。

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光與Trp、Tyr、Phe 殘基的存在密不可分。與配體的結(jié)合會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的熒光猝滅，通過(guò)對(duì)熒光光譜的分析，可以得到蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的有關(guān)信息，以及與配體相互作用過(guò)程中氨基酸殘基微環(huán)境的變化情況。β-Lg 含有兩個(gè)Trp 殘基Trp19 和Trp61 以及4 個(gè)Tyr 殘基Tyr20、Tyr42、Tyr99 和Tyr102[28]。激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm 時(shí)，熒光光譜主要由Trp 貢獻(xiàn)[29]。

由圖2 可知，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm 時(shí)，β-Lg的最大熒光強(qiáng)度峰位置在334 nm 附近，且β-Lg的固有熒光強(qiáng)度值隨著配體濃度的增加有規(guī)律的降低，而峰形無(wú)明顯變化，即幾種配體均對(duì)β-Lg的熒光產(chǎn)生了猝滅作用。其中Res（圖2c）、CAPE（圖2e）CGA（圖2f）對(duì)β-Lg 的熒光猝滅能力相對(duì)其它幾種配體明顯更強(qiáng)。同時(shí)由圖可以看出，隨著Res（圖2c）和CGA（圖2f）濃度增加，β-Lg 最大熒光峰發(fā)生明顯紅移（334 nm→356 nm 和333 nm→354 nm），CAPE（圖2e）的加入也導(dǎo)致最大熒光峰位置的輕微紅移（334 nm→346 nm），此現(xiàn)象表明這幾種配體存在時(shí)，β-Lg 芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了變化，在分子層面表現(xiàn)為親水性增加，疏水性降低，與Kanakis 等[30]、張婕[23]和郝明皓[31]的研究結(jié)果一致。Cur（圖2b）與Que（圖2d）的添加，造成了蛋白最大熒光峰位置一定程度上的藍(lán)移（335 nm→331 nm 和335 nm→332 nm），此時(shí)芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境變得更加疏水，試驗(yàn)結(jié)果與Kanakis 等[30]和李曉蕾等[11]一致。圖2a 還體現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)特的現(xiàn)象，即在420 nm 附近，出現(xiàn)了一個(gè)隨Ama 濃度增加熒光強(qiáng)度升高的峰，即Ama 與β-Lg 的復(fù)合物產(chǎn)生了內(nèi)源熒光。

圖2 不同溫度下Ama 和5 種多酚對(duì)β-Lg 的熒光猝滅Fig.2 Fluorescence quenching of β-Lg by Ama and five kinds of polyphenols at different temperatures

對(duì)比每種配體的左、右兩圖可以看出溫度升高雖導(dǎo)致β-Lg 的內(nèi)源熒光強(qiáng)度減弱，但不會(huì)對(duì)配體猝滅β-Lg 內(nèi)氨基酸殘基熒光的能力造成明顯影響，這可能與溫度升高程度較低有關(guān)。

2.3 配體對(duì)β-乳球蛋白的熒光猝滅機(jī)理與熱力學(xué)性質(zhì)

動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅作為配體猝滅蛋白質(zhì)的兩種模式[32]，前者意味著高溫導(dǎo)致分子碰撞劇烈和擴(kuò)散加快，表現(xiàn)為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)與溫度成正比；而靜態(tài)猝滅形成的復(fù)合物受熱分解，因此靜態(tài)猝滅常

數(shù)會(huì)隨溫度升高而減小[33]。Stern-Volmer 方程【式（2）】和Hill 方程【式（3）】可闡明熒光猝滅機(jī)理[25]。同時(shí)，利用Van's Hoff 方程【式（4）】和熱力學(xué)方程【式（5）】可分析反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)，判斷相互作用力。對(duì)于作用力類型的判斷，一般認(rèn)為，當(dāng)反應(yīng)放熱，ΔS<0 時(shí)，結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力是氫鍵和范德華力；而ΔS>0 時(shí)，靜電相互作用是主要作用力；當(dāng)ΔH和ΔS均大于0 時(shí)，主要是疏水相互作用[34]。

表1 與表2所示為方法中所述數(shù)學(xué)方程計(jì)算得到的配體與β-Lg 相互作用的一些重要常數(shù)。

由表1 可知配體與β-Lg 結(jié)合的生物分子猝滅常數(shù)（Kq）均大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)值2×1010L/（mol·s），說(shuō)明形成了蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物，即發(fā)生了靜態(tài)猝滅[35]。研究表明當(dāng)結(jié)合常數(shù)（Ka）在（1～15）×104L/mol 范圍內(nèi)時(shí)，配體以可逆的方式與蛋白質(zhì)結(jié)合[36]，可以看出除Que 在25 ℃結(jié)合常數(shù)較低外，配體與β-Lg 均有較強(qiáng)的結(jié)合能力，且結(jié)合能力與熒光發(fā)射光譜中對(duì)β-Lg 的猝滅能力相對(duì)應(yīng)。幾種配體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)接近于1 說(shuō)明與β-Lg 均有單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果符合前人的研究結(jié)論。

由表2 可知配體與β-Lg 的結(jié)合均為自發(fā)進(jìn)行（ΔG<0）。其中Ama 與CGA 的ΔH<0，說(shuō)明二者與β-Lg 的結(jié)合反應(yīng)放熱，也與表1 中的Ka隨溫度升高而減小相對(duì)應(yīng)。反之ΔH>0 的蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的Ka值隨溫度升高而增大。由ΔH與ΔS推斷蛋白質(zhì)與配體結(jié)合主要驅(qū)動(dòng)力可知，Ama和CGA 與β-Lg 作用類型為氫鍵與范德華力，Cur、Res、Que 和CAPE 則通過(guò)疏水相互作用與β-Lg 結(jié)合，與分子對(duì)接中所表現(xiàn)的相互作用力基本相符。

表1 配體與β-Lg 相互作用的猝滅、結(jié)合常數(shù)Table 1 Quenching constants and binding constants of β-Lg interacting with ligands

表2 配體與β-Lg 相互作用的熱力學(xué)常數(shù)Table 2 Thermodynamic constants of β-Lg interacting with ligands

2.4 和莧菜紅競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合β-乳球蛋白的多酚的確定

β-Lg 的疏水空腔，也就是被稱為“花萼”的β-桶由于特殊構(gòu)造，對(duì)結(jié)合位點(diǎn)控制具有pH 值響應(yīng)性?！癊F 環(huán)”類似于開(kāi)關(guān)控制小分子進(jìn)入疏水空腔內(nèi)部，當(dāng)β-Lg 處于中性pH 值時(shí)，“EF 環(huán)”打開(kāi)，小分子可進(jìn)入疏水空腔并結(jié)合，而當(dāng)外部環(huán)境為酸性時(shí)，Glu89 質(zhì)子化使“EF 環(huán)”閉合擋住空腔入口，阻止小分子結(jié)合到疏水腔內(nèi)，此時(shí)小分子只能結(jié)合于β-Lg 的外表面[37]。

由熒光猝滅率圖3所示，可以看出在pH 值為7.4 時(shí)Ama 與β-Lg 的結(jié)合顯著影響了Cur 的結(jié)合，具體體現(xiàn)在猝滅率降低。而在pH 值為3 時(shí)Ama 與β-Lg 的結(jié)合未對(duì)Cur 造成影響。同時(shí)其它多酚類物質(zhì)與Ama 無(wú)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合β-Lg 的體現(xiàn)或競(jìng)爭(zhēng)作用較弱。說(shuō)明在中性條件下，Cur 與Ama 均結(jié)合到β-Lg 的相近位點(diǎn)，而在酸性條件下，“EF 環(huán)”關(guān)閉，此時(shí)Cur 和Ama 結(jié)合于β-Lg 外表面的不同位點(diǎn)，二者與β-Lg 的結(jié)合互不影響。

圖3 不同pH 值下Ama 對(duì)β-Lg-配體復(fù)合物的熒光猝滅率影響Fig.3 Effect of Ama on fluorescence quenching rate of β-Lg-ligand complex at different pH value

由熒光猝滅率圖4 可知中性條件下Cur、Res與β-Lg 的結(jié)合均影響了Ama 的結(jié)合，兩種配體出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，此時(shí)Ama 與Cur、Res 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相近位點(diǎn)，猝滅率降低，對(duì)應(yīng)了分子對(duì)接的結(jié)論，此時(shí)Cur、Res 先于Ama 與β-Lg 結(jié)合，而由于Ama對(duì)此位點(diǎn)的結(jié)合能力較強(qiáng)因此與前者產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用。從圖中可以看出Cur 與Ama 的競(jìng)爭(zhēng)作用略強(qiáng)于Res。酸性環(huán)境中5 種多酚與β-Lg 的結(jié)合不會(huì)對(duì)Ama 造成影響。二配體競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)的結(jié)果表明配體添加順序的改變也可以影響配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合。

圖4 不同pH 值下配體對(duì)β-Lg-Ama 復(fù)合物的熒光猝滅率Fig.4 Effect of ligands on fluorescence quenching rate of β-Lg-Ama complex at different pH value

3 結(jié)論

以分子對(duì)接模擬了5 種多酚和Ama 與β-Lg的結(jié)合位點(diǎn)氨基酸和作用力類型，并采用熒光光譜法驗(yàn)證多酚和Ama 與β-Lg 結(jié)合的熒光猝滅、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和相互作用力，最后通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)結(jié)合分子對(duì)接確定了與Ama 競(jìng)爭(zhēng)β-Lg 位點(diǎn)的多酚。結(jié)果表明，多酚類活性成分Cur、Res、Que、CAPE 和CGA 與人工合成偶氮類染料Ama 均可對(duì)β-Lg 產(chǎn)生靜態(tài)猝滅從而形成蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物。Ama、Cur 和Res 的結(jié)合位點(diǎn)在β-Lg 空腔入口附近，Que、CAPE、CGA 的結(jié)合于β-Lg 空腔外表面。其中Ama 和CGA 與β-Lg 作用力類型為氫鍵和范德華力，Cur、Res、Que 和CAPE 則通過(guò)疏水相互作用與β-Lg 結(jié)合，結(jié)果與分子對(duì)接模擬的配體與β-Lg 結(jié)合的主要作用力類型一致。酸性條件下Cur、Res、Que、CAPE、CGA 與Ama 均無(wú)明顯競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用，推測(cè)此時(shí)Ama 和5 種多酚與β-Lg結(jié)合于不同位點(diǎn)。在先加Ama 再添加多酚時(shí)，中性條件下Ama 與Cur 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于β-Lg 的結(jié)合位點(diǎn)；而在多酚先與β-Lg 結(jié)合的情況下，Cur 和Res在中性環(huán)境中均會(huì)影響Ama 與β-Lg 位點(diǎn)的結(jié)合。綜上結(jié)果表明5 種多酚中Cur 和Res 存在與Ama 的位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)作用，且競(jìng)爭(zhēng)作用受配體與β-Lg的結(jié)合順序影響，對(duì)為控制功能性乳制品中小分子物質(zhì)的人體吸收提供啟發(fā)具有重要意義。