彭 東，賴玉健，田柬昕，鐘碧鑾，安苗青，黎 攀，3，杜 冰，3*

（1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 廣州 510642 2 廣東參之源健康科技有限公司 廣州 510000 3 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)與官棧魚膠營養(yǎng)安全研究中心 廣州 510642）

魚鰾位于硬骨魚體腔內(nèi)的背部，是魚維持平衡的重要器官。在魚類加工過程中，魚鰾經(jīng)常被作為廢棄物處理，造成資源的浪費，魚鰾的高值化利用引起人們的關(guān)注[1]。魚鰾在我國有著悠久的食用和藥用歷史，最早的食用文字記錄可追溯到北魏時期的《齊民要術(shù)》，藥用文字記錄可追溯到唐朝的《本草拾遺》。魚鰾的主要成分為膠原蛋白，魚鰾多肽是膠原蛋白的酶解產(chǎn)物，具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞和抗癌等多種功效[2-4]。

前列腺癌是全球男性最常見的惡性腫瘤之一[5]。在我國，前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年增高的趨勢，前列腺癌的防治是我國公共衛(wèi)生當(dāng)前面臨的重大挑戰(zhàn)[6]?？拱╇木哂幸撰@得性、生物相容性、高效性和低毒性等多種優(yōu)點，在癌癥治療中表現(xiàn)出巨大的潛力[7]。研究表明抗癌肽的作用機制主要包括：參與誘導(dǎo)癌細(xì)胞周期停滯、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抗癌細(xì)胞血管新生、抑制腫瘤干細(xì)胞和激活機體免疫應(yīng)答[8-10]。課題組前期測得黃魚魚鰾中蛋白質(zhì)含量高達(dá)75%以上，是生產(chǎn)膠原蛋白肽的優(yōu)質(zhì)原料來源[11]。本試驗從黃魚魚鰾酶解產(chǎn)物中分離純化抗前列腺癌肽，探究其對前列腺癌細(xì)胞DU-145 細(xì)胞的作用效果，并推測誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制，以期明確黃魚魚鰾肽抗前列腺癌的作用機制，同時也為黃魚魚鰾的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干制黃魚魚鰾，購買于當(dāng)?shù)睾ｕr市場；前列腺癌細(xì)胞DU-145 細(xì)胞、DU-145 細(xì)胞專用培養(yǎng)基，武漢普諾賽生命科技有限公司；胰蛋白酶消化液、二甲基亞砜，美國Amresco 公司；二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA），美國Sigma 公司；AO/EB染色試劑盒、Annexin V-FITC 試劑盒、PI 試劑盒、BCA 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；CCK-8 試劑，廣州松鼠生物科技有限公司；Bax、Caspase-3、Caspase-9 和β-actin抗體，美國Cell Signaling Technology 公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶，廣州柏棠貿(mào)易有限公司；Sephadex G-25 凝膠填料、DEAE-52 凝膠填料，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；其余試劑為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT 高效凝膠滲透色譜儀、1260 高效液相色譜儀、1290-6470 超高壓液質(zhì)聯(lián)用色譜儀，美國Agilent 公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀，美國Beckman Coulter 有限公司；VarioskanTM LUX 多功能酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TCS SP8 激光共聚焦熒光顯微鏡，德國Leica 公司；Alpha 2-4 LD plus 真空冷凍干燥機，德國Christ 公司。

1.3 方法

1.3.1 黃魚魚鰾酶解液的制備[12]黃魚魚鰾清洗去除雜質(zhì)→料液比1 ∶20 浸泡4 h →NaOH 調(diào)pH 值至8.5 →加0.75%堿性蛋白酶、0.25%中性蛋白酶→55 ℃恒溫酶解4 h →升溫至90 ℃保持10 min 滅酶→冷卻至室溫→4 000 r/min 離心15 min →取上清→魚鰾酶解液→真空濃縮、冷凍干燥得到魚鰾多肽凍干粉。將多肽凍干粉送至廣東省測試分析研究所進(jìn)行多肽分子質(zhì)量測定。

1.3.2 魚鰾多肽的純化 取魚鰾多肽凍干粉溶于蒸餾水中，配置成質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的溶液，使用中空纖維超濾膜（1 ku）過濾，收集<1 ku 的組分，凍干備用。將收集到的組經(jīng)Sephadex G-25 凝膠色譜柱進(jìn)一步純化。蒸餾水作為洗脫液，每管流速為0.7 mL/min，用自動收集器收集洗脫液。采用微量紫外分光光度計測定洗脫液吸光值，收集單峰組分，真空濃縮、冷凍干燥。測定組分對DU-145細(xì)胞的抑制率。

Sephadex G-25 凝膠交換柱純化后的組分經(jīng)DEAE-52 陰離子交換柱進(jìn)一步純化。分別采用純水、0.1 mol/L、0.2 mol/L NaCl 溶液為洗脫液，每管流速為2 mL/min，每管收集體積為5 mL。測定每管收集的洗脫液的吸光值，收集后凍干單峰組分。測定組分對DU-145 細(xì)胞的抑制率。

DEAE-52 陰離子交換柱純化后的組分經(jīng)反相高效液相色譜（Reversed-phase high performance liquid chromatography，RT-HPLC）進(jìn)一步純化。色譜條件設(shè)置如下：Pursuit XRs C-18 色譜柱（250 mm×21.2 mm，10 μm），A 相——含0.1%三氟乙酸的水，B 相——含0.1%三氟乙酸的乙腈；流速為1 mL/min，色譜柱溫度為35 ℃，紫外檢測器的波長為280 nm。梯度洗脫條件如下：A 相：0～12 min，95%→80%；12～24 min，80%→5%。按順序收集單峰組分，濃縮后真空凍干。測定各組分對DU-145 細(xì)胞的抑制率，對抑制率最高的組分進(jìn)行序列鑒定。

1.3.3 魚鰾多肽序列鑒定 在待鑒定組分中加入DTT 溶液使其終濃度為10 mmol/L，56 ℃水浴中還原1 h，加入IAA 溶液使其終濃度為50 mmol/L，避光反應(yīng)40 min 后，脫鹽，并于45 ℃條件下在真空離心濃縮儀中使溶劑揮干。在使用LC-MS/MS 檢測前用10 mL 0.1%甲酸中重懸。色譜條件如下：ReproSil-Pur C18-AQ resin（1.9 μm，100 ?）填充色譜柱（150 μm×15 cm），進(jìn)樣體積5 μL，A相——含0.1%甲酸的水，B 相——含0.1%甲酸的乙腈，流速為600 nL/min。梯度洗脫條件如下：A 相：0～2 min，96% →92%；2～45 min，92% →72%；45～55 min，72%→60%；55～66 min，60%→5%。質(zhì)譜條件：樣品用Q ExactiveTMUHMR 組合型四極桿OrbitrapTM質(zhì)譜儀分析，電壓為2.2 kV，溫度為270℃，CID 檢測器，母離子掃描范圍m/z100～1 500。

1.3.4 魚鰾多肽對DU-145 細(xì)胞的抑制率測定DU-145 細(xì)胞用DU-145 專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞單層生長至鋪滿瓶底80%左右時進(jìn)行傳代或用于試驗。取100 μL 對數(shù)生長期DU-145 細(xì)胞以2×105個/mL 濃度接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后加入10 μL 魚鰾多肽樣品，孵育24 h 后加入10 μL CCK-8 溶液，反應(yīng)2 h，用酶標(biāo)儀在波長450 nm 處測定吸光度。抑制率計算公式如式（1）。

式中，A0——培養(yǎng)基+CCK-8 溶液的吸光值；A1——細(xì)胞+CCK-8 溶液的吸光值；A2——細(xì)胞+樣品+CCK-8 溶液的吸光值。

1.3.5 AO/EB 法測定DU-145 細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期DU-145 細(xì)胞以2×105個/mL 濃度接種于6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h 后更換培養(yǎng)液，分別加入含有50，250 μg/mL 和750 μg/mL 魚鰾多肽的培養(yǎng)液，空白組加入原始培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出6 孔板，吸去上清液，PBS 洗滌2 次，棄去洗滌液。加入10 μL AO/EB 混合液（VAO：VEB=1∶1），室溫下避光孵育5 min，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.6 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期DU-145 細(xì)胞以2×105個/mL 濃度接種于6 孔板中，分別加入含50，250 μg/mL 和750 μg/mL 魚鰾多肽的培養(yǎng)液，空白組加入原始培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。2 500 r/min 條件下離心5 min 收集沉淀，加入4℃預(yù)冷PBS 溶液，于2 500 r/min 下離心5 min，收集沉淀，重復(fù)兩次。加入500 μL 結(jié)合緩沖溶液重懸細(xì)胞后，加入5 μL Annexin V-FITC 溶液，避光反應(yīng)5 min 后，加入5 mL PI 溶液，避光靜置5 min。用300 目篩網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.3.7 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期 取對數(shù)生長期DU-145 細(xì)胞以2×106個/mL 濃度接種于6 孔板中，分別加入含50，250 μg/mL 和750 μg/mL 魚鰾多肽的培養(yǎng)液，空白組加入原始培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。2 500 r/min 條件下離心5 min，收集細(xì)胞，用4℃預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞2 次后，加入1 mL 20 ℃的70%乙醇，吹打均勻后靜置過夜。2 500 r/min 條件下離心5 min，棄掉上清液，用4 ℃預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞后，每管細(xì)胞加入0.5 mL PI 染色液，37 ℃避光放置30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.3.8 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá) 利用試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，并利用BCA 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒進(jìn)行定量。利用免疫印記法測定Bax、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白在DU-145 細(xì)胞中的表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測定值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，試驗重復(fù)3次。使用SPSS 22 軟件進(jìn)行單因素方差分析，通過LSD 法對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重字母比較分析。采用OriginPro 9.0 軟件進(jìn)行圖形可視化處理，ChemDraw8.0 軟件繪制多肽結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚鰾酶解液分子質(zhì)量

采用HPGPC 檢測魚鰾酶解液分子質(zhì)量，結(jié)果如表1所示。酶解后的魚鰾多肽中分子質(zhì)量大于1 000 u 的多肽占比36.73%，分子質(zhì)量小于1 000 u 的多肽占比63.27%，其中小分子多肽占比率較高，表明魚鰾蛋白酶解程度較好。

表1 魚鰾酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量Table 1 Molecular weight of enzymatic hydrolysate of yellow croaker swim bladder

2.2 魚鰾多肽的分離純化

魚鰾酶解產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-25 凝膠層析柱純化的洗脫曲線如圖1a所示。在圖1a 中，只出現(xiàn)一個峰，表明僅有一種分子質(zhì)量大小相近的多肽被洗脫下來，命名為YCSB。考察YCSB 對前列腺癌細(xì)胞DU-145 的抑制效果，結(jié)果如圖1b所示。隨著YCSB 質(zhì)量濃度變大，抑制率也隨之增強，呈現(xiàn)一定的質(zhì)量濃度依賴性。當(dāng)YCSB 質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL 時，抑制率為28.4%，對DU-145 細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抑制作用，可推斷出YCSB 中存在抗前列腺癌肽。

圖1 魚鰾多肽的分離純化Fig.1 Separation and purification of peptide from yellow croaker swim bladder

選用DEAE-52 陰離子交換層析柱來對YCSB 進(jìn)行純化，得到的洗脫曲線如圖1c～1e。純水洗脫曲線中僅有一個峰，收集并命名為YCSB-1；0.1 mol/L NaCl 洗脫曲線中有一高一低2 個峰，收集高峰組分命名為YCSB-2；0.2 mol/L NaCl 洗脫曲線中也出現(xiàn)了2 個峰，收集高峰組分命名為YCSB-3。圖1f 為YCSB-1、YCSB-2 和YCSB-3 對DU-145 細(xì)胞的抑制率，在1 000 μg/mL 時，YCSB-1 抑制率最高，為48.3%。因此，對YCSB-1進(jìn)行進(jìn)一步純化。

圖1g 為YCSB-1 的RT-HPLC 色譜圖，峰型較好，分離效果較佳。圖譜中出現(xiàn)6 個不同的色譜峰組分，收集并分別命名為YCSB-1a、YCSB-1b、YCSB-1c、YCSB-1d、YCSB-1e 和YCSB-1f。這6個組分對DU-145 細(xì)胞的抑制率如圖1h所示，在1 000 μg/mL 時，YCSB-1c 表現(xiàn)出最高的抑制率（45.8%），表明YCSB-1c 是YCSB-1 中一種重要的抗前列腺癌肽。

2.3 多肽氨基酸序列鑒定

將YCSB-1c 通過LC-MS/MS 分析，對采集到的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行De novo 測序，共檢測出2 條四肽（表2）。圖2 為2 條四肽的二級質(zhì)譜圖，SPSP 的氨基酸序列為絲氨酸-脯氨酸-絲氨酸-脯氨酸（Ser-Pro-Ser-Pro），GPAR 的氨基酸序列為甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸-精氨酸（Gly-Pro-Ala-Arg）。

表2 YCSB-1c 的氨基酸序列鑒定Table 2 Amino acid sequence identification of YCSB-1c

圖2 多肽的二級質(zhì)譜圖Fig.2 The secondary mass spectrum of peptide

2.4 AO/EB 染色

吖啶橙（AO）能透過細(xì)胞膜完整的細(xì)胞，將細(xì)胞核染成均勻的綠色熒光；而溴化乙錠（EB）只能透過細(xì)胞膜受損的細(xì)胞，嵌入核DNA，使其發(fā)出橘紅色熒光[13]。因此，可以利用AO/EB 染色法來辨別正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，YCSB-1c 作用后DU-145 細(xì)胞的AO/EB 染色結(jié)果如圖3所示。圖3a 為空白組，細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的綠色熒光，表明空白組中存在大量活細(xì)胞。圖3b、3c 和3d 分別對應(yīng)YCSB-1c 的低（50 μg/mL）、中（250 μg/mL）和高質(zhì)量濃度（750 μg/mL）組，隨著YCSB-1c 質(zhì)量濃度增加，活細(xì)胞數(shù)量不斷減少，凋亡細(xì)胞數(shù)量不斷增加，表明YCSB-1c 能誘導(dǎo)DU-145 細(xì)胞凋亡，且作用效果呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。

圖3 YCSB-1c 作用后DU-145 細(xì)胞的AO/EB 染色圖Fig.3 AO-EB staining of DU-145 cells after treatment with YCSB-1c

2.5 細(xì)胞凋亡分析

細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC/PI 雙染后，使用流式細(xì)胞儀能夠準(zhǔn)確地區(qū)分細(xì)胞的凋亡狀態(tài)分布[14]。YCSB-1c 作用DU-145 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞的線粒體膜電位圖如圖4所示，圖中4 個象限表示細(xì)胞的不同狀態(tài)：左上，壞死細(xì)胞；左下，正常細(xì)胞；右上，晚期凋亡細(xì)胞；右下，早期凋亡細(xì)胞。相較于空白組，YCSB-1c 組中凋亡細(xì)胞明顯增多，其中早期凋亡細(xì)胞在50 μg/mL 和250 μg/mL YCSB-1c 組中有微小的增加，而在750 μg/mL YCSB-1c 組中早期凋亡細(xì)胞明顯增加，達(dá)到10.92%。50，250 μg/mL 和750 μg/mL YCSB-1c 組中的晚期凋亡細(xì)胞占比分別為7.97%，14.44%和16.25%，較空白組（1.80%）分別提升了342.78%，702.22%和802.78%。YCSB-1c 促使DU-145 細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)，且作用效果與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，這與細(xì)胞的AO/EB染色結(jié)果一致。

圖4 YCSB-1c 對DU-145 細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 The effect of YCSB-1c on the apoptosis of DU-145 cells

2.6 細(xì)胞周期分析

細(xì)胞周期可分為4 個階段：G1 期（DNA 合成前期）、S 期（DNA 合成期）、G2 期（DNA 合成后期）、M 期（細(xì)胞分裂期）。YCSB-1c 作用后DU-145 細(xì)胞的細(xì)胞周期情況如圖5 和表3所示。由表3 可知，與空白組相比，YCSB-1c 組中G0/G1期細(xì)胞顯著增多（P<0.05），且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性；S 期和G2/M 期細(xì)胞顯著降低（P<0.05），這表明YCSB-1c 將DU-145 細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1 期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S 期合成DNA，進(jìn)而誘導(dǎo)DU-145 細(xì)胞凋亡。

圖5 YCSB-1c 作用后DU-145 細(xì)胞的細(xì)胞周期分布圖Fig.5 Cell cycle distribution profiles of DU-145 cells after treatment with YCSB-1c

表3 YCSB-1c 作用后DU-145 細(xì)胞的細(xì)胞周期分布結(jié)果Table 3 Cell cycle distribution results of DU-145 cells after treatment with YCSB-1c

2.7 免疫印記檢測蛋白表達(dá)

Bax是一種促凋亡基因，能激活細(xì)胞線粒體凋亡途徑，而Caspase-3 和Caspase-9 是執(zhí)行凋亡的兩種關(guān)鍵蛋白酶[15]。如圖6所示，3 種凋亡蛋白條帶清晰，無明顯拖尾。與空白組相比，不同質(zhì)量濃度YCSB-1c 組中Bax、Caspase-3 和Caspase-9蛋白表達(dá)量增加，且呈質(zhì)量濃度依賴性（表4）。這表明YCSB-1c 能上調(diào)Bax、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達(dá)，進(jìn)而促使DU-145 細(xì)胞凋亡。

表4 YCSB-1c 作用后DU-145 細(xì)胞中蛋白表達(dá)量Table 4 Protein expression content in DU-145 cells after treatment with YCSB-1c

圖6 YCSB-1c 作用后DU-145 細(xì)胞中蛋白表達(dá)Fig.6 Protein expression in DU-145 cells after treatment with YCSB-1c

3 討論

生物活性肽的功能與其特定氨基酸組成有密切關(guān)系，本研究分離純化得到的魚鰾多肽YCSB-1c 中含有2 條四肽，分別為SPSP（Ser-Pro-Ser-Pro）、GPAR（Gly-Pro-Ala-Arg），其組成氨基酸均是黃魚魚鰾蛋白中的優(yōu)勢氨基酸[11]。Pro 是2 條四肽中共有的氨基酸，在SPSP 中占比高達(dá)50%，其是構(gòu)成抗癌肽的重要氨基酸成分，如Huang 等[16]從蟶子中分離出兩條多肽Leu-Pro-Gly-Pro 和Asp-Tyr-Val-Pro，并證實它們具備較好的抗前列腺癌活性；Shamova 等[17]從山羊白細(xì)胞中分離一條富含Pro 的多肽ChBac3.4，其能選擇性地作用K562 紅血病細(xì)胞和U937 囊性淋巴瘤細(xì)胞而不損傷人體正常細(xì)胞。此外，GPAR 中的Gly、Arg 也被公認(rèn)為是抗癌肽的主要氨基酸組成[18-19]。

細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡有著緊密的關(guān)聯(lián)，細(xì)胞凋亡導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)量下降，引起細(xì)胞周期發(fā)生改變[20]。流式細(xì)胞儀檢測YCSB-1c 作用后DU-145細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，YCSB-1c 組中G0/G1 期細(xì)胞顯著增多（P<0.05），S 期和G2/M期細(xì)胞顯著降低（P<0.05）。YCSB-1c 將DU-145細(xì)胞周期阻滯在G0/G1 期，這可能與細(xì)胞合成DNA、核糖體和蛋白質(zhì)受阻有關(guān)[21]。Huang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，抗前列腺癌肽SCH-P10 作用后DU-145細(xì)胞中G0/G1 期細(xì)胞數(shù)量增加，S 期和G2/M 期細(xì)胞數(shù)量減少，與本研究的結(jié)果一致。

誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是治療癌癥的有效手段。細(xì)胞凋亡主要包括線粒體凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和死亡受體凋亡3 種途徑[22]，其中線粒體凋亡途徑主要由非Caspase 依賴細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子和細(xì)胞色素C 介導(dǎo)[23]。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子介導(dǎo)的凋亡途徑為：藥物引起線粒體內(nèi)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子釋放，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，破壞細(xì)胞DNA 進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24]。細(xì)胞色素C 介導(dǎo)的凋亡途徑為：當(dāng)細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax 被激活時，會引起線粒體膜通透性增加，線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C 被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活細(xì)胞中凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1），Apaf-1 能激活Caspase-9[25]。細(xì)胞色素C、Apaf-1 和caspase-9 通過形成凋亡小體激活Caspase-3，使核酸內(nèi)切酶活化，引起DNA 斷裂最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26]。本研究中發(fā)現(xiàn)，YCSB-1c 作用后DU-145 細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax、執(zhí)行凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 表達(dá)上調(diào)，推測YCSB-1c誘導(dǎo)DU-145 細(xì)胞凋亡的作用機制如圖7所示。

圖7 YCSB-1c 誘導(dǎo)DU-145 細(xì)胞凋亡的作用機制Fig.7 The mechanism of YCSB-1c inducing apoptosis of DU-145 cells

綜上所述，YCSB-1c 能將DU-145 細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1 期，促使DU-145 細(xì)胞中Bax、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達(dá)上調(diào)，最終誘導(dǎo)DU-145 細(xì)胞凋亡，實現(xiàn)抗前列腺癌的功效。試驗結(jié)果表明黃魚魚鰾肽具有成為抗前列腺癌藥物的潛力。后續(xù)將人工合成黃魚魚鰾中的兩條寡肽，研究它們對前列腺癌細(xì)胞的抑制效果和作用機制。

4 結(jié)論

本文從黃魚魚鰾酶解產(chǎn)物分離得到魚鰾肽YCSB-1c，其包含Ser-Pro-Ser-Pro 和Gly-Pro-Ala-Arg 兩條寡肽。YCSB-1c 對前列腺癌細(xì)胞DU-145 有較好的抑制效果，其機制為：將DU-145 細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1 期，抑制細(xì)胞增殖；上調(diào)促凋亡蛋白Bax、執(zhí)行凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的表達(dá)量，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究為黃魚魚鰾的抗前列腺癌保健品開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持，并有效提高黃魚魚鰾的附加值。