劉茂柯，田新惠，劉成元，景曉衛(wèi)，馬 超，王思思，倪先林，張星宇，唐玉明

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻高粱研究所，四川 德陽(yáng) 618000；2.四川省瀘州市釀酒科學(xué)研究所，四川 瀘州 646100；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川 成都 610066；4.四川華宇瑞得科技有限公司，四川 德陽(yáng) 618221；5.四川廣漢金雁酒業(yè)有限公司，四川 德陽(yáng) 618302；6.國(guó)家高粱改良中心四川分中心，四川 瀘州 646100）

高粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]是禾本科高粱屬作物，是釀造中國(guó)白酒的主要原料[1]。以往研究顯示，不同品種高粱可能因理化成分（支鏈淀粉、單寧、脂肪等）含量的不同而導(dǎo)致白酒香味物質(zhì)的組成出現(xiàn)差異，影響酒質(zhì)。如WU Q等[2]將釀酒酵母接種到高粱浸提液中，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的醇、酯含量與高粱的脂肪和單寧含量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。通過模擬釀造試驗(yàn)，有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)高粱單寧含量＜1.94%時(shí)，其含量與酒體乙酸乙酯、辛酸乙酯的含量呈正相關(guān)，與乳酸乙酯呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）[3]。然而，目前針對(duì)不同高粱釀造酒質(zhì)差異的解析主要依賴實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)行[4-8]，大生產(chǎn)條件下的酒質(zhì)差異及其與理化品質(zhì)的關(guān)系還未被充分揭示[9-13]，導(dǎo)致白酒企業(yè)在選擇釀酒原料時(shí)無(wú)據(jù)可依，也阻礙了對(duì)白酒發(fā)酵機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)。

清香型白酒是中國(guó)白酒的主要香型之一，其釀造周期較短、工藝相對(duì)簡(jiǎn)單[14]，是評(píng)價(jià)原料釀酒效果的理想模型。本研究以四川酒類企業(yè)廣泛應(yīng)用的3種高粱為材料，揭示它們釀造清香型白酒的香味物質(zhì)差異及其與理化品質(zhì)的關(guān)系，以期為優(yōu)質(zhì)釀酒高粱的選育改良及其推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瀘州紅1號(hào)高粱（粗蛋白9.38%、粗脂肪3.37%、粗淀粉73.00%、單寧1.70%、支鏈淀粉93.00%）和金糯梁1號(hào)高粱（粗蛋白9.70%、粗脂肪3.54%、粗淀粉74.23%、單寧1.31%、支鏈淀粉92.40%）：由本研究所選育而成；澳洲AZ高粱（粗蛋白11.19%、粗脂肪4.96%、粗淀粉78.42%、單寧0.48%、支鏈淀粉81.22%）：由開展釀酒試驗(yàn)的酒廠提供。

內(nèi)標(biāo)以及香味物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；高粱理化成分分析所需的常規(guī)理化試劑：生工生物工程（上海）股份有限公司；釀造試驗(yàn)所用的小曲（發(fā)酵劑）：四川省彭州華西曲藥廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Clarus 500氣相色譜（gas chromatography，GC）儀配有火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）：美國(guó)PerkinElmer 公司；CP-Wax 57 CB色譜柱（50 m×0.25 mm×0.2 μm，酸性）：美國(guó)Agilent公司；XPR205D5/AC電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；HH-M8恒溫水浴鍋：江蘇新春蘭科學(xué)儀器有限公司；H03-B磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高粱理化成分分析

粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、支鏈淀粉和單寧含量：參照文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定。

1.3.2 酒樣發(fā)酵

清香型白酒釀造試驗(yàn)在四川省瀘州市的某兩個(gè)酒廠（LHK、JGB）同時(shí)進(jìn)行。在LHK酒廠，除澳洲AZ用3個(gè)地缸發(fā)酵外，另兩種高粱為6個(gè)地缸；在JGB酒廠，每種高粱用3個(gè)地缸發(fā)酵。每個(gè)地缸投入高粱、小曲和糠殼的質(zhì)量分別為800 kg、4 kg和64 kg。各酒廠的釀造生產(chǎn)由同一批工人操作，發(fā)酵期7 d。發(fā)酵結(jié)束后，每個(gè)地缸取出的酒醅分為2甑蒸餾。蒸餾結(jié)束后，將每甑酒樣混合后取100 mL混合酒樣供試，共24份酒樣。

1.3.3 酒樣香味物質(zhì)分析

用無(wú)菌蒸餾水將酒樣的酒精度稀釋為60.5%vol后，采用氣相色譜儀檢測(cè)香味物質(zhì)的含量，用2-甲基-2-丁醇、乙酸戊酯和2-乙基丁酸作內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，色譜反應(yīng)條件參見文獻(xiàn)[16]。

1.3.4 酒樣感官評(píng)價(jià)

由瀘州老窖、金雁酒業(yè)等白酒企業(yè)的7名國(guó)家級(jí)酒質(zhì)評(píng)委對(duì)酒樣進(jìn)行感官品評(píng)，描述酒樣的總體風(fēng)味特征。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和雙因素置換多元方差分析（Two-way PERMANOVA）揭示酒樣香味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成及其差異；利用曼特爾檢驗(yàn)（Mantel test）揭示香味物質(zhì)和高粱理化成分的Pearson相關(guān)性，香味物質(zhì)和理化成分的矩陣分別用Bray-Curtis 和Euclidean 距離表征。以上分析通過PAST 3軟件[17]完成。采用偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）篩查不同品種高粱酒樣的差異香味物質(zhì)，篩查標(biāo)準(zhǔn)：變量權(quán)重值（variableimportantinprojection，VIP）≥1且含量倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）≥1.2 或≤0.83。PLS-DA和韋恩（Venn）分析通過R軟件完成。酒樣香味物質(zhì)含量的單因素方差分析、高粱理化成分和香味物質(zhì)含量的Pearson相關(guān)性分析以及多元線性回歸分析（進(jìn)入法）均由SPSS 20.0完成。圖片制作通過GraphPad Prism（8.0）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒樣香味物質(zhì)的含量差異

白酒香味物質(zhì)以醇、醛、酸、酯為主，其組成決定酒質(zhì)的優(yōu)劣[18]。由表1可知，3種高粱酒樣中不同香味物質(zhì)的含量差異在不同酒廠的表現(xiàn)形式有一定差異。澳洲AZ高粱酒樣的酯、醛、酸類物質(zhì)含量在兩個(gè)酒廠均處于較低水平；不同之處包括多個(gè)方面，如澳洲AZ酒樣的醇類含量在JGB酒廠顯著高于瀘州紅1號(hào)和金糯粱1號(hào)，在LHK酒廠卻顯著低于金糯粱1號(hào)（P＜0.05）。

表1 不同品種高粱釀造酒樣的揮發(fā)性香味物質(zhì)含量Table 1 Flavor compound contents of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties

2.2 酒樣香味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異

由圖1可知，3種高粱酒樣檢測(cè)出36種香味物質(zhì)，包括8種醇、9種酸、6種醛、11種酯和2種酮類。3種高粱酒樣在LHK酒廠均以乙酸乙酯、3-甲基丁醛和異丁醇為主，在JGB酒廠的優(yōu)勢(shì)香味物質(zhì)有差異，如金糯粱1號(hào)酒樣以乙酸乙酯、3-甲基丁醛和乙酸為主，瀘州紅以乙酸乙酯、亞油酸乙酯和3-甲基丁醛為主，澳洲AZ酒樣則以乙酸乙酯、亞油酸乙酯和異丁醇為主。

圖1 不同品種高粱釀造酒樣香味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Structural composition of flavor compound of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties

酒樣香味物質(zhì)的PCA結(jié)果見圖2。由圖2可知，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為92.80%，說(shuō)明已提取到原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息。Two-wayPERMANOVA分析結(jié)果表明，酒樣香味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成受到酒廠、高粱品種以及兩者交互作用的顯著影響（P＜0.05）。

圖2 不同品種高粱釀造酒樣香味物質(zhì)的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties

2.3 酒樣差異香味物質(zhì)的篩查

因酒樣香味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成具有酒廠差異，分別以區(qū)分和不區(qū)分酒廠的兩種方式篩查不同高粱酒樣的差異香味物質(zhì)以確定兩者之間的交集。若某一物質(zhì)在兩種篩查方式中均被獲得，且品種間的含量倍數(shù)變化一致，說(shuō)明其受酒廠因素的影響較小，是酒樣中較可靠的差異香味物質(zhì)。如圖3所示，兩個(gè)酒廠篩查出的差異香味物質(zhì)數(shù)量及其種類具有顯著差異，其中共有11個(gè)不同的差異香味物質(zhì)穩(wěn)定存在于不同高粱的酒樣之間，并且在兩種篩查方式中的含量變化趨勢(shì)一致（表2）。由表2可知，金糯粱1號(hào)酒樣的甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙醛、乙縮醛和3-甲基丁醛以及瀘州紅1號(hào)酒樣的甲酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、己酸和辛酸含量顯著高于澳洲AZ酒樣；金糯粱1號(hào)酒樣的甲酸乙酯和亞油酸乙酯含量顯著低于瀘州紅1號(hào)，但異戊酸含量顯著高于瀘州紅1號(hào)。

表2 不同品種高粱釀造酒樣的差異香味物質(zhì)Table 2 Differential flavor compounds of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties

圖3 不同品種高粱釀造酒樣差異香味物質(zhì)的韋恩圖Fig.3 Venn diagrams of differential flavor compounds of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties

2.4 酒樣香味物質(zhì)和高粱理化成分的相關(guān)性分析

由表3可知，酒樣香味物質(zhì)與高粱的粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、單寧和支鏈淀粉含量均顯著相關(guān)（P＜0.05）。以酒樣香味物質(zhì)PCA的PC1數(shù)值為因變量，高粱理化成分為自變量構(gòu)建多元線性回歸模型，結(jié)果見表4。由表4可知，單寧和支鏈淀粉含量對(duì)PC1的數(shù)值具有顯著影響（P＜0.05），說(shuō)明它們是影響酒樣香味物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)的主要因子。基于回歸模型，建立了基于單寧（X4）和支鏈淀粉（X5）預(yù)測(cè)PC1數(shù)值的回歸方程：PC1=-28.178-3.261X4+0.359X5?；貧w方程的R2為0.337，表明對(duì)PC1 數(shù)值變化的解釋度為33.70%。

表3 不同品種高粱釀造酒樣香味物質(zhì)和高粱理化成分的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 Pearson correlation analysis results of flavor compound of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties and physicochemical properties of sorghum

表4 高粱理化成分對(duì)酒樣香味物質(zhì)主成分1數(shù)值的多元線性回歸分析Table 4 Multiple linear regression analysis of physicochemical properties of sorghum and principal component 1 of flavor compounds of Baijiu samples

2.5 酒樣差異香味物質(zhì)和高粱理化成分的相關(guān)性分析

由圖4可知，甲酸乙酯、乙酸乙酯和乙縮醛的含量與粗蛋白、粗脂肪和粗淀粉的含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與單寧和支鏈淀粉的含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。以酒樣差異香味物質(zhì)為因變量，高粱理化成分為自變量構(gòu)建多元線性回歸模型見表5。由表5可知，有6個(gè)差異香味物質(zhì)的含量受到高粱理化成分的顯著影響（P＜0.05）。其中，亞油酸乙酯、乙醛和3-甲基丁醛的含量受單寧和支鏈淀粉的共同影響，甲酸乙酯和異戊酸含量受單寧影響，乙縮醛受支鏈淀粉的影響。建立了基于單寧和支鏈淀粉預(yù)測(cè)以上差異香味物質(zhì)含量的回歸方程，相關(guān)系數(shù)R2為0.292～0.663，表明對(duì)預(yù)測(cè)變量的解釋度為29.20%～66.30%。

圖4 酒樣差異香味物質(zhì)和高粱理化成分間的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果Fig.4 Pearson correlation analysis results between differential flavor compounds of Baijiu samples and physicochemical properties of sorghum

表5 高粱理化成分對(duì)酒樣差異香味物質(zhì)的多元線性回歸分析Table 5 Multiple linear regression analysis of physicochemical properties of sorghum on differential flavor compounds of Baijiu samples

續(xù)表

2.6 酒樣感官品評(píng)

不同品種高粱釀造酒樣的感官品評(píng)結(jié)果見表6。由表6可知，瀘州紅1號(hào)和金糯粱1號(hào)酒樣的感官風(fēng)味相似，均優(yōu)于澳洲AZ酒樣。

表6 不同品種高粱釀造酒樣的感官品評(píng)結(jié)果Table 6 Sensory evaluation results of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties

3 討論

3.1 酒樣香味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成

以往研究解析了不同品種高粱的大生產(chǎn)釀造酒質(zhì)差異[9-13]，但相關(guān)試驗(yàn)僅在一個(gè)酒廠開展。本研究結(jié)果表明，除高粱品種外，酒樣香味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成還因酒廠的不同而具有顯著差異。同一原料釀造酒質(zhì)具有的酒廠差異可能與多種因素有關(guān)。研究表明，白酒香味物質(zhì)的形成受釀酒原料、生產(chǎn)工藝、氣候環(huán)境等因素的影響[19-21]。雖然本研究保證了高粱品種和釀酒工藝的一致，生產(chǎn)也由同一批工人操作，但仍無(wú)法完全消除外部因素的影響。如在長(zhǎng)期的釀酒生產(chǎn)中，不同酒廠的環(huán)境中可能會(huì)形成獨(dú)特的釀酒微生物區(qū)系[22]，影響白酒發(fā)酵，造成相同原料出現(xiàn)不同的釀造效果。因此，要準(zhǔn)確評(píng)價(jià)不同原料的釀造酒質(zhì)差異必須以多酒廠、多批次的釀造試驗(yàn)為基礎(chǔ)。已往生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)雖已總結(jié)出“相同原料的釀造酒質(zhì)具有酒廠差異”，但本研究為這一生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)提供了強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)支撐。

3.2 酒樣的差異香味物質(zhì)

乙酸乙酯是清香型白酒的主體香味物質(zhì)，其含量對(duì)酒質(zhì)具有重要影響[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，瀘州紅1號(hào)和金糯梁1號(hào)酒樣的乙酸乙酯含量顯著高于澳洲AZ，這可能是它們小曲清香風(fēng)格更為純正的原因之一。乙醛是白酒的主要醛類物質(zhì)，味甜帶澀，含量過高可能造成酒體刺鼻、口感辛辣[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，金糯梁1號(hào)酒樣的乙醛含量雖顯著高于澳洲AZ，但其口感無(wú)明顯辛辣味。造成此現(xiàn)象的原因可能包括兩方面：一是金糯梁1號(hào)酒樣的乙醛含量雖高，但仍處于可接受的范圍；二是其他物質(zhì)產(chǎn)生的味覺刺激可能對(duì)乙醛引起的辛辣味具有消除作用。風(fēng)味物質(zhì)之間具有相互作用，除絕對(duì)含量外，風(fēng)味物質(zhì)在食品中的分布情況對(duì)人體的感知強(qiáng)度也具有重要影響[24]。目前研究從不同香型白酒中檢測(cè)出上千種香味物質(zhì)[18]，其結(jié)構(gòu)組成對(duì)酒質(zhì)口感的影響亟待進(jìn)一步破解。

3.3 高粱理化成分和香味物質(zhì)的相關(guān)性

高粱富含淀粉、蛋白和單寧等理化成分，含量具有品種差異，是指導(dǎo)品種選育的核心指標(biāo)[1，25]。作為中國(guó)白酒的主產(chǎn)區(qū)，四川已將培育“綠色高效釀酒專用糧重大新品種”列入十四五重大科技專項(xiàng)，解析高粱理化成分和白酒香味物質(zhì)間的關(guān)系可為新品種的培育提供明確的性狀選育方向?；趯?shí)驗(yàn)室發(fā)酵試驗(yàn)，有研究發(fā)現(xiàn)，高粱的單寧和脂肪與白酒香味物質(zhì)的含量變化顯著相關(guān)[2-3]。基于大生產(chǎn)釀造，本研究發(fā)現(xiàn)酒樣香味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成與粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、單寧和支鏈淀粉的含量均相關(guān)，其中單寧和支鏈淀粉對(duì)差異香味物質(zhì)的形成具有顯著影響，提示新品種的選育工作應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注這兩個(gè)指標(biāo)。目前研究尚未闡明高粱理化成分影響白酒香味物質(zhì)形成的作用機(jī)制，但有研究發(fā)現(xiàn)在釀酒過程中，不同單寧含量酒醅的優(yōu)勢(shì)菌群存在顯著差異[26-27]，提示原料理化成分含量的差異對(duì)微生物種群具有選擇作用。那么，由高粱理化成分含量差異引起的菌群結(jié)構(gòu)及其功能差異對(duì)理化成分的代謝流向產(chǎn)生了什么影響，又是如何導(dǎo)致酒體差異香味物質(zhì)的形成等科學(xué)問題還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究探明了3種高粱釀造清香型白酒的差異香味物質(zhì)，明確了單寧和支鏈淀粉是影響香味物質(zhì)結(jié)構(gòu)組成的主要因子，初步建立了以單寧和支鏈淀粉為自變量預(yù)測(cè)酒樣差異香味物質(zhì)含量的多元回歸方程。本研究還證明了白酒香味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成受到高粱品種和釀造酒廠的交互影響，后續(xù)研究將系統(tǒng)性開展多酒廠、多批次釀造試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化和完善相關(guān)回歸模型來(lái)指導(dǎo)釀酒生產(chǎn)。