鄭重誼，資 云，張冬雪，王嬌嬌，周 輝

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學研究生院，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南長沙410128）

單寧酶（tannase，EC 3.1.1.20）是一種水解酶，主要由微生物產(chǎn)生，可使單寧分子中的酯鍵、糖苷鍵和縮酚鍵裂解，水解后生成沒食子酸，其水解速度與酶濃度成正比［1］。單寧酶在精細化工、皮革、飼料、化妝品等行業(yè)具有廣泛的應用［2］。

單寧酶除存在于富含單寧的植物中外，還廣泛存在于微生物中，能由某些真菌在沒食子酸等誘導物存在時合成，這些菌種主要分布于曲霉屬（Aspergillus）［3－4］、擬青霉屬（Paecilomyces）［5－6］、青霉屬（Penicillium）［7－8］，其中曲霉屬的黑曲霉（Aspergillusniger）是典型代表［9－10］。

五倍子是我國的一種重要的林化產(chǎn)品，含有豐富的可降解型單寧，主要用于提取單寧酸。作者課題組在前期實驗中從五倍子加工企業(yè)的污水排放口土壤中分離得到一株產(chǎn)單寧酶的黑曲霉WB－1，作者對該黑曲霉WB－1產(chǎn)單寧酶的發(fā)酵條件以及酶學性質(zhì)進行研究，為深入了解產(chǎn)單寧酶的黑曲霉提供參考。

1 實驗

1.1 菌種及培養(yǎng)基

黑曲霉WB－1，本實驗室篩選保存。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）：馬鈴薯200g，切成小塊，加1 000mL 水煮沸30min，用4層紗布濾成清液。加水補充減少的水分，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，充分混勻后于121 ℃滅菌30min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：取5g五倍子粉和麩皮的混合物（其中五倍子粉0.5g，麩皮4.5g）、鹽溶液（組成：NH4NO35g·L－1，MgSO4·7H2O 1g·L－1，NaCl 1g·L－1）5mL充分混合均勻，自然pH 值，裝入250 mL 的三角瓶中，121 ℃滅菌20min。

1.2 單寧酶的提取及黑曲霉WB－1產(chǎn)酶條件研究

1.2.1 孢子懸浮液的制備

將黑曲霉WB－1 在PDA 斜面上活化培養(yǎng)。取28 ℃培養(yǎng)5d的新鮮斜面若干支，每支加入5mL 無菌生理鹽水，用無菌接種環(huán)將斜面上的孢子刮下來，將孢子懸浮液移入滅菌的三角瓶中，振蕩搖勻，以上操作均在無菌臺中進行，用PDA 平板計數(shù)孢子懸浮液中的孢子數(shù)量。

1.2.2 粗酶液的提取

向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入1mL 黑曲霉WB－1孢子懸浮液（1×1010個·mL－1），混合均勻，在28 ℃的培養(yǎng)箱中進行固態(tài)發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，取出裝有固態(tài)基質(zhì)的三角瓶，加入50mL pH 值5.0的檸檬酸緩沖液，置于搖床上，160r·min－1振蕩提取30min，用濾紙過濾，所得濾液即為粗酶液。

1.2.3 單寧酶酶活力的測定

根據(jù)單寧酶水解沒食子酸丙酯產(chǎn)生沒食子酸，沒食子酸可與繞單寧在堿性條件下生成色團物質(zhì)，該物質(zhì)在520nm 處有最大光吸收的原理進行測定［11］。

酶活力單位定義為：在30 ℃下，每分鐘分解產(chǎn)生1μmol沒食子酸所需要的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.2.4 發(fā)酵溫度對產(chǎn)單寧酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入WB－1 孢子懸浮液分別于24 ℃、28℃、32℃、37℃、42℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h，提取單寧酶并測定酶活力，比較不同發(fā)酵溫度下的酶活力大小。

1.2.5 發(fā)酵時間對產(chǎn)單寧酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種WB－1孢子懸浮液，在28 ℃培養(yǎng)箱中進行固態(tài)發(fā)酵，分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h、144h，提取單寧酶，測定單寧酶的酶活力。

1.2.6 外加碳源對產(chǎn)單寧酶的影響

固定發(fā)酵培養(yǎng)基中其它成分不變，鹽溶液中分別添加終濃度為1%的葡萄糖、蔗糖、α－乳糖、甘油、D－果糖、甘露醇作為外加碳源，接種WB－1孢子懸浮液，在28 ℃培養(yǎng)箱中進行固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)96h，提取單寧酶，測定單寧酶的酶活力。

1.3 單寧酶的酶學性質(zhì)研究

1.3.1 單寧酶的儲存穩(wěn)定性

將提取的單寧酶粗酶液分為若干份，置于4 ℃冰箱中儲存1周、2周、3周、4周、5周后，吸取少量單寧酶粗酶液測定并計算相對酶活力，觀察單寧酶的酶活力變化。

1.3.2 反應溫度對單寧酶酶活力的影響

將單寧酶酶解反應溫度設定為20～70℃之間，比較不同反應溫度下的酶活力大小。

1.3.3 pH 值對單寧酶酶活力的影響

配制pH 值分別為3、4、5、6、7的檸檬酸緩沖液，以不同pH 值的緩沖液來配制沒食子酸丙酯溶液，進行單寧酶酶解反應，測定單寧酶活力，比較不同pH 值下的酶活力大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉WB－1產(chǎn)酶條件研究

2.1.1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)單寧酶的影響

考察不同發(fā)酵溫度下黑曲霉WB－1產(chǎn)單寧酶酶活力的大小，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在發(fā)酵溫度為28 ℃時黑曲霉WB－1產(chǎn)單寧酶酶活力最高，這與多數(shù)文獻中報道的黑曲霉產(chǎn)單寧酶發(fā)酵溫度基本一致。發(fā)酵溫度過低或過高均不利于產(chǎn)酶或維持酶的功能穩(wěn)定性。因此，確定黑曲霉WB－1產(chǎn)單寧酶的最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.1.2 發(fā)酵時間對產(chǎn)單寧酶的影響

圖1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)單寧酶的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on tannase production

考察不同發(fā)酵時間下黑曲霉WB－1產(chǎn)單寧酶酶活力的大小，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵時間對產(chǎn)單寧酶的影響Fig.2 Effect of fermentation time on tannase production

由圖2可知，單寧酶的酶活力隨著發(fā)酵時間的延長先升高后降低，在發(fā)酵時間為96h時達到最高，為21U·g－1；超過96h后，單寧酶的酶活力下降。這是因為，隨著發(fā)酵時間的延長，單寧酶可能被菌體降解。因此，確定黑曲霉WB－1產(chǎn)單寧酶的最佳發(fā)酵時間為96h。

2.1.3 外加碳源對產(chǎn)單寧酶的影響

考察不同外加碳源下黑曲霉WB－1產(chǎn)單寧酶酶活力的大小，結(jié)果見圖3。

圖3 外加碳源對產(chǎn)單寧酶的影響Fig.3 Effect of additional carbon source on tannase production

由圖3可知，外加碳源都能提高單寧酶的酶活力，其對產(chǎn)酶的影響順序為：甘油＞α－乳糖＞D－果糖＞葡萄糖＞蔗糖＞甘露醇。其中添加甘油的效果最好，所得單寧酶的酶活力可達19.27U·g－1。

2.2 單寧酶的酶學性質(zhì)研究

2.2.1 低溫儲存穩(wěn)定性（圖4）

圖4 單寧酶的儲存穩(wěn)定性Fig.4 Storage stability of tannase

由圖4可知，隨著儲存時間的延長，單寧酶酶活力逐漸降低，儲存3周后酶活力保持在80%以上，儲存5周后仍有67%的酶活力。而儲存3個月后，單寧酶酶活力仍有52%，說明該單寧酶的低溫（4 ℃）儲存穩(wěn)定性較好。

2.2.2 最適反應溫度（圖5）

圖5 反應溫度對單寧酶酶活力的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on the activity of tannase

由圖5可知，20 ℃時單寧酶的酶活力較低，不利于單寧酶發(fā)揮催化功能，30 ℃時單寧酶的酶活力最高，可達到23U·g－1，此后隨著反應溫度的升高，單寧酶酶活力逐漸降低。說明溫度高于30℃以后，單寧酶催化反應生成沒食子酸的量減少。因此，單寧酶的最適反應溫度為30 ℃。

2.2.3 最適pH 值（圖6）

由圖6可知，單寧酶酶活力隨著pH 值的升高而升高，在pH 值為6時，酶活力達到最高，之后隨著pH值的繼續(xù)升高，單寧酶酶活力開始下降。因此，單寧酶的最適pH 值為6。

圖6 pH 值對單寧酶酶活力的影響Fig.6 Effect of pH value on the activity of tannase

3 結(jié)論

對黑曲霉WB－1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶進行了研究?？疾炝税l(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、外加碳源對黑曲霉WB－1產(chǎn)單寧酶的影響，同時考察了單寧酶的儲存穩(wěn)定性以及最適反應溫度、pH 值。結(jié)果表明，黑曲霉WB－1產(chǎn)單寧酶的最佳發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間分別為28 ℃和96 h，外加碳源有利于單寧酶的產(chǎn)生，且以甘油為外加碳源時效果最好。所產(chǎn)單寧酶的最適反應溫度和pH 值分別為30 ℃和6，而且具有一定的低溫（4 ℃）儲存穩(wěn)定性。

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