張?jiān)E，陳小雪，吳 鵬，史利霞，韓北忠

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 營養(yǎng)與健康系，北京 100083；3.河南順鑫大眾種業(yè)有限公司，河南 鄭州 450003）

小麥?zhǔn)前拙乒虘B(tài)釀造糖化發(fā)酵劑—高溫和中溫大曲的主要原料，富含淀粉、蛋白質(zhì)和多種維生素，為發(fā)酵微生物產(chǎn)酶和代謝提供營養(yǎng)基質(zhì)和發(fā)酵微環(huán)境[1]。微生物可以利用小麥中的淀粉和蛋白質(zhì)等組分產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[2]，因此，不同理化特性尤其是營養(yǎng)組分含量不同的小麥影響大曲的品質(zhì)。以小麥為原料的制曲過程對小麥籽粒的營養(yǎng)組分含量均有一定的要求，如需要較高的淀粉含量，蛋白質(zhì)含量在12%左右，含有適量的無機(jī)鹽、纖維素等[3]。不同的淀粉含量對制曲過程中的水分、酸度、淀粉、糖化力、液化力、發(fā)酵力和主要微生物類群均可以產(chǎn)生一定的影響[4]。

小麥源微生物是影響小麥制曲的另一重要因素，DU H等[5]研究發(fā)現(xiàn)，制曲原料是大曲菌群的重要來源之一，不同原料顯著影響微生物的代謝物譜；LIU C C等[6]研究發(fā)現(xiàn)，原料中的糖譜能調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中產(chǎn)風(fēng)味菌群的演替進(jìn)而影響風(fēng)味代謝物的產(chǎn)生；ZHANG Y D等[7]研究發(fā)現(xiàn)，小麥源微生物參與高溫大曲培菌初期菌群的組裝并影響初期代謝物的形成。因此，關(guān)注制曲原料源微生物有助于理解原料的選擇對大曲品質(zhì)的影響作用。

本研究通過理化檢測、高通量測序、頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspace solid phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）和氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用（gaschromatography-ionmobility spectroscopy，GC-IMS）技術(shù)比較了兩種制曲小麥（ZW1和N116）的理化性質(zhì)、微生物組成和風(fēng)味輪廓的差異，為優(yōu)選制曲原料提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

小麥樣品：小麥樣品采集于河南某種業(yè)公司，所采集的兩個(gè)品種小麥分別是眾麥1號（ZW1）和糯麥116（N116），兩種小麥均在糧食倉庫存放，在不同位置分別取3份裝于無菌袋，-80 ℃保存。

1.1.2 主要試劑

土壤基因組試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；ExTaq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：美國英杰生命技術(shù)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

NR10QC色差儀：深圳市三思時(shí)科技有限翁司；BSA2202S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；KDN-08凱氏定氮儀：上海新嘉電子有限公司；UV-1200型紫外可見分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；S-433D氨基酸分析儀：德國Sykam公司；FlavourSpec風(fēng)味分析儀：德國GAS公司；7000-3氣質(zhì)聯(lián)用儀、HP-5ms色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)的檢測

色度值：兩個(gè)品種的小麥經(jīng)人工去雜，剔除病害、雜粒和不飽滿粒后，稱取30 g籽粒，用色差計(jì)測量顏色參數(shù)。色差計(jì)先用白板校正，將種子倒?jié)M測量平皿，用直尺沿平皿表面刮平后進(jìn)行測量，獲得L*值、a*值、b*值，L*值越大，顏色越亮（白）；a*值越大，顏色越偏紅色；b*值越大，顏色越偏黃色。

淀粉含量測定：參考國標(biāo)GB 5009.9—2016《食品中淀粉的測定》；支鏈淀粉含量測定：參考國標(biāo)GB/T 15683—2008《大米直鏈淀粉含量的測定》；蛋白質(zhì)含量測定：參考國標(biāo)GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》；脂肪含量測定：參考國標(biāo)GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》；單寧含量測定：參考國標(biāo)GB/T 15686—2008《高粱單寧含量的測定》。

1.3.2 高通量測序

小麥粉碎后，采用OMEGA Soil DNA Kit提取微生物基因組，DNA質(zhì)檢合格后，以其為模板對細(xì)菌的16S rDNA V5-V7區(qū)基因序列及真菌的ITS區(qū)基因序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，細(xì)菌的PCR擴(kuò)增引物為799F（5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'）和1193R（5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3'），真菌的PCR擴(kuò)增引物為ITS5F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS1R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（10 μmmol/L）各1 μL，DNA模板2μL，雙蒸水（ddH2O）8.75μL，Q5DNAPolymerase 0.25μL。其余條件參照ZHANG Y D等[7]的方法。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，將檢驗(yàn)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海派森諾生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.3.3 生信分析

采用Illumina平臺對DNA片段進(jìn)行雙端測序，使用DADA2方法對序列進(jìn)行去引物，質(zhì)量過濾，去噪，拼接和去嵌合體，合并擴(kuò)增子序列變異體（amplicon sequence variants，ASVs）特征序列和ASV表格，并去除singletons ASVs，基于相應(yīng)功能基因的seeds蛋白序列，對核酸序列中的插入和缺失錯誤進(jìn)行糾正。小麥源細(xì)菌16S rRNA基因在Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比注釋，真菌通過Unite 8數(shù)據(jù)庫對比注釋。使用QIIME2（2019.4）軟件對微生物進(jìn)行物種組成分析，以樹圖的形式繪制微生物分類等級樹。使用PICRUSt 2軟件預(yù)測樣本功能豐度[8]。

1.3.4 風(fēng)味物質(zhì)檢測

不同品種小麥的風(fēng)味物質(zhì)通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）結(jié)合氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用（GC-IMS）技術(shù)檢測分析。

HS-SPME-GC-MS檢測：稱取小麥粉4.0 g，加入16.0 mL超純水，超聲30 min，8 000×g離心10 min，取上清8 mL，加入3.0 g氯化鈉。具體分析條件參考胡雨楠等[9]的方法。利用Agilent Masshunter Qualitative Analysis 10依據(jù)美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）14標(biāo)準(zhǔn)譜庫對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析。利用SIMCA 14.0 軟件對GC-MS結(jié)果進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least-squares discriminate analysis，OPLS-DA）篩選差異代謝物，并通過Prism 8和R-Studio v 4.1.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和可視化分析。

GC-IMS檢測：稱取小麥粉水提液2.0 mL，置于20 mL頂空瓶中，80 ℃孵育20 min后進(jìn)樣分析。分析條件：分析時(shí)間20 min，MXT-5色譜柱（15 m×0.53 mm×1.0 μm），柱溫60 ℃，載氣為氮?dú)猓∟2），IMS溫度45 ℃，進(jìn)樣體積500 μL，孵育時(shí)間20min，孵育溫度80℃，進(jìn)樣針溫度85℃，孵化轉(zhuǎn)速500r/min，流速起始為2 mL/min，10 min后流速升至10 mL/min[10]。使用VOCal查看分析譜圖和數(shù)據(jù)的定性定量，通過軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)進(jìn)行定性分析；使用Reporter插件對比樣品之間的譜圖差異；使用Gallery Plot插件進(jìn)行指紋圖譜對比，比較不同樣品之間的揮發(fā)性有機(jī)物差異。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

理化檢測結(jié)果通過Prism 8進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)算樣品間的差異顯著性（P＜0.05），數(shù)據(jù)可視化主要通過R studio v4.1.1完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種小麥籽粒表皮的色度值

兩個(gè)品種小麥籽粒表皮的顏色參數(shù)見圖1。由圖1可知，兩個(gè)品種的小麥籽粒表皮顏色存在顯著差異，ZW1小麥籽粒表皮的L*值顯著高于N116小麥（P＜0.05），說明ZW1小麥籽粒表皮顏色更亮；N116小麥籽粒表皮的a*值顯著高于ZW1小麥，表明N116小麥籽粒表皮顏色更偏紅；兩種小麥籽粒表皮的b*值無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，小麥外觀特征可作為區(qū)分不同品種小麥的方法，通過大量數(shù)據(jù)采集進(jìn)行色度值的區(qū)分有助于快速準(zhǔn)確地鑒別小麥品種，對大曲生產(chǎn)過程中制曲原料的選擇有輔助作用。

圖1 不同品種小麥籽粒表皮的色度值Fig.1 Color values of grain epidermis of different wheat varieties

2.2 不同品種小麥的營養(yǎng)組分含量

兩種小麥的營養(yǎng)組分見圖2。由圖2可知，N116小麥的平均蛋白質(zhì)含量（15.16 g/100 g）和脂肪含量（1.61 g/100 g）均顯著高于ZW1（11.79 g/100 g，1.41 g/100 g）（P＜0.05），兩種小麥總淀粉含量無顯著性差異（P＞0.05）。最值得注意的是，ZW1小麥中直鏈淀粉的含量（22.78 g/100 g）顯著高于N116小麥（0.53 g/100 g）（P＜0.05），說明兩種小麥的淀粉種類存在巨大差異，ZW1小麥的淀粉中直鏈淀粉較高，而N116小麥中的淀粉幾乎全部是支鏈淀粉。直鏈淀粉和支鏈淀粉都是淀粉中的多聚糖成分，前者的D-葡萄糖基主要以直鏈狀結(jié)構(gòu)α-（1,4）糖苷鍵連接而成，后者在分支位點(diǎn)主要以支鏈狀結(jié)構(gòu)α-（1,6）糖苷鍵連接而成[11]。梅懷文等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在青稞酒的釀造過程中，直鏈淀粉在發(fā)酵過程中從占比15%左右降至0，而支鏈淀粉從60%左右降至12%左右。李秋濤等[13]比較了不同直、支鏈淀粉含量的大米、高粱的糊化情況和蒸煮香氣，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室和窖池發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明，同種糧食直鏈淀粉含量越高，淀粉結(jié)構(gòu)越緊密，糊化時(shí)間越長，糧香越濃；不同種類的糧食淀粉顆粒大小、結(jié)構(gòu)不同，糊化時(shí)間也不同。楊佳等[14]將糯小麥以不同比例添加到普通小麥用于制曲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糯小麥對大曲品質(zhì)有積極影響，并認(rèn)為這是由于糯小麥支鏈淀粉比例高，更容易吸收水分子，糊化起始溫度低，糊化更充分，有利于微生物的繁殖和代謝產(chǎn)酶。從酒的香氣角度講，生產(chǎn)淡雅型酒用支鏈淀粉高的糧食原料較好，生產(chǎn)濃郁型酒用直鏈淀粉高的糧食原料較好。以上分析說明，制曲小麥淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例不同會對大曲培菌的過程產(chǎn)生一定影響，淀粉種類對微生物代謝的具體作用還需進(jìn)一步研究。

圖2 不同品種小麥的營養(yǎng)組分含量Fig.2 Contents of nutrient components in different wheat varieties

此外，兩種小麥水解氨基酸的含量也存在差異，在所有測得的16種氨基酸中，N116小麥的含量均高于ZW1小麥，這與N116小麥中蛋白質(zhì)的含量顯著高于ZW1小麥有直接關(guān)聯(lián)。其中，谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸和天冬氨酸的含量差異最為明顯。侯陽陽等[15]在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵模擬葡萄汁進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)分別補(bǔ)加了不同氨基酸，分析了釀酒酵母生長、發(fā)酵速率以及最終乙醇、有機(jī)酸和高級醇含量的變化，結(jié)果表明，丙氨酸和纈氨酸能顯著增加釀酒酵母的生物量并提高發(fā)酵速率，提高最終乙醇和異丁醇含量，而高濃度的半胱氨酸和賴氨酸抑制釀酒酵母生長和發(fā)酵速率，顯著增加了有機(jī)酸含量。張雙梅等[16]在桑葚果汁中分別添加異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸制備桑葚酒，探究外源添加氨基酸對桑葚酒風(fēng)味和品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，外源添加單一氨基酸可顯著提高桑葚酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量和口感評分。氨基酸是酵母可同化氮的主要來源之一，可被酵母吸收并用于生長和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，如產(chǎn)生高級醇及酯類物質(zhì)，在酵母生長穩(wěn)定期添加精氨酸，可促進(jìn)酯類物質(zhì)的生成[17]。不同種類的氨基酸經(jīng)微生物代謝后可產(chǎn)生不同代謝物而影響發(fā)酵食品的風(fēng)味和品質(zhì)，如支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸）與苯丙氨酸可顯著提高葡萄酒中相應(yīng)高級醇及其乙酸酯的含量[18]。

總之，不同品種制曲小麥營養(yǎng)組分的差異可能對制曲過程中微生物的演替產(chǎn)生一定影響，微生物以此為底物進(jìn)一步代謝產(chǎn)生不同的風(fēng)味，最終造成大曲的品質(zhì)差異。

2.3 不同品種小麥的微生物組成分析

由圖3a可知，在細(xì)菌門水平，兩種小麥源微生物相對豐度最高的細(xì)菌門均為變形菌門（Proteobacteria），相對豐度均＞80%，其次為放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），此外，擬桿菌門（Bacteroidetes）在N116小麥中的相對豐度（4.60%）明顯高于ZW1小麥（0.39%）。在細(xì)菌科水平，兩種小麥的微生物菌群組成有較大差異，ZW1小麥中相對豐度最高的細(xì)菌科為腸桿菌科（Enterobacteriaceae）（38.92%），其次為鹽單胞菌科（Halomonadaceae）（11.85%）、草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）（9.09%）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae）（4.35%）。N116小麥中相對豐度最高的細(xì)菌科為鹽單胞菌科（Halomonadaceae），相對豐度＞40%，其次為腸桿菌科（Enterobacteriaceae）（20.61%）和草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）（4.92%），此外，紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、韋榮氏菌科（Veillonellaceae）和消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）的相對豐度均在N116小麥中＞1%，且未在ZW1小麥中檢出。由圖3b可知，兩種小麥源真菌組成相似且單一，在真菌門水平上，子囊菌門（Ascomycota）相對豐度占絕對優(yōu)勢。在真菌科水平上，格孢腔菌科（Pleosporaceae）占據(jù)絕對優(yōu)勢，相對豐度＞98%。KANG J M等[19]研究發(fā)現(xiàn)，部分腸桿菌科（Enterobacteriaceae）是馥郁香型白酒在冬季的固態(tài)糖化發(fā)酵過程中最重要的細(xì)菌；PANG X N等[20]通過研究清香型白酒原料預(yù)處理過程菌群的組成和功能發(fā)現(xiàn)，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的相對豐度與2-乙基-3,5-二甲基-吡嗪含量呈強(qiáng)正相關(guān)。草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）通常在作物的根際被檢出，因此不同種植區(qū)域的小麥攜帶的微生物可能存在差異，通過種植區(qū)的選擇可以對制曲小麥的品質(zhì)進(jìn)行控制[21]；ZOU W等[22]提出，部分紫單胞菌科（Por phyromonadaceae）與濃香型白酒的發(fā)酵存在密切關(guān)系，是窖泥、黃水中的優(yōu)勢微生物，這說明N116小麥中的紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）可能參與制曲培菌過程中甚至白酒發(fā)酵過程中的微生物演替，而ZW1小麥中卻未檢出；SU C等[23]通過對小曲酒發(fā)酵劑的菌群研究發(fā)現(xiàn)，普雷沃菌科（Prevotellaceae）與十六烷酸甲酯、乙醛、3-辛酮和乙偶姻具有很強(qiáng)的相關(guān)性，且對酸度有一定影響，同樣，普雷沃菌科（Prevotellaceae）只在N116小麥中被檢出且作為優(yōu)勢微生物之一。綜上，兩個(gè)品種小麥攜帶的細(xì)菌菌群存在明顯差異，而小麥源真菌組成高度相似，因此，后續(xù)研究小麥源微生物對大曲群落組裝的作用應(yīng)該將重點(diǎn)放在細(xì)菌菌群，這與之前的研究結(jié)論一致[5]。不同的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)可能對大曲培菌期的微生物群落組成產(chǎn)生不同的作用，進(jìn)一步影響大曲的品質(zhì)。

圖3 眾麥1號和糯麥116的細(xì)菌（a）和真菌（b）在不同分類學(xué)水平的群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Community structure of bacteria (a) and fungi (b) from wheat ZW1 and N116 at different taxonomic levels

基于兩種小麥攜帶細(xì)菌和真菌菌群的組成分析結(jié)果，進(jìn)一步深入分析細(xì)菌菌群的差異，結(jié)果見圖4。由圖4a可知，ZW1和N116小麥特有的ASVs數(shù)目分別為902個(gè)和752個(gè)，共有的ASVs數(shù)目為247個(gè)。由圖4b可知，β-變形菌綱（Betaproteobacteria）和α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）更多分布在ZW1小麥中，而擬桿菌綱（Bacteroidia）和梭菌綱（Clostridia）則主要分布于N116小麥中，這一結(jié)果從不同分類學(xué)水平說明了兩種小麥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。

圖4 眾麥1號和糯麥116細(xì)菌菌群ASVs數(shù)目的韋恩圖（a）及分類等級樹圖（b）Fig.4 Venn diagram (a) and classification tree (b) of ASVs number of wheat ZW1 and N116

2.4 PICRUSt 2功能預(yù)測

使用PICRUSt 2軟件對不同品種小麥細(xì)菌菌群的基因功能進(jìn)行預(yù)測，二級功能類群統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖5。

圖5 不同品種小麥細(xì)菌菌群的二級功能類群統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.5 Statistical results of secondary functional groups of bacterial flora of different wheat varieties

由圖5可知，N116小麥樣品中的細(xì)菌菌群在8個(gè)代謝通路（氨基酸生物合成、芳香族化合物生物合成、脂肪酸和脂質(zhì)生物合成、酒精降解、發(fā)酵、糖酵解、乙醛酸循環(huán)、糖酵解的超級通路）上的相對豐度更高，ZW1小麥樣品的細(xì)菌菌群在13個(gè)代謝通路（碳水化合物生物合成、次生代謝物生物合成、氨基酸降解、芳香族化合物降解、碳水化合物降解、脂肪酸和脂質(zhì)降解、戊糖磷酸途徑等）中具有更高的豐度。進(jìn)一步地，將通路與物種進(jìn)行關(guān)聯(lián)，使用分層的樣本代謝通路豐度表進(jìn)行通路的物種組成分析。本研究選取代謝通路統(tǒng)計(jì)結(jié)果中差異倍數(shù)較大且在發(fā)酵過程中有重要作用的通路加以說明，結(jié)果見圖6。

微生物群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果顯示，ZW1小麥源細(xì)菌中腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的相對豐度明顯高于N116小麥，由圖6可知，腸桿菌科在關(guān)鍵的差異代謝通路中貢獻(xiàn)最突出，尤其是糖類和氨基酸代謝相關(guān)的通路，包括D-葡萄糖酸降解Ⅰ、D-葡萄糖二酸和D-半乳糖酸降解的超通路、酮葡萄糖酸代謝、D-半乳糖酸降解Ⅰ、L-精氨酸和L-鳥氨酸降解的超通路、鳥氨酸降解超通路、L-精氨酸、腐胺和4-氨基丁酸降解的超通路。腸桿菌科是大曲發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌之一，許多研究都指出腸桿菌科與很多重要風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生具有很強(qiáng)的相關(guān)性[24]，這佐證了其在糖類和氨基酸類物質(zhì)代謝中的重要作用。值得注意的是，部分植物相關(guān)的腸桿菌科是條件致病菌，在低水分的介質(zhì)中可存活較長時(shí)間導(dǎo)致感染[25]。這啟示我們攜帶不同菌群的制曲原料可能對大曲培菌過程的部分代謝功能產(chǎn)生不同作用，同時(shí)也要警惕小麥源致病微生物可能對大曲菌群產(chǎn)生的不良影響。

圖6 PICRUSt2預(yù)測代謝途徑的微生物群落組成Fig.6 Predicted microbial community composition of metabolic pathways by PICRUSt2

2.5 不同品種小麥揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

采用HS-SPME-GC-MS對ZW1和N116小麥的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行全面分析，結(jié)果見圖7。

由圖7a可知，采用HS-SPME-GC-MS從兩個(gè)品種小麥中共篩選得到44種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括1種醇類、4種醛酮類、6種酚酸類、17種酯類和16種其他類。由圖7b可知，對解析出的小麥揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行OPLS-DA發(fā)現(xiàn)，每種小麥樣品組內(nèi)聚類效果較好，樣品重復(fù)性良好，結(jié)果具有較高的可信度，說明ZW1小麥和N116小麥的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)輪廓具有明顯的差異。由圖7c可知，從不同種類揮發(fā)性物質(zhì)的含量來看，N116小麥中的酯類物質(zhì)、酚酸類物質(zhì)總含量高于ZW1小麥，具體主要體現(xiàn)在對甲酚、百里酚、4-叔丁基環(huán)己基甲基乙基膦酸酯、重氮乙酸，2-異丙基-5-甲基環(huán)己酯和咪唑-2-酰肼-1-羧酸甲酯等的含量。值得注意的是，百里酚是一種制作香精的原料，天然存在于一些植物中，具有抗真菌的功能，最突出的作用是殺蟲，已有研究表明百里酚及其類似物可作為殺蟲劑應(yīng)用于病蟲的防治[26]。本研究預(yù)測小麥中檢出的百里酚可能是小麥種植過程中噴灑的殺蟲劑的成分之一，因此可根據(jù)小麥的代謝物檢測進(jìn)行優(yōu)選和質(zhì)控。

圖7 不同小麥樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Fig.7 Analysis results of volatile flavor components in different wheat samples by GC-MS

采用GC-IMS技術(shù)對ZW1和N116小麥的揮發(fā)性風(fēng)味 物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖8。

圖8 GC-IMS檢測不同小麥樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的3D和2D譜圖（a）和指紋圖譜（b）Fig.8 3D and 2D spectrum (a) and fingerprint (b) of volatile flavor compounds in different wheat samples by GC-IMS

由圖8a可知，兩種小麥的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量存在差異，總的來說，N116小麥樣品中揮發(fā)風(fēng)味物質(zhì)的種類和相對含量更高，即風(fēng)味物質(zhì)的豐富度更高。由圖8b可知，圖中A區(qū)域物質(zhì)（2-己烯醛）在ZW1小麥樣品中含量較高；B區(qū)域物質(zhì)在ZW1和N116小麥樣品中分布相似，主要包括乙醇、3-甲基丁醇、2-甲基丁醇、E-2-庚醛、6-甲基5-庚烯2-酮、丙酮、1-戊烯-3-酮、乙酸甲酯和辛酸乙酯；C區(qū)域物質(zhì)在N116小麥樣品中更豐富，主要有2-甲基丁酸甲酯、2-丁酮、2-戊酮、2-庚酮、2-辛酮、1-戊烯-3-醇、1-戊醇、1-丁醇、1-己醇、3-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃和2-乙基-3,5對甲基吡嗪等。2-己烯醛可以產(chǎn)生類似綠草的清新氣味[27]，2-甲基丁酸甲酯可以產(chǎn)生典型的甜瓜香氣，2-丁酮可以產(chǎn)生略強(qiáng)烈、甜味、刺激性、類似丙酮樣的風(fēng)味，常在豆類中被檢出[28-29]，這表明N116小麥具有更豐富此類風(fēng)味物質(zhì)成分。

3 結(jié)論

通過對ZW1和N116兩個(gè)品種制曲小麥的理化特性、微生物菌群組成和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，兩種小麥表皮色度存在差異，N116小麥籽粒的蛋白質(zhì)和脂肪含量更高，而ZW1小麥籽粒中的直鏈淀粉含量更高。高通量測序結(jié)果表明，ZW1小麥中腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的相對豐度明顯高于N116小麥，腸桿菌科在一些糖類和氨基酸代謝相關(guān)的通路中功能豐度更高。N116小麥中的鹽單胞菌科（Halomonadaceae）的相對豐度明顯高于ZW1小麥。揮發(fā)性代謝物檢測結(jié)果表明，兩種小麥的風(fēng)味特征存在較大差異，主要體現(xiàn)在酯類、醇類和醛酮類的含量上，總的來說N116小麥中的風(fēng)味物質(zhì)含量更豐富。本研究對兩個(gè)品種的制曲小麥的微生物和風(fēng)味特征作了全面的比較分析，為優(yōu)選制曲小麥品種、質(zhì)檢和品控提供了理論支撐。