解雙瑜，孫 波，李 智，柳 凱，趙子偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

東北酸菜是一種東北傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜制品[1-2]。其做法是將白菜完全浸入一定濃度的鹽水（NaCl）中壓實(shí)密封后接菌或自然發(fā)酵[3]。在酸菜發(fā)酵過程中，涉及到許多微生物的增殖與代謝作用[4-6]，其中以乳酸菌等能夠產(chǎn)生乳酸的微生物為主[7-8]，同時(shí)還包含一些不利于酸菜發(fā)酵的有害菌，這些有害菌的耐鹽性通常弱于乳酸菌，此時(shí)添加一定量的鹽能夠起到抑制雜菌滋生及調(diào)節(jié)白菜細(xì)胞滲透壓的作用，因此傳統(tǒng)酸菜中鹽的添加量通常在3%～5%甚至更高[9-11]。而目前越來越多的研究表明，食鹽中的鈉攝入過多會增加人們患心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[12-13]，因此減鹽成為食品加工業(yè)發(fā)展的一大趨勢。

在減鹽的同時(shí)為了保證食品的品質(zhì)，最有效的方式就是用其他鹽類替代鈉鹽，最常用的就是氯化鉀[14-16]。由于K+和Na+對于細(xì)胞滲透壓和物質(zhì)交換速率的影響程度不同[17]，氯化鉀與氯化鈉對于相同微生物的增殖與代謝會產(chǎn)生不同的影響[18-20]。而且在酸菜發(fā)酵過程中采用氯化鉀替代氯化鈉，也會對其中的微生物種群產(chǎn)生影響，這種影響可能會在一定程度上改變酸菜的品質(zhì)。因此，通過比較不同KCl替代量對東北酸菜細(xì)菌菌群多樣性的影響，研究K+和Na+對于東北酸菜發(fā)酵特性影響的差異性，為低鈉酸菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論參考依據(jù)。

本研究以添加NaCl的酸菜作為對照組，采用不同比例的KCl替代其中的NaCl，使用高通量測序分析比較不同替代鹽體系下自然發(fā)酵酸菜樣品中細(xì)菌菌群多樣性的變化，并分析其感官品質(zhì)的變化。旨在保證東北酸菜發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的同時(shí)，降低東北酸菜中的鈉含量，為未來低鈉酸菜的研究與開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白菜：黑龍江省哈爾濱市；精制食用鹽（食品級）：中鹽天津市長蘆鹽業(yè)有限公司；氯化鉀（食品級）：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；TIANamp Bacteria基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit提取試劑盒（離心柱型）：天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DDY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；Bio-rad T100梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國BIO-RAD公司；Illumina NovaSeq 6000測序平臺：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 東北酸菜的制備和取樣

東北酸菜的制備：取150 kg大缸，將75 kg挑選后的白菜原料洗凈瀝干后整顆碼入缸中壓實(shí)，在碼放過程中按照白菜質(zhì)量的3%加入具有不同氯化鉀含量的鹽。其中，SC1：100%NaCl；SC2：25%KCl+75%NaCl；SC3：50%KCl+50%NaCl；SC4：75%KCl+25%NaCl；SC5：100%KCl。碼放完畢后每缸中加入75 kg水。自然發(fā)酵60 d后取樣。

1.3.2 高通量測序分析

采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取酸菜樣品的DNA，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳對基因組DNA的純度和濃度進(jìn)行檢測[21]。檢測合格后，用無菌水將基因組DNA樣本稀釋至1 ng/μL，并以此作為模板，使用通用引物314F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）對16S rRNA基因的V3-V4區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：Phusion Master Mix（2×）15 μL，Primer 3 μL，模板DNA（1 ng/μL）10 μL，雙蒸水（ddH2O）2 μL。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托天津諾禾致源生物信息科技公司基于Illumina測序平臺，利用雙端測序的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行雙端測序。

1.3.3 感官品質(zhì)評價(jià)

參考CHOI Y J等[22-23]的方法對東北酸菜樣品的感官品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)。挑選20名經(jīng)過訓(xùn)練后的品評人員（10名男性和10名女性）組成感官小組，采用9點(diǎn)偏好量表從酸味、咸味、苦味、顏色、整體評價(jià)對酸菜進(jìn)行質(zhì)量描述分析。其中酸味、咸味和苦味采用9分制評分，1=很弱，3=弱，5=中等，7=強(qiáng)，9=非常強(qiáng)。顏色和整體評價(jià)使用9分制進(jìn)行評分，其中1=非常不喜歡，3=不喜歡，5=無喜惡，7=喜歡，9=非常喜歡。所有樣品在不告知感官評價(jià)小組成員的條件下隨機(jī)編號。感官評價(jià)小組成員每品嘗完一個(gè)樣品后，用清水漱口，再進(jìn)行下一個(gè)樣品的品嘗。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS 27.0分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)顯著水平P＜0.05時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用Origin 9.0軟件處理作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酸菜樣品的細(xì)菌菌群Alpha多樣性分析

稀釋曲線和等級聚類曲線是常見的描述組內(nèi)細(xì)菌物種多樣性的曲線，不同酸菜樣品細(xì)菌菌群的稀釋曲線與等級聚類曲線見圖1。由圖1可知，各酸菜樣品的稀釋曲線在30 000時(shí)趨向平穩(wěn)，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理。等級聚類曲線可直觀的反映細(xì)菌物種豐富度和均勻度[24]。由圖1亦可知，SC5樣品細(xì)菌菌群的豐富度與均勻度最高。

圖1 不同酸菜樣品細(xì)菌菌群的稀釋曲線（A）與等級聚類曲線（B）Fig.1 Dilution curves (A) and hierarchical clustering curves (B) of bacterial flora in different sauerkraut samples

不同KCl替代量酸菜樣品的細(xì)菌菌群Alpha多樣性分析結(jié)果見表1。Observed-species、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)代表細(xì)菌菌群的豐富度；數(shù)值越大，細(xì)菌菌群豐富度越高。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)代表細(xì)菌多樣性；Shannon值越大，Simpson指數(shù)越小，細(xì)菌多樣性越高[25]。由表1可知，隨著KCl替代量的增加，細(xì)菌菌群多樣性整體呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢，豐富度呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。當(dāng)KCl替代量達(dá)到100%時(shí)，其細(xì)菌菌群多樣性與豐富度均高于未添加KCl的樣品，這與等級聚類曲線所示結(jié)果相同。

表1 不同酸菜樣品細(xì)菌菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果Table 1 Alpha diversity analysis results of bacterial flora in different sauerkraut samples

2.2 不同酸菜樣品細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 基于門水平不同酸菜樣品細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

從酸菜樣品中共檢測到20個(gè)細(xì)菌菌門，其中KCl替代量為50%的酸菜樣品菌門種類最少（11個(gè)），KCl替代量為100%的酸菜樣品菌門種類最多（17個(gè)）?；陂T水平，不同KCl替代量酸菜樣品的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)見圖2。由圖2可知，在所有酸菜樣品中，占據(jù)最優(yōu)勢地位的門是厚壁菌門（Firmicutes），其在KCl替代量為50%的酸菜樣品中相對最高達(dá)94.6%，在KCl替代量為100%的酸菜樣品中相對豐度最低為63.3%。KCl替代量為0的酸菜樣品中還存在29.2%的變形菌門（Proteobacteria），但在含有KCl的所有酸菜樣品中變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度均＜8%。此外KCl替代量為100%的酸菜樣品中還存在著27.0%的放線菌門（Actinobacteriota），而其相對豐度在其他酸菜樣品中均＜2%。結(jié)果表明，KCl替代量的增加會導(dǎo)致酸菜中出現(xiàn)新的優(yōu)勢菌門，但酸菜中優(yōu)勢菌門的相對豐度可能與KCl替代量之間無線性關(guān)系。

圖2 基于門水平不同酸菜樣品細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of bacterial community structure of different sauerkraut samples based on phylum level

2.2.2 基于屬水平不同酸菜樣品細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

從酸菜樣品中共檢測到454個(gè)細(xì)菌菌屬，其中KCl替代量為50%的酸菜樣品菌屬種類最少（222個(gè)），KCl替代量為100%的酸菜樣品菌屬種類最多（252個(gè)）?；趯偎剑煌琄Cl替代量酸菜樣品的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)見圖3。由圖3可知，在每個(gè)酸菜樣品中，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度都是最高的。在KCl替代量為0的酸菜樣品中，Lactobacillus的相對豐度為66.5%，當(dāng)KCl替代量增加至25%時(shí)，酸菜樣品中Lactobacillus的相對豐度為85.8%，隨后隨著KCl替代量的增加逐漸下降，當(dāng)KCl替代量為100%時(shí)，酸菜樣品中的Lactobacillus相對豐度為58.6%。明串珠菌屬（Leuconostoc）與乳球菌屬（Lactococcus）存在于每個(gè)酸菜樣品中，且均在KCl替代量為50%的酸菜樣品中最高，此時(shí)Leuconostoc與Lactococcus的相對豐度分別為5.4%和1.8%。此外，在KCl替代量為0的酸菜樣品中存在5.1%的克雷伯桿菌屬（Klebsiella），在KCl替代量為100%的酸菜樣品中存在17.1%的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium），這兩種菌屬雖然在其他樣品中也存在，但其相對豐度均＜0.1%。拉恩氏菌屬（Rahnella1）只存在于KCl替代量為0的酸菜樣品中，而鹽池棲菌屬（Halostagnicola）在KCl替代量為0的酸菜樣品中未檢出，其余酸菜樣品中均能檢測到，且其相對豐度隨KCl替代量的增加而逐漸增加，當(dāng)KCl替代量達(dá)到100%時(shí)，其相對豐度達(dá)到3.6%。

圖3 基于屬水平不同酸菜樣品的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of bacterial community structure of different sauerkraut samples based on genus level

2.3 不同酸菜樣品基于OTU的Venn圖

不同酸菜樣品基于操作分類單元（operationaltaxonomic units，OTU）的韋恩圖見圖4。由圖4可知，在酸菜的發(fā)酵過程中，大部分的細(xì)菌屬都是相同的，但仍有部分細(xì)菌屬隨KCl替代量的變化而有所不同。隨著KCl替代量的增加，不同酸菜樣品的特有OTU數(shù)量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢。當(dāng)KCl替代量為100%時(shí)，其特有OTU數(shù)量最高為47個(gè)，當(dāng)KCl替代量為50%時(shí)，其特有OTU數(shù)量最低為15個(gè)。結(jié)果表明，在酸菜樣品中同時(shí)存在NaCl與KCl時(shí)，樣品中的菌群種類相似度較高，而當(dāng)樣品中只有NaCl或KCl時(shí)，樣品中就會出現(xiàn)與其他樣品中不同的菌群種類。

圖4 不同酸菜樣品操作分類單元的Venn圖Fig.4 Venn diagram of operational taxonomic unit of different sauerkraut samples

2.4 不同酸菜樣品物種差異性分析

選取平均相對豐度排名前30的細(xì)菌屬，根據(jù)其在每個(gè)酸菜樣本中的相對豐度信息，從物種和樣本兩個(gè)層面進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖5。

圖5 不同酸菜樣品物種豐度聚類熱圖（a）及β多樣性指數(shù)熱圖（b）Fig.5 Heatmap of species abundance clustering (a) and β diversity index (b) of different sauerkraut samples

由圖5a可知，SC2樣品與SC3樣品之間的相似度比較高，其次是SC4樣品。說明當(dāng)KCl替代量在25%～75%時(shí)，酸菜樣品之間細(xì)菌群落的相似度較高，而KCl替代量為0與100%時(shí)，與其他樣品之間的相似度較低。由圖5b可知，差異最小的兩個(gè)樣品為SC2與SC3樣品，其相異系數(shù)為0.038，差異最大的兩個(gè)樣品為SC1和SC5，其相異系數(shù)為0.363。SC2、SC3樣品與SC4樣品的相異系數(shù)均為0.064。且SC1、SC5樣品與其他樣品間的相異系數(shù)均＞0.2。說明當(dāng)KCl替代量為0或100%時(shí)，其樣品與其他樣品之間的菌群差異較大，這與物種豐度聚類熱圖的分析結(jié)果一致。

2.5 不同酸菜樣品的感官品質(zhì)評價(jià)

不同酸菜樣品的感官品質(zhì)評價(jià)見圖6。由圖6可知，KCl替代量對于酸菜的咸味與顏色并沒有顯著的影響（P＞0.05）。而對酸菜的酸味、苦味與整體評價(jià)有顯著的影響（P＜0.05）。當(dāng)KCl替代量為0時(shí)，酸菜的酸味評分與整體評價(jià)分別為7.0分和7.9分，這兩個(gè)評分隨著KCl替代量的增加而減少，當(dāng)KCl替代量達(dá)到100%時(shí)，酸味評分與整體評價(jià)分別顯著降低至4.8分和2.0分（P＜0.05）。當(dāng)KCl替代量為0時(shí)，酸菜的苦味評分為1.4分，其評分隨著KCl替代量的增加而逐漸增加，當(dāng)KCl替代量達(dá)到100%時(shí)，苦味評分增加至5.7分。同時(shí)從圖7亦可知，當(dāng)KCl替代量到達(dá)50%時(shí)，酸菜的苦味與整體評價(jià)發(fā)生了顯著性的變化。這說明KCl替代NaCl的量不宜超過50%。

圖6 不同酸菜樣品的感官評價(jià)Fig.6 Sensory evaluation of different sauerkraut samples

3 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)分析了KCl替代NaCl對于東北酸菜中細(xì)菌菌群多樣性的影響。結(jié)果表明，KCl替代NaCl會增加酸菜細(xì)菌菌群的多樣性和豐富度，同時(shí)當(dāng)KCl替代量逐漸增加時(shí)酸菜中會出現(xiàn)新的細(xì)菌菌群，其相對豐度也會隨著KCl替代量的改變而發(fā)生變化，但這種變化與KCl替代量不呈現(xiàn)線性相關(guān)。當(dāng)KCl替代量在25%～75%時(shí)，酸菜樣品之間細(xì)菌群落的相似度較高，而KCl替代量為0與100%時(shí)，與其他酸菜樣品之間的相似度較低。當(dāng)KCl替代量＞50%時(shí)，酸菜會出現(xiàn)明顯的苦味，整體感官評分顯著下降。因此KCl替代NaCl的比例不宜超過50%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果能為未來低鈉酸菜的研究與開發(fā)提供依據(jù)。未來的研究還應(yīng)圍繞對酸菜發(fā)酵工藝的改進(jìn)，以期達(dá)到在保障酸菜品質(zhì)的同時(shí)減少NaCl添加量的目的。