黎麗，曹怡芳，張艷，肖性龍

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

阪崎克諾桿菌是一種桿狀的革蘭氏陰性能嚴重危 害特定人群生命安全的條件致病菌[1]。它可導致新生兒嚴重的腦膜炎、小腸結腸炎、敗血癥和菌血癥，死亡率高達27%[2]。出生后兩個月內的新生兒，尤其是體重不足的早產(chǎn)兒[3]，胃酸較少，免疫能力不足，他們的細菌感染風險更高[4]，病死率可達到40%~80%[5]。相對于其它常見食源性致病菌大腸桿菌O157:H7、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌，阪崎克羅諾桿菌具有更強耐干燥脅迫能力[6]。在高溫干燥的生產(chǎn)環(huán)境中，阪崎克羅諾桿菌在PIF基質成分的保護作用下，依舊能表現(xiàn)出較強的存活能力[7]，PIF在生產(chǎn)過程中通常采用巴氏殺菌，PIF生產(chǎn)設施中與克羅諾桿菌污染較高相關的區(qū)域包括噴霧干燥器、流化床和空氣過濾設施[8]，巴氏滅菌只能在PIF生產(chǎn)的早期階段滅活阪崎克羅諾桿菌，但在控制來自下游成分、過濾器、噴霧干燥塔和其他加工設備的污染方面無效，阪崎克羅諾桿菌能在噴霧干燥中存活并長期存在[9]。由此可能形成巨大的食品安全隱患，成為食品微生物污染與控制的難點。綜上所述，研究阪崎克羅諾桿菌耐干燥，最重要的一個原因是其污染的傳播途徑是水分活度低級的食品-PIF，因此研究阪崎克羅諾桿菌耐干燥特性有重要意義。

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）是一種廣泛存在于微生物和動物、植物中的非蛋白氨基酸。γ-氨基丁酸轉氨酶基因gabT是阪崎克羅諾桿菌代謝GABA分支的關鍵基因之一。在植物方面，在高等植物中，很多研究報導表明GABA旁路是植物耐受干旱脅迫的重要機制，逆境脅迫會導致植物體內大量積累GABA[10]。Bao等[11]通過沉默番茄中gabT基因，導致番茄中GABA含量增加，琥珀酸含量降低，提高番茄耐鹽性。Renault等[12]研究表明，gabT是耐鹽擬南芥GABA代謝調控的關鍵。GABA代謝旁路在微生物對環(huán)境脅迫如耐酸[13]、應激反應[14]和致病性細菌毒力[15]的響應中起著重要作用。研究表明，突變的gabT基因降低了丁香假單胞菌[16]的致病性。Hu等[17]通過使用iTRAQ等蛋白組學方法系統(tǒng)性研究了阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544的耐干燥脅迫機制，發(fā)現(xiàn)在干燥脅迫下腐胺（Putrescine）代謝相關的酶PuuR、PuuA、PuuD大幅上調表達，表明菌體內GABA的合成被大幅激活，因而顯示了腐胺等多胺降解積累的GABA可能是阪崎克羅諾桿菌耐干燥脅迫的重要機制，合成路徑如圖1所示。因此，GABA對生物體耐受逆境脅迫有重要作用，然而相關研究多見于植物，但在細菌方面的研究很少。gabT基因是否能通過調節(jié)GABA代謝影響阪崎克羅諾桿菌的活性，干燥應激環(huán)境對GABA合成量有什么影響尚不清楚。

鑒于阪崎克羅諾桿菌較其他腸桿菌具有較強的干燥環(huán)境耐受性，能夠長期生存于PIF中，且對新生兒有潛在的危害性，因此對于阪崎克羅諾在干燥環(huán)境耐受機制的研究有重大意義。為了探究gabT基因是否能通過調節(jié)GABA代謝影響阪崎克羅諾桿菌的活性，干燥應激環(huán)境對GABA合成量的影響，本研究通過基因敲除技術獲得阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544的gabT基因缺失株即ΔgabT菌株，以阪崎克羅諾桿菌野生株WT 和ΔgabT菌株為研究對象，開展干燥逆境脅迫下菌體存活率測定、細胞內GABA含量測定實驗，同時借助掃描電子顯微鏡分析干燥脅迫條件下野生株WT和ΔgabT菌株的形態(tài)變化，從而驗證GABA代謝旁路在阪崎克羅諾桿菌耐干燥脅迫響應中的重要作用。為阪崎克羅諾桿菌中基于GABA旁路的靶向調控奠定了基礎，從而為阪崎克羅諾桿菌防控提供新思路。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 原料與試劑

惠氏嬰幼兒配方奶粉，上?；菔?；無水乙醇（分析純）、2.5%戊二醛固定液（電鏡專用）均購于上海艾妍生物科技有限公司；GABA試劑盒（項目編號69-99842）購于Merck Biotech公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及菌種

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；ΔgabT突變株在實驗中獲得；菌種均在37 ℃，180 r/min搖床TSB中培養(yǎng)活化24 h，調整菌懸液濃度為6 lg CFU/mL后備用。

1.1.3 主要儀器設備

XW-80A微型漩渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠有限公司；UV-7500紫外可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；LRH-250A-2恒溫培養(yǎng)箱，韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；LEO1530VP掃描電子顯微鏡，德國Zeiss公司；HZQ-F100恒溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)儀器有限公司；5424小型離心機，德國Eppendorf公司；YXQ-LS-100Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器，鄭州南北儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因敲除突變體的構建

利用Luo等[18]的方法構建了阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544的gabT敲除突變體，敲除位點如圖1所示。使用表1中的引物。將gabT基因上下游DNA片段進行PCR融合，克隆到自殺載體質粒pLP12cm中。將重組自殺載體從β2163轉移到阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544進行同源重組。用0.4% L-阿拉伯糖篩選gabT基因突變體。用相同的引物對進行測序，通過PCR確認缺失突變體。在含有20 μg/mL氯霉素（Chloramphenicol，Cm）和0.3% D-葡萄糖的LB平板上，選擇整合質粒到特定染色體位點的阪崎克羅諾桿菌單交叉細胞。在添加0.4% L-阿拉伯糖的反選擇LB平板上選擇雙交叉重組突變體。缺失突變體檢測采用兩種外部引物分別錨定gabT基因的上下游區(qū)域。

圖1 敲除基因位置示意圖Fig.1 Schematic diagram of knockout gene location

表1 基因敲除的引物設計Table 1 Primer design

1.2.2 干燥脅迫下WT和ΔgabT突變菌株存活率測定

將106CFU/mL的WT和ΔgabT突變株菌懸液重懸于復配嬰幼兒乳粉中，惠氏嬰幼兒配方奶粉（上海惠氏）已按照GB 4789.40-2016所述檢測，證明無阪崎克羅諾桿菌污染。在無菌培養(yǎng)皿中制備0.5 mL點重懸的細菌培養(yǎng)物。將無蓋培養(yǎng)皿置于含脫水硅膠的40 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，干燥后蓋上蓋，在干燥皿中25 ℃保存。每隔一周用平板計數(shù)法測定存活細胞數(shù)量。本研究以 37 ℃ TSB培養(yǎng)12 h的阪崎克羅諾桿菌為對照樣品。

式中：

A——存活率，%；

n1——實驗組菌落數(shù)；

n0——對照組菌落數(shù)。

1.2.3 干燥脅迫下WT和ΔgabT菌株GABA含量的測定

GABA含量按照GABA試劑盒操作說明進行。試劑盒購于Merck Biotech公司（項目編號69-99842）。本試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附法測定標本中GABA含量。GABA抗體、GABA與辣根過氧化物酶（HRP） 標記的GABA抗體形成抗體-抗原-酶標記的抗體復合物，經(jīng)徹底洗滌后與底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）著色。TMB經(jīng)辣根過氧化物酶（HRP）催化，在酸的作用下轉化為藍色和最終的黃色。顏色的深度與GABA呈正相關。用酶標儀檢測培養(yǎng)物的OD450根據(jù)標準曲線計算樣品中GABA的濃度。

1.2.4 干燥脅迫對WT和ΔgabT菌株細胞形態(tài)的影響

參照Paula等[19]的方法，使用掃描電子顯微鏡觀察干燥脅迫對WT和ΔgabT突變菌株細胞膜形態(tài)的影響。使用生理鹽水溶出方法1.2.2中干燥后的蓋玻片上的細胞，加入2.5%的戊二醛溶液中固定過夜（4 ℃）。后用不同濃度梯度（10%、30%、50%、70%、90%、100%）的乙醇溶液依次洗脫菌體，每次10 min。真空干燥后，將蓋玻片粘貼在掃描電鏡專用載物臺上，待樣品脫水鍍金后，在Zeiss掃描電子顯微鏡下觀察細胞微觀形態(tài)結構。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用和Origin 2021軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析并繪圖，使用SPSS 22.0軟件進行差異顯著性分析，P＜0.05為顯著差異。

2 結果與討論

2.1 干燥脅迫對WT菌株和ΔgabT菌株存活率的影響

實驗前已證明，ΔgabT菌株在適宜環(huán)境中能正常生長。通過平板計數(shù)法測定WT和ΔgabT菌株干燥后的存活率，如圖2所示，WT與ΔgabT菌株在干燥條件處理一周后的存活率均顯著下降。干燥一周后野生株存活率為1.57%，ΔgabT菌株存活率為28.64% （P＜0.05），可以看出，在干燥條件脅迫后，ΔgabT菌株存活率更高。隨著干燥時間的增加，在干燥第二周后，WT菌株存活率下降至0.18%，ΔgabT菌株存活率下降至20.66%（P＜0.05），由此可見，隨著干燥時間的增加，ΔgabT菌株存活率情況更顯優(yōu)勢，且證明在干燥環(huán)境中，阪崎克羅諾桿菌具有一定的存活能力并且能夠長期存活，這與易萌等[20]研究結果一致。在此之后，菌株的存活情況維持在較穩(wěn)定的狀態(tài)，干燥五周后WT和ΔgabT菌株存活率分別為0.15%和19.34%（P＜0.05）。說明gabT基因的缺失使得阪崎克羅諾桿菌在干燥脅迫條件下更易存活，且存活率相比野生型菌株大幅提升，表明gabT基因的缺失可能在一定程度上有助于細胞抵御干燥環(huán)境。

圖2 干燥處理后細菌存活率的變化Fig.2 Changes of bacterial survival rate after drying treatment

2.2 干燥脅迫對WT和ΔgabT菌株中GABA含量的影響

ΔgabT菌株和WT菌株中GABA含量結果如圖3所示，干燥兩周后，ΔgabT菌株GABA含量由 6.54 μmol/L增加到8.54 μmol/L（P＜0.05），WT菌株GABA含量由4.41 μmol/L增加到5.56 μmol/L （P＜0.05），在應對干燥條件脅迫時，ΔgabT菌株和WT菌株中GABA含量都有所增加。干燥被認為是一種高滲透的脅迫狀態(tài)，對于阪崎克羅諾桿菌在干燥環(huán)境中的調控機制由兩級相應完成，第一級主要的反應是積累電解質，如鉀，谷氨酸等，由轉運蛋白進入細胞內，通過提高細胞內離子濃度使?jié)B透壓升高來抵消升高的外部滲透壓[21]。但長時間的維持較高的離子濃度可能會對細胞造成高濃度離子毒害作用，因此第二級反應是基于吸收或合成其他種類具對細胞損傷較小且能長時間存在于細胞內的相容性物質，隨著相容性物質的累積，導致細胞內滲透壓升高，以此來抵御外界環(huán)境對細胞的損傷[22]。GABA是一種四碳非蛋白氨基酸，在正常生理pH條件下為兩性離子，易溶于水。它的生化特性類似于小的滲透分子，如脯氨酸和甜菜堿。因此，GABA可以作為一種小分子滲透調節(jié)物質，增加細胞質中的滲透水勢，提高細胞的保水性能，減緩干燥對細胞的損害。Shabarinath等[23]的相關研究表明，干燥環(huán)境下海藻糖在阪崎克羅諾桿菌中積累。且強調了其他次生滲透物質如脯氨酸、膽堿等物質在干燥生存中的潛在輔助作用。在干燥環(huán)境下，ΔgabT菌株和WT菌株都可能通過累積GABA來抵御干燥脅迫。

圖3 干燥處理后細菌GABA含量的變化Fig.3 Changes of GABA content of bacteria after drying

干燥五周后，ΔgabT菌株GABA含量達到 9.12 μmol/L，WT菌株在干燥2~5周期間GABA含量保持相對穩(wěn)定，在干燥5周后GABA含量為5.13 μmol/L（P＜0.05），由此可見，在干燥脅迫下ΔgabT菌株GABA含量顯著高于WT菌株，ΔgabT菌株由于gabT基因的缺失，其對應的GABA轉氨酶功能缺失使得其具有更強的GABA累積能力。Du等[22]的研究也表明阪崎克羅諾桿菌的干燥阻力的調節(jié)機制與鉀積累和流出以及相容溶質的吸收和合成有關，與相容性物質合成與轉運相關的betAB、proVW等基因在耐干燥性強的菌株中的水平高于弱干燥耐受性菌株中的基因水平，這些基因的較高水平可能使菌株對干燥環(huán)境更具抵抗力。在本研究中，ΔgabT菌株在干燥脅迫下積累了更高的GABA（圖3），這一結果與推測是吻合的。在ΔgabT中，由于gabT基因的缺失，GABA代謝受阻，導致GABA積累。GABA的積累有助于細胞抵抗干燥脅迫，ΔgabT菌株較于WT菌株更高水平的GABA累積導致ΔgabT的存活率高于WT。

2.3 干燥脅迫對WT和ΔgabT菌株細胞形態(tài)的影響

通過掃描電子顯微鏡觀察了干燥一周后野生型菌株和ΔgabT突變株菌體形態(tài)的變化，結果如圖4。從圖4中可以看出，未經(jīng)處理的WT菌體無褶皺，菌體表面光滑（圖4a），菌體形態(tài)輪廓正常；未經(jīng)處理的ΔgabT菌體呈現(xiàn)出輕微皺縮情況（圖4c），經(jīng)干燥條件處理后，野生型菌株與ΔgabT突變株菌體均出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象（圖4b和4d），表面輪廓不完整現(xiàn)象。相比與ΔgabT菌株而言，WT菌體部分出現(xiàn)皺縮、粘連、破裂現(xiàn)象，菌體變形更加嚴重（圖4b）。上述結果表明，干燥環(huán)境對于阪崎克羅諾桿菌WT菌株和ΔgabT菌株細胞形態(tài)會造成一定的破壞和損傷，但菌體依然具有存活能力，依舊具有一定的危害性。

圖4 干燥處理后細菌細胞形態(tài)的變化Fig.4 Changes of bacterial cell microstructure after drying

由細胞形態(tài)變化可以發(fā)現(xiàn)，干燥對于ΔgabT突變株菌體形態(tài)影響更小，由此推測出gabT基因的缺失使得細胞內GABA代謝受阻進一步累積，維持細胞內滲透壓在一定程度上保護細胞膜的完整性。微生物細胞膜的完整性是保證其維持自身新陳代謝等正常生理活動的重要因素[24]。胡心怡等[25]研究發(fā)現(xiàn)百里香酚與肉桂醛通過破壞沙門氏菌細胞膜的完整，從而抑制了沙門氏菌的增殖。失水干燥引起細菌的細胞質的滲透性失衡，膨脹壓力的損失導致水在細胞膜上的位移，并導致細胞收縮[26]。ΔgabT菌株中GABA的大量累積，在一定程度上保護了細胞失水收縮，相對于WT菌株而言使菌體的細胞膜不易造成破壞和損傷，菌體形態(tài)不易發(fā)生改變。細胞膜是細菌與環(huán)境間的半透膜屏障，當其結構和完整性被破壞，將會導致細胞失去正常的生理代謝活動，進而使菌體失活和死亡[27,28]，該過程往往伴隨著細胞膜的通透性的變化以及胞內成分的流失[29]。因此，在干燥條件下GABA的累積在有助于維持阪崎克羅諾桿菌的胞內滲透壓，維持菌體形態(tài)的基礎上一定程度保證細胞正常生理代謝活動，進而防止其因細胞膜通透性變化導致的內容物泄露以及細胞收縮導致菌體的死亡。

3 結論

本文通過基因敲除手段，構建ΔgabT菌株，同時對WT菌株和ΔgabT菌株耐干燥能力及GABA含量測定。干燥條件下ΔgabT菌株存活率明顯高于WT菌株，且ΔgabT菌株干燥中GABA含量也遠高于WT菌株，說明GABA的積累與gabT基因缺失有關，且GABA累積在耐干燥脅迫中具有關鍵作用，在干燥條件下通過調控GABA的代謝，保護阪崎克羅諾桿菌抵抗干燥脅迫，結合掃描電子顯微鏡檢測進一步證實了GABA累積有助于阪崎克羅諾桿菌抵御干燥脅迫。故經(jīng)基因敲除手段獲得的ΔgabT菌株由于GABA代謝受阻，GABA累積使得干燥后阪崎克羅諾桿菌更耐干燥?？偨Y得出gabT基因在干燥脅迫下的功能特性以及GABA含量與菌體耐干燥脅迫關系，在已有傳統(tǒng)物理化學致病菌防控手段基礎上為探究阪崎克羅諾桿菌逆境脅迫機制提供新的思路，為預防和控制食品（特別是嬰幼兒配方奶粉）中阪崎克羅諾桿菌污染奠定基礎。