侯建波，洪燈，張明哲，張曉峰，謝文，祝澤龍，史穎珠，張文華

（1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江杭州 310016）（2.杭州海關(guān)技術(shù)中心，浙江杭州 310016）

車?yán)遄右蚋缓S生素和鐵等營養(yǎng)元素，果肉鮮美而多汁，近些年被廣大消費(fèi)者所喜愛。最初的車?yán)遄邮侵府a(chǎn)于美國、智利等國的個(gè)大、皮厚的櫻桃，近些年，我國山東、遼寧等地已有車?yán)遄庸麡涞囊N和車?yán)遄庸麑?shí)的銷售，國產(chǎn)車?yán)遄拥钠肺丁①|(zhì)量與國外相當(dāng)。但在銷售環(huán)節(jié)，進(jìn)口車?yán)遄雍蛧a(chǎn)車?yán)遄?，因產(chǎn)地不同，品行相近卻價(jià)格相差較遠(yuǎn)，因此車?yán)遄赢a(chǎn)地屬性的判定對規(guī)范市場具有十分重要的意義。

對于食品的產(chǎn)地和可追溯性，歐盟法律法規(guī)和我國的食品安全法均有相關(guān)規(guī)定，要求建立食品安全的溯源制度和體系[1-4]。研究表明植物生長的大氣、土壤、水源等環(huán)境信息與植物的根、莖、葉及其果實(shí)所含的元素和穩(wěn)定同位素比值等參數(shù)密切相關(guān)[1]，食品中元素含量和穩(wěn)定同位素比值檢測與分析成為其產(chǎn)地溯源鑒別十分重要的技術(shù)。目前兩項(xiàng)技術(shù)組合的研究已成功應(yīng)用于肉制品[5-7]、葡萄酒[8-10]、糧谷[11-13]、茶葉[14,15]、中藥材[16-18]、牛奶[19-23]等產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源研究中。已有人員通過測定車?yán)遄庸性睾縖24]、單分子蛋白或脂肪的穩(wěn)定同位素比值[25]，揮發(fā)性物質(zhì)[26]、拉曼光譜技術(shù)[27]、非靶向檢測[28]等方法開展車?yán)遄赢a(chǎn)地分析與歸屬工作。

本文建立了通過電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測定車?yán)遄庸藲ぶ械匿嚕↙i）、鈉（Na）、鎂（Mg）、鋁（Al）、鉀（K）、鈣（Ca）、鈧（Sc）、鈦（Ti）、釩（V）、鉻（Cr）、錳（Mn）、鐵（Fe）、鈷（Co）、鎳（Ni）、銅（Cu）、鋅（Zn）、鎵（Ga）、砷（As）、硒（Se）、銣（Rb）、鍶（Sr）、鉬（Mo）、釕（Ru）、鎘（Cd）、銦（In）、錫（Sn）、銻（Sb）、銫（Cs）、鋇（Ba）、鑭（La）、鐠（Pr）、釹（Nd）、釤（Sm）、錸（Re）、鉈（Tl）、鉛（Pb）、鉍（Bi）總計(jì)37種元素含量，通過元素分析-穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀（EA-IRMS）測定車?yán)遄庸藲ぶ袣洹⒀?、碳、氮穩(wěn)定同位素比值（δ2H、δ18O、δ13C和δ15N）的方法。并對澳大利亞、美國、新西蘭、智利和中國所產(chǎn)車?yán)遄訕悠返臋z測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，研究其在車?yán)遄赢a(chǎn)地歸屬方面的可行性，提出產(chǎn)地判別函數(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器設(shè)備

7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；CEM MARS 6型微波消解儀，美國CEM公司；Isoprime 100型穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀（氫和氧同位素測定）配Vario PYRO Cube型元素分析儀，德國元素-艾力蒙塔公司；Delta V Advantage型穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀（碳和氮同位素測定）配Flash 2000型元素分析儀，賽默飛世爾科技公司；CPA225D型分析天平（精確至0.01 mg），Sartorius公司。

1.1.2 主要耗材和試劑

錫杯（9 mm×5 mm，碳和氮同位素測定），賽默飛世爾科技公司；銀杯（8 mm×5 mm，氫和氧同位素測定），德國元素-艾力蒙塔公司；氣體（純度≥99.999%）：氮?dú)?、氦氣和二氧化碳，比歐西氣體（蘇州）有限公司；氫氣和一氧化碳，上?；瘜W(xué)工業(yè)區(qū)浦江特種氣體有限公司；氧氣，杭州德清成功氣體有限公司。校準(zhǔn)物質(zhì)：加拿大紅松木粉（USGS54）：δ2H=-150.4.0‰± 1.1‰（VSMOW），δ18O=17.79‰±0.15‰（VSMOW）；南非紅象牙木粉（USGS56）：δ2H=-44.0‰±1.8‰（VSMOW），δ18O=+27.23‰±0.03‰（VSMOW）（美國地質(zhì)勘探局）；咖啡因（IAEA-600）：δ13C=-27.771‰ ±0.043‰（VPDB）（國際原子能機(jī)構(gòu)）；甘氨酸（USGS65）：δ13C=-20.29‰±0.04‰（VPDB-LSVEC），δ15N=20.68‰±0.06‰（Air N2）；L-谷氨酸（USGS40）：δ15N=-4.52‰±0.06‰（Air N2）。元素標(biāo)準(zhǔn)品（國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；硝酸（≥65%，優(yōu)級純）（德國Merck公司）。車?yán)遄訕悠罚喊拇罄麃?個(gè)，美國5個(gè)，新西蘭7個(gè)，智利10個(gè)和中國9個(gè)。

1.1.3 儀器工作條件

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀參數(shù)：射頻功率 （1 600 W），采樣深度（10.0 mm）；載氣流量（氬氣，0.7 L/min），輔助氣流量（氬氣，0.35 L/min），霧化室溫度（2 ℃）；數(shù)據(jù)采集模式：質(zhì)譜圖；透鏡電壓：提取透鏡1（0 V），提取透鏡2（-195 V）；Omega偏轉(zhuǎn)電壓（-80 V），Omega透鏡電壓（8.6 V）；碰撞池：入口電壓（-40 V），出口電壓（-60 V），碰撞池氣體流量（氦氣，5.0 mL/min）；八極桿偏轉(zhuǎn)電壓（-18.0 V），樣品引入時(shí)間（30 s），蠕動(dòng)泵速度（0.30 r/s），穩(wěn)定時(shí)間（35 s）。

元素分析儀參數(shù)（氫、氮穩(wěn)定同位素比的測定）：氫氣壓力（1.72 Bar），一氧化碳壓力（0.90 Bar），氦氣壓力（0.14 Bar）；加速電壓：氫氣（4 184.67 V），一氧化碳（4 492.39 V）。

元素分析儀參數(shù)（碳、氮穩(wěn)定同位素比的測定）：載氣（氦氣，200 mL/min），參考?xì)猓ǘ趸迹?90 mL/min），氧化氣（氧氣，180 mL/min），氧化爐溫度（960 ℃），還原爐溫度（640 ℃），水阱溫度（50 ℃）。

離子化方式：離子源（EI源），儀器連續(xù)測定精度：δ18O、δ13C和δ15N（＜0.06‰，n=10），δ2H（＜0.4‰，n=10）。各樣品測定結(jié)果取平行測試的平均值，每測試5個(gè)樣品插入一次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測。

穩(wěn)定同位素比計(jì)算公式：

其中R為重同位素與輕同位素豐度比（2H/1H，18O/16O，13C/12C和15N/14N），相對標(biāo)準(zhǔn)：δ2H和δ18O為VSMOW，δ13C為V-PDB和VPDB-LSVEC，δ15N為空氣中的氮?dú)狻?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 元素含量的測定

車?yán)遄訕悠啡コ夂凸屎?，將果核殼放?5 ℃烘箱中12 h，烘干后研磨成均勻粉末，稱取0.25 g轉(zhuǎn)移至微波消解罐，加入8 mL硝酸，微波消解后，趕硝酸至剩余2 mL，加水定容至25 mL，混勻，ICP-MS測定[29]。

1.2.2 氫、氧穩(wěn)定同位素比值的測定

取研磨均勻的車?yán)遄庸藲し勰?.5 mg至銀杯中，密封，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同時(shí)放入待測儀器室平衡48 h以上，通過元素分析-穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀，測定氫、氧穩(wěn)定同位素比值。

1.2.3 碳、氮穩(wěn)定同位素比值的測定

取研磨均勻的車?yán)遄庸藲し勰?.3 mg（氮穩(wěn)定同位素比值測定0.8 mg）至錫杯中，密封，通過元素分析-穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀，測定碳、氮穩(wěn)定同位素比值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（單因素方差分析，Duncan多重比較分析，主成分分析，聚類分析和判別函數(shù)分析）。

2 結(jié)果與討論

2.1 車?yán)遄庸藲ぶ性睾亢头€(wěn)定同位素比值差異分析

研究表明，植物生長環(huán)境的元素信息與植物所攜帶的元素含量密切相關(guān)，穩(wěn)定同位素比值中δ2H和δ18O與生長水環(huán)境密切相關(guān)，δ13C反映植物的光合作用類型（C3或C4植物等），δ15N與植物氮的代謝路徑有關(guān)[1,30]。

試驗(yàn)分別對車?yán)遄庸?、果汁、果仁和果核殼進(jìn)行測試分析，研究發(fā)現(xiàn)車?yán)遄庸庥捎诤写罅康奶欠譄o法徹底干燥，準(zhǔn)確稱量樣品困難且易造成檢測結(jié)果偏差，果汁中容易摻雜果肉，造成δ2H和δ18O檢測平行性較差，無法獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，果仁在烘干后獲得的樣本量較少，果核殼具有樣本量大、粉末均勻、樣品穩(wěn)定等特點(diǎn)，因此最終采用車?yán)遄庸藲ら_展元素含量與穩(wěn)定同位素比值的測定，并對車?yán)遄赢a(chǎn)地進(jìn)行對比分析。

試驗(yàn)對澳大利亞、美國、新西蘭、智利和中國的38個(gè)車?yán)遄訕悠愤M(jìn)行了37種元素（Li、Na、Mg、Al、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Mo、Ru、Cd、In、Sn、Sb、Cs、Ba、La、Pr、Nd、Sm、Re、Tl、Pb和Bi）和4種穩(wěn)定同位素比值（δ2H、δ18O、δ13C和δ15N）的檢測。測定結(jié)果顯示，有24種元素（Na、Mg、Al、K、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo、Cd、Sn、Sb、Ba和Pb）和3種穩(wěn)定同位素比值（δ2H、δ18O和δ13C）在車?yán)遄庸藲ぶ锌梢员粰z測。對上述結(jié)果進(jìn)行方差分析和多重比較分析，結(jié)果如表1所示，澳大利亞、美國、新西蘭、智利和中國的車?yán)遄訕悠分?，智利車?yán)遄拥腒和Rb含量、中國車?yán)遄拥腗n含量明顯高于其他產(chǎn)地，可能與不同地域的種植土壤成分有關(guān)；車?yán)遄庸藲ぶ械暮康?，超出儀器檢測線性范圍，雖然增大取樣量，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下仍無法獲得穩(wěn)定準(zhǔn)確的δ15N值，不同地域車?yán)遄拥墓夂献饔妙愋蜔o差別，因此δ13C值也沒有明顯的差異。最終元素中有9種（K、Ca、Mn、Co、Ni、Cu、Rb、Sr和Ba）和穩(wěn)定同位素比值中δ2H和δ18O存在顯著性差異（P＜0.05）。

表1 不同國家車?yán)遄庸藲ぶ性睾头€(wěn)定同位素比值測定結(jié)果Table 1 The results of multi-elemental concentrations and δ13C, δ2H, δ18O in the stone of cherries from different country

2.2 車?yán)遄庸藲ぶ性睾亢头€(wěn)定同位素比值的主成分分析

主成分分析可以將樣本中多個(gè)參數(shù)信息進(jìn)行綜合，試驗(yàn)對不同國家之間車?yán)遄庸藲ぶ写嬖陲@著差異的11個(gè)參數(shù)（K、Ca、Mn、Co、Ni、Cu、Rb、Sr、Ba、δ2H和δ18O）進(jìn)行主成分分析（R型：數(shù)據(jù)進(jìn)行中心化和標(biāo)準(zhǔn)化處理）。其中第1主成分到第4主成分分別主要綜合了K、Co、Rb和δ2H（PC1），Ni、Cu和δ18O（PC2），Mn和Ba（PC3），Ca和Sr（PC4）的信息，前4個(gè)主成分的方差累積貢獻(xiàn)率78.22%。利用第1、第2和第3主成分（PC1、PC2和PC3）的標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算得分進(jìn)行做圖，如圖1所示，可以對澳大利亞，美國，新西蘭，智利和中國的車?yán)遄舆M(jìn)行一定的區(qū)分，其中澳大利亞和智利的車?yán)遄託w屬存在一定交叉現(xiàn)象。

圖1 PC1、PC2和PC3的得分散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter plot of PC1, PC2 and PC3

2.3 車?yán)遄庸藲ぶ性睾亢头€(wěn)定同位素比值的聚類分析

試驗(yàn)對元素含量和穩(wěn)定同位素比值組合參數(shù)所得4個(gè)主成分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，對其得分進(jìn)行聚類分析（分析方法：系統(tǒng)聚類，歐氏聚類距離，Ward聚類法），結(jié)果如圖2所示，在聚類距離4.50處將樹型圖切割，所檢測的車?yán)遄訕悠繁环譃?類，第1類為中國車?yán)遄訕悠?，?類為美國車?yán)遄訕悠?，?類為智利車?yán)遄訕悠罚ò?個(gè)澳大利亞樣品），第4類為澳大利亞車?yán)遄訕悠罚ò?個(gè)新西蘭樣品），第5類為新西蘭車?yán)遄訕悠罚ò?個(gè)智利樣品）。因此通過元素含量和穩(wěn)定同位素比值組合的主成分可以對不同產(chǎn)地的車?yán)遄舆M(jìn)行一定的分類。

圖2 不同產(chǎn)地車?yán)遄拥南到y(tǒng)聚類樹圖Fig.2 The Dendrogram of cluster analysis from different country

2.4 車?yán)遄赢a(chǎn)地的判別分析

試驗(yàn)對不同產(chǎn)地的車?yán)遄庸藲ぶ蠯、Ca、Mn、Co、Ni、Cu、Rb、Sr、Ba、δ2H和δ18O測定結(jié)果的多重差異分析、主成分分析和聚類分析結(jié)果表明，元素含量和穩(wěn)定同位素比值組合參數(shù)可以對車?yán)遄赢a(chǎn)地進(jìn)行判別。為了進(jìn)一步了解各指標(biāo)對車?yán)遄赢a(chǎn)地的判別情況，對9種元素含量和2種穩(wěn)定同位素比值的測定指標(biāo)進(jìn)行逐步判別分析（分析方法：逐步判別法，F(xiàn)isher線性判別），篩選車?yán)遄赢a(chǎn)地判別的有效變量并建立判別模型。在0.05顯著水平下，篩選出Mn、Co、Rb、Sr、Ba和δ2H總計(jì)6個(gè)指標(biāo)參數(shù)引入模型，所建立的判別函數(shù)：

對判別結(jié)果進(jìn)行交叉檢驗(yàn)，交叉檢驗(yàn)判別正確率92.1%，其中澳大利亞和新西蘭、智利各有一個(gè)樣品出現(xiàn)誤判。對自澳大利亞、美國、新西蘭、智利和中國的車?yán)遄用舆M(jìn)行歸屬時(shí)，可將樣品的測定結(jié)果分別代入上述判別函數(shù)，Y值最大的地域?yàn)樵摌悠穼?yīng)的產(chǎn)地。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS），元素分析-穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀（EA-IRMS）測定車?yán)遄庸藲ぶ?7種元素含量和氫、氧、碳、氮穩(wěn)定同位素比值的方法。通過對澳大利亞、美國、新西蘭、智利和中國五個(gè)區(qū)域38個(gè)車?yán)遄庸藲みM(jìn)行相應(yīng)元素含量和穩(wěn)定同位素比值的測定，并對結(jié)果進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析（方差分析、主成分分析、聚類分析和判別分析），研究結(jié)果表明Mn、Co、Rb、Sr、Ba和δ2H的綜合指標(biāo)對試驗(yàn)車?yán)遄赢a(chǎn)地的交叉檢驗(yàn)整體判別正確率為92.1%，所得的判別函數(shù)方法可作為車?yán)遄赢a(chǎn)地判別分析的有效方法。