陶承靜，劉壽榮，荀運浩，胡健女，張素英，白秀麗，趙春，左中寶

浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州市西溪醫(yī)院，浙江 杭州310023

乙型肝炎病毒（HBV）感染目前依然是一個嚴重的全球公共衛(wèi)生問題。2016 年世界衛(wèi)生大會提出到2030 年消除病毒性肝炎的戰(zhàn)略目標[1]，2021 年世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布報告概述了目前消除HBV 取得的進展：2019 年全球約有2.96 億慢性乙型肝炎（CHB）感染者，其中6 500 萬為育齡婦女[2]，形勢依然嚴峻。

1 HBV 的宮內(nèi)感染

HBV 傳播有經(jīng)血液和性接觸等水平傳播，及經(jīng)胎盤、臍帶、羊水、精子等母嬰、父嬰垂直傳播。母嬰傳播是HBV 感染的主要傳播途徑[3]，包括經(jīng)胎盤宮內(nèi)傳播、分娩時產(chǎn)道傳播和產(chǎn)后哺乳傳播3 種途徑?？赡芨呶Ｒ蛩匕℉BV DNA 高載量、HBV 結(jié)構(gòu)和突變、孕婦的乙型肝炎病毒e 抗原（HBeAg）陽性、母體宮內(nèi)環(huán)境、胎盤屏障和胎兒遺傳易感性。目前國內(nèi)外指南均要求乙肝表面抗原（HBsAg）陽性且HBV DNA≥105copies/mL 的孕婦在妊娠中晚期口服抗病毒藥物，新生兒出生后接受主動（乙型肝炎疫苗）-被動免疫（乙型肝炎免疫球蛋白），兩者聯(lián)合有效降低了HBV 的垂直傳播率[4]，但仍然存在1.2%～5%的失敗率[5]，有研究認為這可能與無法明確HBV 如何突破胎盤屏障感染胎兒的機制相關(guān)。目前存在幾種學說：滲漏學說[6]、細胞轉(zhuǎn)移學說[7]、外周血單個核細胞（PBMC）學說[8]、HBV 病毒顆粒的胞吐作用學說[9]。

2 系統(tǒng)生物學與證候系統(tǒng)生物學

系統(tǒng)生物學是一門研究基因、蛋白質(zhì)和代謝物等的構(gòu)成及其在遺傳、環(huán)境等因素變化過程中相互關(guān)系的學科[10]。從整體的高度，采用系統(tǒng)論的方法，從基因、蛋白質(zhì)、細胞、組織、個體的分層角度研究其功能以及各組學間的相互關(guān)系，整合建立模擬生物系統(tǒng)的模型，預(yù)測其在各種環(huán)境因素干擾下的動態(tài)行為，分為基因、蛋白質(zhì)等各種組學。

證候系統(tǒng)生物學是一種新興交叉學科[11]。從中醫(yī)學整體觀、治未病、辨證施治等基礎(chǔ)理論出發(fā)，綜合系統(tǒng)生物學的理論與技術(shù)，從基因、蛋白質(zhì)、代謝物等不同層面對證候進行定量化、標準化、客觀化[12]。CHB 證候系統(tǒng)生物學研究平臺[13]，是利用系統(tǒng)生物學理論與技術(shù)探索不同證型的特異性指標，將中醫(yī)病證規(guī)范化、診斷指標定量化和療效評定客觀化。目前中醫(yī)臨床將CHB 患者的主要中醫(yī)證型候分為5 型：濕熱內(nèi)結(jié)證、肝郁脾虛證、肝腎陰虛證、瘀血阻絡(luò)證、脾腎陽虛證[14]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同中醫(yī)證候分類存在不同的HBV 基因型，與外周血淋巴細胞亞群（PBMC）之間也存在一定的相關(guān)性[15]，其臨床療效及預(yù)后也不同。

系統(tǒng)生物學、CHB 與中醫(yī)證候的結(jié)合、發(fā)展與應(yīng)用，為HBV 宮內(nèi)感染機制的研究提供了手段和思路。筆者基于CHB 證候系統(tǒng)生物學方法，從基因、蛋白、代謝等角度，從不同組學層面探討不同證候分類的宮內(nèi)傳播機制：不同證候間母體個體基因和蛋白表達譜的區(qū)別，與孕期HBV 感染者的主要中醫(yī)證型候的相關(guān)性，母嬰傳播阻斷失敗與HBV 基因突變、基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)，預(yù)測中醫(yī)辨證與關(guān)鍵蛋白質(zhì)和代謝網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)性，以期從CHB 中醫(yī)證候聯(lián)合生物系統(tǒng)學尋找解決當前困局的思路。

3 系統(tǒng)生物學與HBV 宮內(nèi)感染

3.1 基因組學與HBV 宮內(nèi)感染基因組學（Genomics）是從基因表征、定量、結(jié)構(gòu)、相互關(guān)系中研究基因內(nèi)在活動的規(guī)律，及其對機體影響包括測量基因表達、鑒定基因功能、研究生物信息，分析遺傳密碼[16]。

基因表達差異性及序列多態(tài)性，在臨床中表現(xiàn)為不同的個體差異、癥狀和體征，在中醫(yī)證候中表現(xiàn)為不同的證候表型[12]。HBV 感染后的自然病程及臨床轉(zhuǎn)歸也受到病毒的基因型、病毒基因變異、病毒與宿主基因整合等影響[17]。

2005 年HBV 全基因組首次克隆成功，這個全新技術(shù)為HBV 基因多樣性與不同致病性和不同傳播途徑等關(guān)系的研究打開了窗口[18]。大量證據(jù)表明HBV基因型與HBV 的流行、傳播模式和臨床結(jié)果相關(guān)，可以作為確定地理分布與傳播模式相關(guān)性的流行病學標志物，HBV 的基因型B 型和C 型在亞洲人群最容易出現(xiàn)，與宮內(nèi)感染也具有較高的相關(guān)性[19]，感染后也更傾向發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化。但國內(nèi)韓國榮團隊認為雖然HBV 的基因型與母嬰傳播有相關(guān)性，但是不能作為是否會發(fā)生免疫失敗導致宮內(nèi)感染的一項預(yù)測指標[20]。近年也有研究認為基因B 型孕婦使用抗病毒藥物時，HBV DNA 下降更明顯，母嬰阻斷效果更好[21]。

HBV 具有高度優(yōu)化的遺傳組織，同時導致其靈活性也高，在逆轉(zhuǎn)錄步驟過程中由于缺乏基因突變自發(fā)錯誤校對，容易出現(xiàn)各種各樣的基因型、亞型、突變、重組[19]。這樣的變異也使得HBV 容易擺脫機體免疫監(jiān)管而出現(xiàn)較高免疫逃逸、耐藥性、復制率[22]，從而導致宮內(nèi)感染的易感性。另一項研究結(jié)果表明HBV 基因變異的不同位點和量與中醫(yī)證候具有相關(guān)性，基因B 型主要是濕熱中阻證與肝郁脾虛證患者，基因C 型主要表現(xiàn)為脾腎陽虛證、肝腎陰虛證及瘀血阻絡(luò)證患者，而肝郁脾虛證與HBV 基因型及基因變異的位點有一定的相關(guān)性，更易發(fā)生Per C 區(qū)變異。另一項臨床檢測認為，有報道稱，HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生和輔助性T 細胞1（Th1）/輔助T 細胞2（Th2）類細胞有關(guān)細胞因子之間免疫失衡有關(guān)[23]，特別是中醫(yī)證型為脾腎陽虛型的患者，容易出現(xiàn)IL-17/IL-10 失衡[24]，臨床應(yīng)用流式細胞儀檢測調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）/Th17 的表達，以及其相關(guān)細胞因子白細胞介素-10（IL-10）、IL-17 的水平，發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)感染的孕婦及新生兒這些表達均增強，且肝郁脾虛型最高，結(jié)合不同中醫(yī)分型孕婦的Treg/Th17 細胞因子能夠制定預(yù)防措施來避免HBV 宮內(nèi)感染的發(fā)生[24]。2019 年國內(nèi)IL-18 調(diào)控Th1/Th2 網(wǎng)絡(luò)平衡，監(jiān)測HBsAg 陽性孕婦體內(nèi)IL-18 水平，可以對是否發(fā)生宮內(nèi)感染進行預(yù)判，還可以提前干預(yù)來提高母體的細胞免疫功能，有利于控制宮內(nèi)傳播[25]。這說明鑒定HBV基因型的和監(jiān)測HBV 基因組某些區(qū)域的變異，作為對HBV 感染患者評估是否發(fā)生宮內(nèi)感染的一項預(yù)判指標，并實施個體化管理，具有一定的臨床意義。2018 年最新的改良巢氏PCR 法完成了對低濃度HBsAg 的CHB 全基因分析和低拷貝HBV DNA 全基因擴增[26]，發(fā)現(xiàn)了HBV 的BCP 區(qū)、PreC 區(qū)和C 基因區(qū)突變與肝臟損傷及肝病進程相關(guān)，不同中醫(yī)證候類型有著不同的HBV DNA 核苷酸突變率，其中濕熱內(nèi)蘊證候型的最高[27]。研究基因多態(tài)性與中醫(yī)證候分型的相關(guān)性，有助于了解不同證候表型的妊娠期CHB 患者發(fā)生宮內(nèi)感染的幾率，以及對抗病毒藥物治療反應(yīng)的個體差異。

3.2 蛋白質(zhì)組學與HBV 宮內(nèi)感染蛋白質(zhì)組學（Proteomics）主要研究蛋白質(zhì)組成成分及其動態(tài)變化特有規(guī)律，通過基因表達調(diào)控的機制來闡述疾病發(fā)病機理，通過比較和分析正常個體與病理個體之間的差異蛋白，尋找到疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的特異性蛋白質(zhì)分子，這為疾病的早期診斷可量化的客觀指標和理論依據(jù)。

由于在疾病的不同階段、不同情況下，蛋白質(zhì)的分型和表達也不相同，隨著空間和時間的不斷動態(tài)變化，CHB 的中醫(yī)證候蛋白質(zhì)組學，就是尋找不同中醫(yī)證候間的差異蛋白質(zhì)，將中醫(yī)證候診斷進行客觀化、標準化，指導臨床應(yīng)用。

母嬰垂直傳播是CHB 患者患病的主要病因，胎盤滋養(yǎng)層是母嬰傳播的天然屏障，然而HBV 如何通過滋養(yǎng)層引起胎兒感染的機制不清楚。陳京龍團隊采用液相PCR 法檢測出HBV 感染孕婦胎盤組織中存在HBV 閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）信號，證實了HBV可感染胎盤各層細胞并進行復制[28]。有研究認為HBV 病毒表面的S 蛋白可以與胎盤Hofbauer 細胞（絨毛間質(zhì)內(nèi)一種巨噬細胞）表面的Fc?RⅢ（CDl6）特異性結(jié)合，介導吞噬及攝入作用，引起胎兒宮內(nèi)感染，阻斷Fc?RⅢ受體表達可能會可降低患者宮內(nèi)感染風險[29]。白曉霞及其團隊[30]研究認為S100 蛋白的高表達可能與HBV 的經(jīng)胎盤宮內(nèi)感染有關(guān)。一部分HBV 劫持了自噬蛋白分泌途徑，經(jīng)由S100A10/AnxA2 復合物和多泡體（MVB）介導的胞吐作用通過滋養(yǎng)層發(fā)生易位，如果敲除滋養(yǎng)層細胞中AnxA2 或S100A10 會導致滋養(yǎng)層HBV 病毒數(shù)量的減少，這為了解并阻斷HBV 宮內(nèi)感染和母嬰傳播提供了另一個潛在的靶點[31]。

3.3 轉(zhuǎn)錄組學與HBV 宮內(nèi)感染轉(zhuǎn)錄組學，在整體水平上研究細胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學科，是根據(jù)一些基因在一定條件下表達出的信息來推斷出未知基因的功能和作用機制的一種學科，也稱表達譜。由于外源性和內(nèi)源性因素影響，轉(zhuǎn)錄組學具有特定的時空性[32]。中醫(yī)證候轉(zhuǎn)錄組學主要以轉(zhuǎn)錄組學方法檢測中醫(yī)證候患者樣本，采取不同方法進行干預(yù)，并對比分析干預(yù)前后結(jié)果。

國內(nèi)學者白桂琴[33]應(yīng)用抑制性消減雜交（SSH）技術(shù)從HBV 感染胎盤組織中篩選出了參與細胞生長調(diào)節(jié)、基本代謝、氧化損傷、畸變等有關(guān)差異表達基因。白曉霞[34]也發(fā)現(xiàn)HBV 可以上調(diào)體內(nèi)體外的胎盤滋養(yǎng)層內(nèi)HBD-3 和A3G 的表達，這種上調(diào)的缺乏可能與HBV 的宮內(nèi)傳遞有關(guān)。2021 年白桂琴團隊進一步研究發(fā)現(xiàn)，HBx 通過下調(diào)Smc5/6 促進滋養(yǎng)層細胞中HBV 復制，激活EGFR 啟動子，通過下調(diào)PI3K/p-AKT 信號通路抑制滋養(yǎng)層細胞凋亡，從而增加HBV 宮內(nèi)感染的風險[35]。2022 年北京佑安醫(yī)院高虹采用逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）和免疫印跡法分別檢測胎盤絨毛膜中自噬小體相關(guān)基因和蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)HBV 感染母體的胎盤中自噬小體水平增加，并隨HBV 載量的增加而顯著上調(diào)。高水平的病毒血癥可能是自噬小體活性和MTCT 的原因[36]。在高病毒載量或HBeAg 陽性的孕婦中，自噬水平顯著上調(diào)在HBV MTCT 中起著重要的作用，在HBV 宮內(nèi)感染中起著重要的作用。

早在2013年，國內(nèi)有學者研究發(fā)現(xiàn)CHB 濕熱蘊結(jié)型患者和肝郁脾虛型患者具有不同基因分子表達模式。肝郁脾虛證患者、脾胃濕熱證兩證候間存在顯著差異表達基因，miR-129-1-3p、miR-129-2-3p與中醫(yī)證候肝膽濕熱證具有一定的相關(guān)性，miR-1273g-3p 與脾胃濕熱證具有一定的相關(guān)性[37]。

因此，采用轉(zhuǎn)錄組學方法對不同中醫(yī)證候的宮內(nèi)感染患者進行研究，為揭示HBV 的宮內(nèi)感染提供新的技術(shù)平臺。

3.4 代謝組學與HBV 宮內(nèi)感染代謝組學，是定性定量分析生物體細胞內(nèi)在某一時刻的低分子量代謝物，并找尋其在生理病理變化中的規(guī)律，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分?；痉椒ㄊ遣捎酶咄繖z測技術(shù)結(jié)合信息模式識別和專家系統(tǒng)整合等方法，反映了細胞所處的環(huán)境。主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GO-MS）技術(shù)和代謝輪廓分析（Metabolomic profiling）等。

隨著代謝組學的快速發(fā)展，其在HBV 感染中的應(yīng)用也日趨廣泛，有研究顯示在正常人和HBV 感染人群中存在檸檬酸、烏頭酸等代謝物的差異，為乙型肝炎的發(fā)病機制以及乙肝治愈提供了新的視角[38]：對于不同中醫(yī)證候的CHB 患者可篩選出特征性的小分子代謝物，來評估病情及指導治療。研究認為CHB 中醫(yī)證型與生化學指標具有一定的相關(guān)性，在一定程度上可反應(yīng)疾病進展程度及闡釋疾病臨床表現(xiàn)的中醫(yī)機理[39]。

HBV 感染導致患者在妊娠期機體病理生理過程變化，引起代謝產(chǎn)物發(fā)生相應(yīng)的改變，目前鮮少有研究，如果通過對某些代謝產(chǎn)物進行分析，并與正常人的代謝產(chǎn)物比較，尋找出宮內(nèi)感染的生物標記物，可以提供一種較好的鑒別方法來判斷宮內(nèi)感染傾向、并進行母嬰傳播阻斷。

4 存在的問題及小結(jié)

疾病產(chǎn)生是一個多變化的持續(xù)過程，從單一層面的數(shù)據(jù)變化來解釋分析疾病的整個發(fā)生發(fā)展過程具有一定的局限性，而系統(tǒng)生物學和中醫(yī)證候?qū)W都是從整體、系統(tǒng)、聯(lián)系方面出發(fā)，采用多學科交叉來闡釋基因-信息通路-證候間的具體聯(lián)系。為了更好地研究HBV 宮內(nèi)感染的生物學機制，可以以轉(zhuǎn)錄組學為基點，利用系統(tǒng)生物學、中醫(yī)證候?qū)W關(guān)聯(lián)多個緯度的組學數(shù)據(jù)，對不同中醫(yī)證候分類的慢性HBV 感染孕婦，在差異基因變化規(guī)律、miRNA 調(diào)控的作用機制、蛋白質(zhì)群、代謝標志物的比較和關(guān)聯(lián)這幾個方面開展深入研究，發(fā)現(xiàn)相關(guān)特征性基因表達和代謝物，選取與自己研究相關(guān)的方面進行整合分析，觀察其在各個層面的不同變化，探究作用機制，從而找到最有效的研究方向。