孔繁林，吳建偉，侯學(xué)伶，路 博，劉振騰，米盼盼，朱 軍，樊國峰△

河北中石油中心醫(yī)院：1.骨科；2.檢驗科，河北廊坊 065000

多發(fā)性骨髓瘤(MM)為惡性漿細胞病，其腫瘤的細胞來自于骨髓中內(nèi)的漿細胞。MM的特點是骨髓漿細胞發(fā)生異常增生并伴隨著輕鏈或單克隆的免疫球蛋白過量的產(chǎn)生。然而，因早期MM患者的癥狀并不典型，而腎病、風(fēng)濕或淋巴瘤等疾病又可造成反應(yīng)性漿細胞的增加，干擾了臨床診斷[1-2]；其次，目前診斷MM主要依靠骨髓細胞學(xué)相關(guān)的檢查，但病灶呈局灶性分布，單部位骨髓穿刺常常不能明確診斷，另外，骨髓穿刺操作的有創(chuàng)性導(dǎo)致部分患者并不太愿意接受檢查而錯過了早期的臨床診斷。因此，臨床上急需找尋一類特異度、靈敏度更高的診斷標志物，以提高MM患者的診療質(zhì)量?；|(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)是將細胞外基質(zhì)水解的一類蛋白水解酶，用于調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移過程。血小板第4因子(PF4)是由血小板α顆粒合成的一種特異性蛋白質(zhì)。近年發(fā)現(xiàn)，PF4通過抑制人血管內(nèi)皮祖細胞的生長和遷移，進而在MM發(fā)病過程中起到抑制血管新生作用，對MM起抑制作用[3]。微小RNA(miRNA)是一類長度約為22核苷酸的非編碼RNA，通過調(diào)控表觀遺傳參與人體的各類生理病理，并關(guān)系到腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移等。近年來研究發(fā)現(xiàn)miR-29與MM的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。本研究旨在探討血清MMP-13、PF4和miR-29在MM鑒別診斷和療效評估中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年2月至2020年1月于本院確診并治療的MM患者80例納入研究作為病例組，所有患者的診斷均符合《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2017年修訂)》[5]?；颊咧委煼椒ǎ旱厝姿?硼替佐米+環(huán)磷酰胺治療，28 d為1個治療周期，每例患者經(jīng)4個治療周期，患者每隔1周到血液內(nèi)科門診進行隨訪。根據(jù)歐洲血液和骨髓移植組對患者的療效評價[6]，分為完全緩解(cCR)、接近完全緩解(nCR)、部分緩解(PR)、微小緩解(MR)、無變化(NC)、病情進展(PD)等幾個等級，并根據(jù)患者治療后的具體療效，將療效并未達到PR等級的患者納入難治組(32例)，療效到達了PR或者以上的患者納入緩解組(48例)。同期選取本院體檢健康者80例作為對照組。納入者均意識清楚，能夠正常的實施語言表達，可以和調(diào)查人員實施正常的溝通交流。排除標準：(1)入院前在其他的醫(yī)院實施免疫治療或者放化療者；(2)急慢性感染、甲狀腺疾病、其他臟器腫瘤者。本研究的開展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。納入研究者均自愿參加本研究。

1.2方法

1.2.1臨床資料與標本的采集 由研究人員將患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等基本信息進行記錄，BMI=體重/身高2(kg/m2)。采用促凝血管將禁食10 h以上的MM患者治療前、4個治療周期結(jié)束后和入院體檢健康者的靜脈血標本5 mL收集起來。收集的標本在1 h內(nèi)于4 ℃、3 500×g離心10 min，收集上層血清，并放在-80 ℃冰箱中保存待測。

1.2.2血清MMP-13與PF4水平的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清MMP-13和PF4水平，試劑盒購自南京基蛋生物科技有限公司，嚴格按試劑盒內(nèi)說明書中的步驟進行操作。血清MMP-13和PF4檢測的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于5%，提示此次實驗操作具有很好的精確度和重復(fù)性。

1.2.3血清miR-29表達水平的檢測 血清總RNA的提取依據(jù)血液RNA提起試劑盒(購自Bioteke公司)內(nèi)的說明書步驟實施。取上述方式提取的RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自Takara公司)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后采用實時熒光定量PCR(qPCR)，依據(jù)SYBR GREEN試劑盒中的說明書進行操作。反應(yīng)條件：95 ℃條件下進行5 min變性；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)45次。各組均設(shè)置檢測復(fù)孔3個。內(nèi)參基因采用GAPDH。引物序列如下，miR-29，F(xiàn)：5′-AATCCTTTATGTGACCAGAA-3′，R：5′-CTCCTTTGTTGAATCCAT-3′；GAPDH,F：5′-AGA AGG CTGGGGCTCATTTG-3′，R：5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。采用2-ΔΔCt法對miR-29的相對表達水平進行計算。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床基本信息及血清MMP-13、PF4和miR-29水平比較 病例組血清MMP-13和miR-29水平高于對照組，而病例組血清PF4水平低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組臨床基本信息及血清MMP-13、PF4和miR-29水平比較或n(%)]

2.2MM患者化療前后血清MMP-13、PF4和miR-29水平比較 與治療前相比，治療后患者PF4水平增高，MMP-13和miR-29水平降低(P<0.05)。治療前，緩解組患者血清MMP-13和miR-29水平均低于難治組，緩解組患者血清PF4水平高于難治組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；緩解組治療后血清MMP-13和miR-29水平較治療前均降低，緩解組治療后血清PF4水平較治療前增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 80例MM患者化療前后血清MMP-13、PF4、miR-29水平比較

2.3血清MMP-13、PF4和miR-29在MM鑒別診斷和療效評估的ROC分析 ROC曲線分析顯示：血清miR-29區(qū)分MM患者與健康者的AUC為0.913(95%CI：0.855～0.971，P<0.001)，診斷界值為12.4，靈敏度為84.1%，特異度為90.8%；血清MMP-13區(qū)分MM患者與健康者的AUC為0.802(95%CI：0.742～0.863，P<0.001)，診斷界值為46.6 pg/mL，靈敏度為81.2%，特異度為62.2%。血清PF4區(qū)分MM患者與健康者的AUC為0.602(95%CI：0.542～0.663，P=0.005)，診斷界值為22.6 μg/L，靈敏度為61.2%，特異度為52.2%。血清MMP-13、PF4和miR-29聯(lián)合檢測用于區(qū)分MM患者與健康者的AUC為0.924(95%CI：0.868～0.979，P<0.001)，靈敏度為82.5%，特異度為94.6%。見圖1。

注：A為MMP-13、PF4和miR-29單項用于診斷MM的ROC曲線；B為MMP-13、PF4和miR-29聯(lián)合檢測用于診斷MM的ROC曲線；C為MMP-13、PF4和miR-29單項用于區(qū)分緩解組與難治組的ROC曲線；D為聯(lián)合檢測MMP-13、PF4和miR-29用于區(qū)分緩解組與難治組的ROC曲線。

血清miR-29區(qū)分緩解組與難治組的AUC為0.874(95%CI：0.773～0.965，P<0.001)，診斷界值為16.2，靈敏度為78.3%，特異度為81.7%；血清MMP-13區(qū)分緩解組與難治組的AUC為0.824(95%CI：0.781～0.866，P<0.001)，診斷界值為60.6 pg/mL，靈敏度為83.8%，特異度為60.3%；血清PF4區(qū)分緩解組與難治組的AUC為0.534(95%CI：0.481～0.606，P=0.012)，診斷界值為18.6 μg/L，靈敏度為63.8%，特異度為50.3%；聯(lián)合檢測血清MMP-13、PF4和miR-29用于區(qū)分緩解組與難治組的AUC為0.889(95%CI：0.822～0.971，P<0.001)，靈敏度90.7%，特異度77.4%。見圖1。

3 討 論

JIIAN等[7]通過對淋巴瘤細胞系中MMP-13基因的檢測，發(fā)現(xiàn)與正常淋巴細胞株相比MMP-13基因顯著上調(diào)，且與腫瘤調(diào)控因子--信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3的活性呈正相關(guān)。PF4是近年發(fā)現(xiàn)的重要的抑癌基因。LIANG等[8]指出，將過表達PF4基因的慢病毒轉(zhuǎn)染接受異種骨髓移植的骨髓瘤小鼠后，免疫染色顯示骨髓瘤細胞凋亡和血管生成受到抑制，該實驗在骨髓瘤小鼠模型中證實了PF4的腫瘤生長抑制作用。miR-29是一種新型的基因調(diào)控因子，能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達或蛋白質(zhì)翻譯。KOLLINEROVA等[9]通過體外培養(yǎng)MM細胞株，觀察到上調(diào)miR-29可顯著降低MM細胞株的增殖能力與遷移能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，MM患者血清MMP-13與miR-29水平均顯著高于對照組(P<0.05)，而PF4水平顯著低于對照組(P<0.05)，這一結(jié)果與前期有關(guān)MM的體內(nèi)和機制研究相符合[3,8-9]，提示MM患者體內(nèi)MMP-13、miR-29與PF4的異常表達可能參與MM疾病進程。在評估患者治療療效時，本研究結(jié)果顯示：治療前，緩解組患者血清MMP-13和miR-29水平均低于難治組(P<0.05)，緩解組患者血清PF4水平高于難治組(P<0.05)。出現(xiàn)這一結(jié)果表明血清MMP-13、miR-29與PF4這3個指標在MM病情更加兇險的患者中變化更為顯著，在提示患者預(yù)后更差方面具有較高的價值。緩解組治療后血清MMP-13和miR-29水平較治療前均降低，緩解組治療后血清PF4水平較治療前增高，這一結(jié)果提示血清MMP-13、miR-29與PF4水平在MM患者接受治療并取得良好療效時會有所好轉(zhuǎn)，提示患者預(yù)后較好。值得注意的是，難治組患者治療前與治療后血清MMP-13、PF4和miR-29水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能為難治組MM患者在經(jīng)過4個周期化療后病情并為得到有效控制，這一結(jié)果也進一步提示血清MMP-13、PF4和miR-29在輔助評估患者療效中具有一定價值。ROC曲線分析顯示：血清MMP-13、PF4和miR-29聯(lián)合檢測用于區(qū)分MM患者及其療效的靈敏度、特異度均高于單項診斷，提示三者聯(lián)合診斷MM及用于療效評估的效果較好。然而，本研究仍存在下面的不足：(1)本研究所納入的患者全部為本院患者，這可能會使研究結(jié)果產(chǎn)生某些偏倚，今后需采用多中心的隊列研究進一步分析結(jié)果；(2)本研究納入80例MM患者，納入的病例數(shù)并不多，后期需要擴大樣本量來進一步證實血清MMP-13、PF4和miR-29檢測對MM患者的臨床價值。

綜上所述，血清MMP-13、PF4和miR-29對MM診斷及療效評估具有潛在的價值，有望為MM的診療提供新的途徑與思路。