李 嬋，陳 楠

天津市兒童醫(yī)院檢驗科，天津 300134

革蘭陰性菌是醫(yī)院感染的關(guān)鍵病原菌，大部分具備多重耐藥性，在全部β-內(nèi)酰胺抗菌藥物中，碳青霉烯類抗菌藥物的抑菌活力最強。近年來，伴隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛及不合理應(yīng)用，革蘭陰性菌對這種抗菌藥物形成了越來越多的耐藥性，不斷有在兒童或新生兒群體中暴發(fā)感染的報道[1-2]。根據(jù)全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CRASS)數(shù)據(jù)顯示，2019年兒童醫(yī)院的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌檢出率為14%，高于三級醫(yī)院的11.6%和二級醫(yī)院的5.5%，同時比2018年兒童醫(yī)院的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌檢出率(13.8%)增加0.2%。同時，耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌(CRAB)和耐碳青霉烯銅綠假單胞菌(CRPA)檢出率隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛和不合理使用也日益增多。產(chǎn)生碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥最主要的機制[3]。本研究使用免疫顯色法檢測了本地區(qū)兒童臨床分離的耐碳青霉烯革蘭陰性菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶表型，為臨床合理使用抗菌藥物提供依據(jù)，同時采用PCR檢測對免疫顯色法檢測的結(jié)果進行驗證，以明確此方法的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1材料 收集2019-2020年從本院住院患兒臨床標(biāo)本中分離得到的對亞胺培南或美羅培南耐藥的腸桿菌科細菌(共75株,其中肺炎克雷伯菌53株、大腸埃希菌22株)和非發(fā)酵菌(共62株，其中鮑曼不動桿菌20株、銅綠假單胞菌42株)，去除同一患者的重復(fù)菌株。

1.2儀器與試劑 VITEK MS、VITEK 2 Compact、PCR擴增儀購自賽默飛世爾科技有限公司；KPC型與NDM型碳青霉烯酶免疫顯色試劑盒、VIM型碳青霉烯酶免疫顯色試劑盒、OXA-23型碳青霉烯酶免疫顯色試劑盒、OXA-48型碳青霉烯酶免疫顯色試劑盒購自北京金山川公司；亞胺培南和美羅培南藥敏紙片購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細菌的鑒定與藥敏試驗 采用VITEK MS和VITEK 2 Compact全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)和全自動微生物鑒定儀對腸桿菌科細菌及非發(fā)酵菌各自開展鑒定和藥敏試驗。選用紙片法(K-B法)核查全自動儀器對亞胺培南和/或美羅培南耐藥性的檢測結(jié)果，確定待測菌株對亞胺培南和/或美羅培南的耐藥性與全自動儀器法檢測結(jié)果一致，折點參照CLSI M100 S29中的規(guī)范。

1.3.2PCR檢測耐藥基因 (1)待測菌核酸提?。簩⑻暨x出的菌株接種于血平板，35 ℃恒溫箱孵育18～24 h，挑單獨菌落添加50 μL無菌dd H2O攪拌，100 ℃水浴10 min，裂解細菌釋放出來DNA，以12 000 r/min離心5 min，取上清液檢測吸光度(A)比值A(chǔ)260/A280，評估DNA提取質(zhì)量。將得到的上清液分裝，于-20 ℃保存。(2)引物設(shè)計及擴增5種碳青霉烯酶基因：耐藥基因引物序列參考文獻[4-5]，由金唯智生物科技(北京)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

續(xù)表1 PCR引物序列

1.3.3免疫顯色法檢測碳青霉烯酶表型 使用免疫顯色試劑盒進行檢測，嚴格按說明書進行操作。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用WHONET5.6軟件分析細菌耐藥性。

2 結(jié) 果

2.1耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)的碳青霉烯酶表型分析

2.1.1PCR檢測耐藥基因 共檢測出blaKPC型11株，全部為肺炎克雷伯菌；blaNDM型37株，包含23株肺炎克雷伯菌和14株大腸埃希菌；blaKPC+blaNDM混合型19株，均為肺炎克雷伯菌；blaNDM+blaOXA-23混合型3株，均為大腸埃希菌；另有5株大腸埃希菌的耐藥機制不在檢測的5種碳青霉烯酶表型范圍內(nèi)。

2.1.2免疫顯色法檢測碳青霉烯酶表型 共檢測出blaKPC型12株，全部為肺炎克雷伯菌；blaNDM型40株，分別為23株肺炎克雷伯菌和17株大腸埃希菌；blaKPC+blaNDM混合型18株，均為肺炎克雷伯菌；blaOXA-23型1株，確認為大腸埃希菌；另有4株大腸埃希菌耐藥機制不在檢測的5種碳青霉烯酶表型范圍內(nèi)。

2.1.3免疫顯色法檢測碳青霉烯酶表型的效能評估 以PCR檢測結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，對免疫顯色法檢測碳青霉烯酶從符合率、靈敏度、特異度等方面進行評估，經(jīng)χ2檢驗，兩種方法檢測碳青霉烯酶主要表型的結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。75株CRE用兩種方法檢測，blaVIM和blaOXA-48兩種表型結(jié)果均為陰性。

表2 兩種方法檢測碳青霉烯酶主要表型的比較

2.262例兒童耐碳青霉烯非發(fā)酵菌的碳青霉烯酶表型分析

2.2.1PCR檢測耐藥基因 20株CRAB檢測到3種碳青霉烯酶基因，分別為blaNDM型(12株)、blaNDM+blaKPC型(2株)、blaNDM+blaOXA-23型(1株),以blaNDM型為主；42株CRPA檢測到blaKPC型23株。

2.2.2免疫顯色法檢測碳青霉烯酶表型 使用免疫顯色法對碳青霉烯酶表達陽性的菌株進行檢測，CRAB中檢測到blaNDM型12株、blaNDM+blaKPC型1株、blaNDM+blaOXA-23型1株，CRPA中檢測到21株blaKPC型。

2.2.3免疫顯色法檢測碳青霉烯酶表型的效能評估 以PCR結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，免疫顯色法檢測CRAB和CRPA碳青霉烯酶表型的靈敏度、特異度均較高。經(jīng)χ2檢驗，兩種方法檢測的碳青霉烯酶表型結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩種方法檢測碳青霉烯酶主要表型的比較

2.3產(chǎn)碳青霉烯酶革蘭陰性菌的耐藥情況分析 CRE菌株對阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素耐藥率較低，而對頭孢類抗菌藥物的耐藥率幾乎都在90%以上；CRAB菌株對阿米卡星、四環(huán)素、妥布霉素等耐藥率低；CRPA對阿米卡星耐藥率低，對慶大霉素和妥布霉素耐藥率在50%左右，見表4。

表4 耐碳青霉烯革蘭陰性菌的耐藥情況(%)

2.4產(chǎn)碳青霉烯酶革蘭陰性菌的臨床分布特征 <1歲的幼兒分離到CRE的比例明顯高于≥1歲的兒童，而非發(fā)酵菌(CRAB和CRPA)則主要分離自1～10歲的兒童(64.5%)的臨床標(biāo)本。分離到CRE的患兒中，男性所占比例高于女性；分離到非發(fā)酵菌的患兒中，男性所占比例(58.1%)比女性(41.9%)略高；分離到CRE最多的臨床標(biāo)本類型是尿液(37.3%)，分離到非發(fā)酵菌最多的臨床標(biāo)本則是痰液(48.6%)。見表5。

表5 分離到產(chǎn)碳青霉烯酶革蘭陰性菌的感染患兒臨床特征及標(biāo)本來源分析

3 討 論

銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和腸桿菌科細菌多見于自然界、醫(yī)療環(huán)境中以及皮膚上。它們是目前臨床中檢出最多的革蘭陰性菌，是醫(yī)院門診繼發(fā)感染的關(guān)鍵致病菌，尤其是鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌，可引起全身多個部位的感染，是泛耐藥菌中最常見的細菌。革蘭陰性菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥性的報道越來越多，對于兒童該類報道的數(shù)量也在逐年增多,但大多數(shù)是小范圍報道[6-7]。

本研究結(jié)果顯示：CRE中，肺炎克雷伯菌產(chǎn)碳青霉烯酶表型分別為blaNDM(43.40%)、blaKPC+blaNDM(35.85%)、blaKPC(20.75%)，大腸埃希菌產(chǎn)碳青霉烯酶表型則分別為blaNDM(63.64%)、blaNDM+blaOXA-23(13.64%)、其他(22.73%)。肺炎克雷伯菌以blaNDM型(包含與blaKPC混合型)為主，與國內(nèi)某大型兒童醫(yī)院的77.3%blaNDM型肺炎克雷伯菌的報道基本一致[8]。大腸埃希菌也以blaNDM型為主，與blaNDM型大腸埃希菌的主要流行區(qū)域是亞洲大陸的中國和印度的報道一致[9-10]。但北京地區(qū)兒童患者分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌是以blaKPC和blaIMP-4型金屬酶為主。這種碳青霉烯酶類型不同的現(xiàn)象，可能與各地區(qū)使用抗菌藥物種類不同有關(guān)[11]。而62株非發(fā)酵菌結(jié)果中，20株CRAB檢測到3種碳青霉烯酶基因以blaNDM型為主，與王紫琦等[12]研究的以blaOXA-23型檢出為主的結(jié)論不同，可能與地區(qū)和人群不同相關(guān)；42株CRPA以blaKPC為主。blaKPC型CRPA中帶blaKPC-2基因質(zhì)粒[13]，這種耐藥特性將如同其在腸桿菌科細菌一樣在銅綠假單胞菌中播散。

以PCR檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，免疫顯色法檢測CRE的3種主要表型blaKPC、blaNDM、blaOXA-43與PCR檢測結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同時，免疫顯色法對62株菌非發(fā)酵菌的結(jié)果也與PCR檢測結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但有幾株菌出現(xiàn)PCR陽性而免疫顯色法陰性，可能是因為菌株中目標(biāo)耐藥基因的表達水平低于免疫顯色法試劑的檢測低限，而PCR通過擴增過程可以檢測到。綜上所述，PCR法與免疫顯色法同樣可以檢測腸桿菌及非發(fā)酵菌的碳青霉烯酶耐藥基因。

綜上所述，腸桿菌和非發(fā)酵菌碳青霉烯酶耐藥基因分型所使用的免疫顯色法具有操作簡便、報告快速、便于操作、不易污染等特點，而且可用于檢測非發(fā)酵菌和腸桿菌科細菌，優(yōu)于其他傳統(tǒng)的檢測方法，適合基層醫(yī)療機構(gòu)實驗室常規(guī)開展。但本研究的標(biāo)本量偏少，需要日后積累更多的菌株后進行大樣本量檢測和分析，以期為臨床個性化用藥、及時準(zhǔn)確地進行評估提供更多參考。