萬冬冬，徐 俊，儲賞奇

南通市海門區(qū)人民醫(yī)院:1.腫瘤科;2.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇南通 226100

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥死亡的最主要原因，每年導(dǎo)致160萬人死亡[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型，多數(shù)患者確診時(shí)，通常處于晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。紫杉醇(PTX)是NSCLC常用化療藥物，但長期治療后，部分患者可產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響化療療效[3]。探討NSCLC的PTX耐藥機(jī)制，可為臨床治療提供新的思路，使更多患者從中受益。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在藥敏、耐藥肺癌細(xì)胞中異常表達(dá)，可能影響化療耐藥性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，小核仁RNA宿主基因10(SNHG10)是肝癌中的一種致癌LncRNA，其在NSCLC癌組織中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)SNHG10可抑制NSCLC細(xì)胞增殖[5]。LncRNA可作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)與靶mRNA競爭性結(jié)合對抗微小RNA(miRNA)，發(fā)揮海綿活性，抑制miRNA功能，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。了解上述干擾方式，可為疾病發(fā)展及治療提供新思路。miR-154-5p在多種癌癥中異常表達(dá)，NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫顯示，miR-154-5p在NSCLC中表達(dá)上調(diào)[7]。此外，Sratbase數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測SNHG10與miR-154-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，二者均在NSCLC中發(fā)揮調(diào)控作用，但與PTX耐藥性的關(guān)系尚未可知。因此本研究通過分析SNHG10對NSCLC細(xì)胞增殖、遷移及PTX耐藥性的影響及可能機(jī)制，以期為逆轉(zhuǎn)NSCLC患者PTX耐藥提供理論支持。

1 材料與方法

1.1主要材料及儀器 人NSCLC A549細(xì)胞株購自美國ATCC公司；MTT試劑盒(C0009S)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Dual Luciferase試劑盒(E1910)購自美國Promega公司；多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)、微小染色體維持蛋白(MCMP)、Bcl-2、Bax、β-actin兔單克隆抗體(ab233383、ab218242、ab32124、ab32503、ab213262)購自英國Abcam公司；TRIzol試劑(15596018)、High Capacity cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(4368813)、LipofectamineTM2000試劑(11668-027)購自美國Invitrogen公司；紫杉醇注射液(國藥準(zhǔn)字H20059962)購自哈藥集團(tuán)有限公司；pcDNA-SNHG10、pcDNA陰性對照(pcDNA-NC)、miR-154-5p抑制物(anti-miR-154-5p)、抑制物陰性對照(anti-NC)、miR-154-5p類似物、mimics陰性對照(miR-NC)質(zhì)粒均由自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)儀(型號：QuantStudioTM3，美國Applied Biosystems公司)，酶標(biāo)儀(型號：Multiskan GO，美國ThermoFisher公司)；電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 在RPMI 1640培養(yǎng)液(含100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清)中培養(yǎng)A549細(xì)胞，37 ℃、5%CO2，細(xì)胞密度達(dá)85%以上，傳代培養(yǎng)。將對數(shù)期A549細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，LipofectamineTM2000試劑盒分別或同時(shí)將pcDNA-SNHG10、pcDNA-NC、anti-miR-154-5p、anti-NC、miR-154-5p mimics與pcDNA-SNHG10、miR-NC與pcDNA-SNHG10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，記為pcDNA-SNHG10組、pcDNA-NC組、anti-miR-154-5p組、anti-NC組、miR-154-5p mimics+pcDNA-SNHG10組、miR-NC+pcDNA-SNHG10組；每組6個(gè)復(fù)孔。

1.2.2雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SNHG10與miR-154-5p的靶向關(guān)系 生物信息網(wǎng)站Starbase預(yù)測，SNHG10與miR-154-5p有結(jié)合片段。構(gòu)建野生型SNHG10-WT質(zhì)粒，并利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建突變型SNHG10-MUT質(zhì)粒，由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。將miR-154-5p mimics、miR-NC與SNHG10-WT、SNHG10-MUT共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，采用Dual Luciferase試劑盒檢測各組A549細(xì)胞熒光素酶活性。

1.2.3MTT法檢測細(xì)胞增殖及PTX敏感性 細(xì)胞增殖：各組A549細(xì)胞接種至96孔板(2×103個(gè)/孔)，各孔加200 μL RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，加MTT溶液(20 μL/孔)，培養(yǎng)4 h，加DMSO(150 μL/孔)，震蕩5 min，酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度值(A490)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[(對照組A490-實(shí)驗(yàn)組A490)/對照組A490×100%]。PTX敏感性：分別在培養(yǎng)基中加入1、5、10、20、40 nmol/L PTX，培養(yǎng)48 h，其余步驟同細(xì)胞增殖。計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

1.2.4Transwell檢測細(xì)胞遷移、侵襲 遷移實(shí)驗(yàn)：采用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液將各組A549細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/mL。Transwell小室上室加入細(xì)胞懸液100 μL，RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)500 μL加入下室中。培養(yǎng)48 h，多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察、記錄穿膜細(xì)胞數(shù)。

侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel基質(zhì)膠(無血清RPMI 1640培養(yǎng)液1∶8稀釋)平鋪于Transwell小室上室，室溫固化30 min，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.5qPCR檢測SNHG10與miR-154-5p表達(dá) TRIzol法提取A549細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用合成的cDNA作為模板在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μL)：9.0 μL SYBR mix、0.5 μL正向引物、0.5 μL反向引物、2.0 μL cDNA模板、8.0 μL RNase dH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸1 min。2-ΔΔCt法分別計(jì)算SNHG10、miR-154-5p相對于GAPDH、U6的表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6Western blot法檢測MRP1、MCMP、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液提取各組A549細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，取30 μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入β-actin、MRP1、MCMP、Bcl-2、Bax一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，次日加羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，孵育1 h，ECL顯色、拍照，分析各條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1過表達(dá)SNHG10對A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、PTX敏感性的影響 pcDNA-SNHG10組A549細(xì)胞miR-154-5p水平、PTX IC50、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、MRP1、MCMP及Bcl-2蛋白水平低于pcDNA-NC組(P<0.05)，SNHG10水平、細(xì)胞增殖抑制率及Bax蛋白水平高于pcDNA-NC組(P<0.05)。見表2、圖1、2。

注：A為細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；B為細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

表2 過表達(dá)SNHG10對A549細(xì)胞miR-154-5p水平、增殖、遷移、侵襲、PTX敏感性的影響

注：*P<0.05；n=6。

2.2下調(diào)miR-154-5p對A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、PTX敏感性的影響 anti-miR-154-5p組A549細(xì)胞miR-154-5p水平、PTX IC50值、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、MRP1、MCMP及Bcl-2蛋白水平低于anti-NC組(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率及Bax蛋白水平高于anti-NC組(P<0.05)。見表3及圖3、4。

2.3SNHG10靶向調(diào)控miR-154-5p表達(dá) Starbase網(wǎng)站預(yù)測，SNHG10與miR-154-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖5。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示，共轉(zhuǎn)染SNHG10-WT+miR-NC的A549細(xì)胞熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染SNHG10-WT+miR-154-5p mimics的A549細(xì)胞高(P<0.05)，見表4。

注：A為細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；B為細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

表3 下調(diào)miR-154-5p對A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、PTX敏感性的影響

注：*P<0.05；n=6。

注：WT表示野生型；MTU表示突變型。

表4 熒光素酶活性檢測

2.4過表達(dá)miR-154-5p可逆轉(zhuǎn)SNHG10對A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、PTX敏感性的影響 miR-154-5p mimics+pcDNA-SNHG10組A549細(xì)胞miR-154-5p水平、PTX IC50、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、MRP1、MCMP及Bcl-2蛋白水平高于miR-NC+pcDNA-SNHG10組(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率及Bax蛋白水平低于miR-NC+pcDNA-SNHG10組(P<0.05)。見表5及圖6、7。

注：A為細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；B為細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

表5 過表達(dá)miR-154-5p可逆轉(zhuǎn)SNHG10對A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、PTX敏感性的影響

注：*表示P<0.05。

3 討 論

NSCLC是肺癌的主要亞型，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[8]。NSCLC主要包括肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌兩種亞型。近年來，NSCLC靶向治療及化療等方面取得了一定的進(jìn)展，但仍然只有不到15%的NSCLC患者能夠存活5年以上[9]。PTX是第一個(gè)被確定的微管穩(wěn)定劑，被認(rèn)為是過去二十年化療中最重要的進(jìn)步，是使用最廣泛的抗腫瘤藥物之一，在多種癌癥中具有廣泛的活性，包括乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、NSCLC、膀胱癌和宮頸癌[10]。臨床治療中PTX是晚期NSCLC的替代療法，然而，內(nèi)在的和獲得性耐藥經(jīng)常出現(xiàn)在NSCLC治療過程中，影響療效[11]。為了提高PTX的化療效果，迫切需要探索其潛在的作用機(jī)制，并制定有效的策略來克服NSCLC對PTX的耐藥性。

多項(xiàng)研究表明，LncRNA可在不同癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并與腫瘤轉(zhuǎn)移及耐藥性相關(guān)[12]。LI等[13]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA NEAT1在NSCLC PTX耐藥細(xì)胞A549/PTX中顯著上調(diào)，抑制NEAT1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)A549/PTX細(xì)胞的PTX抗性。YANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1過表達(dá)可顯著增加NSCLC細(xì)胞對順鉑、吉非替尼、阿霉素和PTX等藥物的化學(xué)抗性，MALAT1可通過靶向miR-197-3p調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞的化學(xué)耐藥性。據(jù)報(bào)道，SNHG10在多種人類癌癥作為促癌基因發(fā)揮作用，SNHG10能夠促進(jìn)骨肉瘤的細(xì)胞增殖和侵襲[15]，且在肝細(xì)胞癌[16]和胃癌[17]中促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。但LIANG等[5]研究結(jié)果則表明，SNHG10在NSCLC中低表達(dá)，可能發(fā)揮抑癌作用。本研究中，過表達(dá)SNHG10后，A549細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)下降，細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞增殖蛋白MCMP、抗凋亡蛋白Bcl-2水平下降，促凋亡蛋白Bax水平升高，提示過表達(dá)SNHG10可抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，與LIANG[5]結(jié)果一致。CAO等[18]研究證實(shí)，SNHG10通過海綿化miR-1271-5p上調(diào)TRIM66，可能是前列腺癌細(xì)胞多西他賽耐藥的分子機(jī)制。本研究顯示，過表達(dá)SNHG10可降低A549細(xì)胞對PTX的IC50值，耐藥蛋白MRP1水平下降，提示過表達(dá)SNHG10可提高A549細(xì)胞的PTX敏感性。

LncRNA可充當(dāng)miRNA海綿，從而調(diào)節(jié)靶向mRNA的穩(wěn)定性，還可通過抑制miRNA活性參與腫瘤耐藥[19]。文獻(xiàn)[14]表明，MALAT1可能通過靶向miR-197-3p調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞的化學(xué)耐藥性。文獻(xiàn)[18]則顯示，SNHG10可通過海綿化miR-1271-5p，上調(diào)靶基因TRIM66的表達(dá)，參與前列腺癌多西他賽耐藥過程。為探討SNHG10在NSCLC細(xì)胞PTX耐藥性中的可能作用機(jī)制，本研究首先通過Starbase網(wǎng)站搜索發(fā)現(xiàn)，SNHG10與miR-154-5p存在互補(bǔ)序列，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，SNHG10可靶向調(diào)控miR-154-5p。miR-154-5p位于人類染色體14q32上，參與各種疾病的病理生理學(xué)過程。最近的研究表明，miR-154-5p在多種癌癥中作為抑制因子發(fā)揮作用，miR-154-5p在乳腺癌、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌、骨肉瘤、鼻咽癌下調(diào)[20]。本研究中，抑制miR-154-5p表達(dá)可降低A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，提示miR-154-5p在NSCLC中發(fā)揮促癌作用，與其在多數(shù)癌癥中的作用相反。推測造成這種現(xiàn)象的原因可能與癌癥類型以及miR-154-5p下游靶基因不同有關(guān)，在后續(xù)的研究中將從其下游基因入手進(jìn)行深入分析。此外，miR-154-5p過表達(dá)可增加乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的治療敏感性[21]。本研究結(jié)果表明，抑制miR-154-5p表達(dá)，可降低A549細(xì)胞對PTX的IC50值及MRP1水平，表明抑制miR-154-5p可提高A549細(xì)胞的PTX敏感性。進(jìn)一步分析顯示，過表達(dá)SNHG10可下調(diào)miR-154-5p表達(dá)，而過表達(dá)miR-154-5p可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)SNHG10對A549細(xì)胞IC50值、遷移、侵襲、增殖、MRP1、MCMP、Bcl-2、Bax蛋白的影響，提示SNHG10可通過靶向miR-154-5p提高NSCLC細(xì)胞的PTX敏感性。

有報(bào)道稱，miR-154-5p可通過靶向抑制鼻咽癌中的KIF14抑制細(xì)胞侵襲和遷移[22]；在宮頸癌中，miR-154-5p直接靶向CUL2調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[23]。其中，KIF14已被鑒定為多種癌癥的候選癌基因，過度表達(dá)KIF14的肺腫瘤患者顯示出生存率下降的趨勢[24]；KIF14是否參與miR-154-5p對NSCLC的調(diào)控作用還未可知，在未來的研究中將對此進(jìn)行深入分析。

綜上所述，過表達(dá)SNHG10可抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，增加NSCLC細(xì)胞對PTX的敏感性，可能通過靶向miR-154-5p發(fā)揮作用。