楊俊杰，景銘，劉佳宇，孫萌萌，史雅彤，趙煜煒，辛文妤

(濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，煙臺(tái) 264003)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為全身性關(guān)節(jié)腫痛、滑膜組織異常增生等，其發(fā)病機(jī)制至今未明[1]。研究表明，成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)在RA的發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用，F(xiàn)LS異常增殖和侵襲，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)和軟骨的破壞[2]。而核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nod-like receptor，NLR)家族PYRIN域蛋白3(nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體在RA患者滑膜增殖過(guò)程中被激活且在滑膜組織中過(guò)表達(dá)[3]。NLRP3炎癥小體是由傳感-NLRP3、銜接子-凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing CARD，ASC)、效應(yīng)蛋白-前半胱天冬蛋白酶(pro-caspase-1)三者相互結(jié)合形成的多蛋白復(fù)合物，發(fā)揮激活機(jī)體免疫炎癥的關(guān)鍵作用[4-5]。NLRP3炎癥小體的激活至少需要兩個(gè)信號(hào)：一是上調(diào)NLRP3和pro-IL-1β的啟動(dòng)信號(hào)[6]；二是由對(duì)病原相關(guān)分子模式和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式刺激ASC和pro-caspase1的裝配，最終使NLRP3炎性小體激活[7]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，RA中NLRP3炎性小體異常激活，其活化的下游產(chǎn)物半胱天冬蛋白酶(caspase-1)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)在RA炎癥活動(dòng)過(guò)程中扮演了重要的角色[8-9]。

自噬是一種重要的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，它通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)病原體、受損的細(xì)胞器等起到細(xì)胞保護(hù)作用。研究表明自噬與RA-FLS的凋亡抗性，破骨細(xì)胞形成以及最終嚴(yán)重的骨和軟骨破壞有關(guān)[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬與NLRP3炎癥小體之間相互調(diào)控關(guān)系緊密，可通過(guò)抑制NLRP3炎性小體激活使RA炎癥癥狀減輕[12]。雷帕霉素(rapamycin，RAPA)是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，可以抑制mTOR信號(hào)通路的mTORC1，從而激活自噬。但RAPA對(duì)于FLS細(xì)胞的作用筆者未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究自噬促進(jìn)劑RAPA對(duì)FLS細(xì)胞增殖以及NLRP3炎癥小體激活的影響，探討其潛在的機(jī)制，旨在為開發(fā)自噬相關(guān)藥物治療RA提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 FLS細(xì)胞由煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院提供，為人源滑膜組織提取，已進(jìn)行過(guò)特征性的鑒定[13]。本實(shí)驗(yàn)按照“濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)—涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究項(xiàng)目倫理審批件”執(zhí)行，批準(zhǔn)號(hào)：2018-20。RAPA(分子式：C51H79NO1；相對(duì)分子質(zhì)量：914.19；純度≥98%；批號(hào)：53123-88-9)購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒(中國(guó)biosharp，批號(hào)：BS350B)。高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(OperettaTM，美國(guó)PerkinElmer公司)。透射電子顯微鏡(型號(hào)：JEM-1400，日本電子株式會(huì)社)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) FLS細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用0.25%胰蛋白酶放入37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中消化2 min。加入血清終止消化后，在含10%胎牛血清的DMEM/ F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)。FLS細(xì)胞傳代至4～6代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力及RAPA對(duì)FLS增殖的影響 將傳代的FLS細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔細(xì)胞懸液100 μL(每孔含細(xì)胞5×103個(gè))。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置對(duì)照組及不同藥物濃度RAPA(100，200和400 nmol·L-1)組，每組設(shè)復(fù)孔3個(gè)。在接種細(xì)胞24 h后進(jìn)行給藥處理，分別在含有相應(yīng)濃度RAPA的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞活力，選擇適宜的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。之后將細(xì)胞分為對(duì)照組、TNF-α組、RAPA(100，200 nmol·L-1)組，RAPA預(yù)處理2 h，加入TNF-α(10 ng·mL-1)孵育48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃繼續(xù)孵育2 h，測(cè)定450 nm處吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=(測(cè)定組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

1.2.3透射電子顯微鏡觀察RAPA對(duì)FLS細(xì)胞自噬小體的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，將細(xì)胞分為：對(duì)照組、TNF-α組、RAPA組。RAPA組加入200 nmol·L-1RAPA培養(yǎng)2 h，每孔加入10 ng·mL-1TNF-α10 μL，對(duì)照組給予相應(yīng)體積培養(yǎng)液，TNF-α刺激48 h后收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，400×g離心10 min，棄去上清液，4 ℃戊二醛中過(guò)夜；PBS清洗3次，每次10 min，后經(jīng)4 ℃的1%鋨酸固定1.5 h，常規(guī)乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透、包埋、聚合；制備厚度0.5 μm半薄切片光鏡定位后，再制備60 nm厚度超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察。

1.2.4免疫熒光法檢測(cè)RAPA對(duì)FLS細(xì)胞LC3B表達(dá)的影響 按照文獻(xiàn)[14]的方法，采用細(xì)胞免疫熒光觀察FLS細(xì)胞內(nèi)的自噬水平。按照“1.2.3 ”的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，之后采用4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min；PBS洗滌3次，每孔加入0.3% Triton-X100溶液50 μL，室溫靜置15 min；PBS洗滌3次，每孔加入LC3B一抗(用1%無(wú)菌BSA以1：200稀釋為工作液)50 μL，4 ℃靜置過(guò)夜。次日37 ℃下避光孵育二抗(羊抗兔IgG-TRITC，1：1000)2 h，隨后用DAPI染核30 min，以PBS輕輕洗細(xì)胞3次，使用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像與分析。

1.2.5蛋白免疫印跡(Western blotting)法檢測(cè)自噬與NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白 按照“1.2.3”的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，離心收集細(xì)胞，低溫條件下裂解細(xì)胞，高速離心后吸取上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，按比例加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，-20 ℃保存。每組取蛋白質(zhì)樣本30 μg進(jìn)行凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜、封閉。經(jīng)SDS-PAGE電泳與濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，封閉后經(jīng)一抗、二抗孵育，化學(xué)發(fā)光顯影后采用圖像處理軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1RAPA對(duì)FLS細(xì)胞增殖的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，400 nmol·L-1RAPA能明顯抑制FLS的細(xì)胞活力(P<0.05)，而100，200 nmol·L-1RAPA對(duì)FLS細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，說(shuō)明RAPA在低于200 nmol·L-1時(shí)對(duì)FLS細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用(圖1)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用≤200 nmol·L-1RAPA作為給藥組劑量。

以對(duì)照組細(xì)胞增殖活力為100%計(jì)算，TNF-α組細(xì)胞增殖活力為(120.56±1.25)%，表明TNF-α可明顯誘導(dǎo)FLS增殖；與TNF-α組比較，100，200 nmol·L-1RAPA組細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)，說(shuō)明RAPA可明顯抑制FLS細(xì)胞的增殖(圖1)。

A.對(duì)照組；B.TNF-α組；C.100 mol·L-1RAPA組；D.200 mol·L-1RAPA組；①與空白對(duì)照組比較，t=4.538，27.89，P<0.05；②與TNF-α組比較，t=3.793，11.58，P<0.05。

2.2RAPA對(duì)FLS細(xì)胞內(nèi)自噬小體的影響 透射電鏡下觀察可見(jiàn)，F(xiàn)LS細(xì)胞凸起且長(zhǎng)，細(xì)胞核較為規(guī)整，核內(nèi)染色質(zhì)疏松，呈細(xì)顆粒狀分布在細(xì)胞核周圍。核仁明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，細(xì)胞質(zhì)突起長(zhǎng)而粗，細(xì)胞質(zhì)中往往缺乏高爾基復(fù)合體，可見(jiàn)少量小泡和囊泡[15]。TNF-α組細(xì)胞內(nèi)自噬小體增多，細(xì)胞核呈不規(guī)則；RAPA組FLS細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中自噬小體和自噬溶酶體明顯多于TNF-α組，且透射電鏡下可見(jiàn)典型細(xì)胞凋亡：細(xì)胞漿致密，細(xì)胞器互相靠近，染色質(zhì)濃縮，沿核膜排列，形成不同形狀及大小塊狀，線粒體腫脹及空泡樣變，可見(jiàn)核碎裂及凋亡小體(圖 2)。

A.對(duì)照組；B.TNF-α組；C.200 mol·L-1RAPA組；①與對(duì)照組比較，t=4.950，P<0.01；②與TNF-α組比較，t=3.474，P<0.05。

2.3RAPA對(duì)FLS細(xì)胞內(nèi)LC3B蛋白水平的影響 采用綠色熒光標(biāo)記自噬蛋白LC3B，綠色斑點(diǎn)代表自噬體的形成[16]。免疫熒光結(jié)果顯示，TNF-α組綠色熒光呈彌散狀分布于細(xì)胞中，LC3B蛋白表達(dá)較多且表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，熒光較為強(qiáng)烈。RAPA組綠色熒光成斑點(diǎn)狀出現(xiàn)在細(xì)胞中，熒光增強(qiáng)。結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，10 ng·mL-1的TNF-α增加FLS細(xì)胞內(nèi)LC3B蛋白的表達(dá)，而RAPA能夠進(jìn)一步增強(qiáng)LC3B蛋白的表達(dá)，細(xì)胞自噬水平升高，見(jiàn)圖3。

A.對(duì)照組；B.TNF-α組；C.200 mol·L-1RAPA組；①與對(duì)照組比較，t=3.641，P<0.01；②與TNF-α組比較，t=5.398，P<0.01。

2.4RAPA對(duì)FLS細(xì)胞自噬及NLRP3信號(hào)通路的影響 進(jìn)一步探索在FLS細(xì)胞增殖過(guò)程中RAPA與NLRP3炎癥小體激活之間的關(guān)系。采用TNF-α誘導(dǎo)FLS細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示TNF-α預(yù)處理后自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1水平增加，同時(shí)NLRP3炎癥小體的表達(dá)水平也相應(yīng)提高。采用RAPA處理后，F(xiàn)LS細(xì)胞內(nèi)LC3-II、Beclin1的表達(dá)水平進(jìn)一步增加，P62的表達(dá)水平下調(diào)，說(shuō)明RAPA誘導(dǎo)FLS細(xì)胞自噬水平提高；同時(shí)，采用RAPA處理后細(xì)胞內(nèi)NLRP3、caspase-1的表達(dá)水平下調(diào)，說(shuō)明NLRP3炎癥小體的活化被抑制(圖 4)。結(jié)果表明RAPA可以進(jìn)一步誘導(dǎo)FLS細(xì)胞自噬，同時(shí)相應(yīng)地抑制NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)。

A.對(duì)照組；B.TNF-α組；C.200 mol·L-1RAPA組；①與對(duì)照組比較，t=2.221～6.791，P<0.01；②與TNF-α組比較，t=2.834～9.889，P<0.01。

3 討論

RA是一種慢性、全身性自身免疫性疾病，其特征是關(guān)節(jié)滑膜持續(xù)發(fā)炎[17]?；?nèi)層組織中出現(xiàn)的炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)以及RA患者FLS細(xì)胞的增殖和凋亡平衡失調(diào)，使FLS不斷地“腫瘤樣”增生，是造成滑膜組織增生和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞的主要原因[18]。TNF-α是一種主要的免疫調(diào)節(jié)和前炎性因子，其在RA中表達(dá)上調(diào)且在RA病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。TNF-α在RA中刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成PGE2和膠原酶，引起骨和軟骨的吸收破壞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增生[19]。并且TNF-α可刺激體外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞NF-κB活化以及IL-6、IL-1β等炎癥因子分泌[20]。故本研究采用TNF-α處理FLS細(xì)胞，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后，F(xiàn)LS細(xì)胞增殖活力明顯升高，同時(shí)NLRP3炎癥小體表達(dá)升高。這與WANG等[21]造模方式一致，較好模擬RA患者體內(nèi)病理學(xué)特點(diǎn)。

自噬是真核細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(autophagy related gene，Atg)的調(diào)控下利用溶酶體降解自身細(xì)胞質(zhì)蛋白和受損細(xì)胞器的過(guò)程[22]。研究表明，NLRP3炎癥小體的活性受到自噬的負(fù)調(diào)控，自噬可以通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的激活[23-24]。自噬可以通過(guò)降解炎癥小體進(jìn)而負(fù)調(diào)控炎癥小體活性、降低炎性因子IL-1β、IL-18水平從而在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用[25]。研究發(fā)現(xiàn)RAPA可通過(guò)抑制NF-κB/MAPK信號(hào)通路產(chǎn)生抵抗炎癥的作用[26]。同時(shí)RAPA還能抑制Th17細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化，從而降低炎癥因子水平，改善RA[27]。基于此，采用自噬誘導(dǎo)劑RAPA探討其在FLS細(xì)胞增殖過(guò)程中對(duì)NLRP3炎癥小體激活的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，RAPA可下調(diào)NF-κB信號(hào)通路和NLRP3炎癥小體的活化，減少炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)[28]；此外，RAPA通過(guò)以自噬和P62/SQSTM1依賴方式限制NLRP3炎癥小體的活化[29]。研究表明，RAPA對(duì)NLRP3炎癥小體活化通路的兩種信號(hào)均可產(chǎn)生影響，即有效抑制NLRP3和caspase-1表達(dá)升高，這可能是基于對(duì)mTOR/TLR4信號(hào)通路的抑制[30]，也有可能是直接通過(guò)對(duì)NLRP3的抑制降低下游因子的持續(xù)上調(diào)[31]。本實(shí)驗(yàn)給予RAPA干預(yù)，200 nmol·L-1RAPA無(wú)明顯細(xì)胞毒性且可以顯著抑制FLS細(xì)胞的增殖。筆者采用透射電子顯微鏡和免疫熒光兩種方法觀察RAPA對(duì)FLS細(xì)胞中自噬的影響，發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠提高FLS細(xì)胞內(nèi)自噬水平并引起細(xì)胞增殖，這可能與TNF-α刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)有關(guān)[32]，而RAPA可以進(jìn)一步提高細(xì)胞內(nèi)自噬水平但明顯抑制細(xì)胞增殖。筆者對(duì)FLS細(xì)胞的自噬通路的分子機(jī)制進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)RAPA干預(yù)后LC3Ⅱ、Beclin-1表達(dá)水平均上調(diào)，P62表達(dá)水平下降，與此同時(shí)相應(yīng)的NLRP3和caspase-1的表達(dá)水平下降。表明自噬促進(jìn)劑RAPA對(duì)NLRP3炎癥小體起到負(fù)向調(diào)控作用。結(jié)合研究結(jié)果，推測(cè)RAPA可以提高FLS細(xì)胞自噬水平從而清除堆積的有害物質(zhì)，降低NLRP3炎癥小體的表達(dá)，從而抑制炎性因子的釋放進(jìn)而在RA中起到防治作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示RAPA可能通過(guò)增強(qiáng)FLS細(xì)胞中自噬水平，抑制NLRP3炎癥小體的激活從而抑制了FLS細(xì)胞增殖。由此可推測(cè)在FLS細(xì)胞中自噬水平提高可以抑制NLRP3炎癥小體的激活，這將為治療RA提供一個(gè)新的方向，為進(jìn)一步開發(fā)自噬調(diào)控劑及NLRP3炎性小體抑制劑用于治療和預(yù)防RA及不同的自身免疫性疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。