巴鑫，陳哲，涂勝豪

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430030)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種全身性慢性自身免疫性疾病，影響全球0.5%～1.0%的人口。RA主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)對稱性、持續(xù)性炎癥損害，若不及時治療會導致患者關(guān)節(jié)變形，關(guān)節(jié)活動度降低，軀體功能下降，甚至最終生活不能自理。目前，改善病情抗風濕藥物(disease modifying antirheumatic drugs，DMARDs)是RA的主要治療藥物。根據(jù)作用機制的不同，DMARDs可以分為三類：傳統(tǒng)合成DMARDs(如甲氨蝶呤、來氟米特)、生物DMARDs[如腫瘤壞死因子α(TNF-α)拮抗劑]和靶向DMARDs(如Janus激酶的抑制劑)。其中合成DMARDs不良反應(yīng)較大，副作用較多，患者耐受性差；生物DMARDs雖不良反應(yīng)少，但仍有三分之一治療效果不理想[1]，且價格昂貴，患者難以負擔；此外，靶向DMARDs藥物非選擇性的JAK抑制劑(Xeljanz)Ⅳ期臨床研究失敗，未達到心血管事件、惡性腫瘤發(fā)生率非劣效終點，因而被美國食品藥品管理局(FDA)給予黑框警告[1]?？傊壳搬槍?RA的治療，存在部分患者效果不佳、或無法阻止疾病進展等情況。因此，尋找治療RA安全有效的中醫(yī)藥顯得十分有意義。

烏頭湯源自《金匱要略》“病歷節(jié)不可屈伸，疼痛，烏頭湯主之”，其主要組成為：麻黃、芍藥、黃芪三兩，炙甘草，川烏五枚(葉父咀，以蜜二升，煎取一升，即出烏頭)。烏頭湯為溫經(jīng)散寒、除濕止痛之良劑，主治寒濕歷節(jié)之證，凡寒濕凝滯、經(jīng)脈閉阻之痹證、諸痛、腳氣等病，皆可運用?，F(xiàn)今烏頭湯主要用于治療風濕性疾病、坐骨神經(jīng)痛、膝骨關(guān)節(jié)炎等疾病，特別是在治療RA上，開展一系列臨床研究和實驗研究，并取得一些進展。

1 烏頭湯治療RA的臨床研究

烏頭湯作為治療痹癥的經(jīng)方，在臨床上被廣泛應(yīng)于治療RA。一系列臨床試驗證明烏頭湯可以明顯改善病情，聯(lián)合西藥使用時可以減少西藥用量，從而減少副作用的發(fā)生。

臨床研究證實，單用烏頭湯治療RA 8周后，患者臨床癥狀得到明顯改善，尤其是緩解疼痛、腫脹等效果顯著；病情活動度也得到明顯改善，C-反應(yīng)蛋白(CRP)水平、紅細胞沉降率(ESR)和DAS28評分都明顯降低；血清中炎癥因子，如白細胞介素(IL)-6、TNF-α的水平也明顯降低[3-4]。此外，在降低抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(cycliccitrullinated peptide，CCP)、類風濕因子(RF)上，與對照組甲氨蝶呤比較烏頭湯組有一定優(yōu)勢[3]；在降低CRP水平上，比雷公藤效果更明顯[5]。更多的研究是將烏頭湯加味和DMARDs(如甲氨蝶呤、來氟米特、艾拉莫德)、非甾體抗炎藥(NSAIDs)等西藥聯(lián)合應(yīng)用[6-9]。研究發(fā)現(xiàn)，烏頭湯聯(lián)合西藥治療寒濕痹阻型RA，在怕冷關(guān)節(jié)數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、視覺模擬評分、晨僵等指標方面改善作用均優(yōu)于單用常規(guī)西藥，并且在降低血沉、CRP、RF、IL-1β和 TNF-α等炎癥相關(guān)指標水平方面也均優(yōu)于對照組。此外，烏頭湯配合西藥能顯著降低西藥的不良反應(yīng)，特別是消化道反應(yīng)[10-13]。總之，不論單用烏頭湯治療還是中西醫(yī)結(jié)合治療，烏頭湯都可以明顯改善RA患者臨床癥狀，控制病情活動，提高關(guān)節(jié)活動能力，降低致殘率，提高藥物使用安全性，使患者獲益。

2 烏頭湯治療RA的實驗研究

烏頭湯治療RA不僅在臨床研究方面被證實確有療效，在實驗機制研究方面也取得一些進展。目前，關(guān)于烏頭湯治療RA的機制研究主要集中在抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)以及抑制血管生成等方面。

2.1烏頭湯的抗炎作用 烏頭湯抗炎作用主要體現(xiàn)在它能抑制炎癥細胞因子的產(chǎn)生，并且作用強度與其劑量、配伍和配比密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)烏頭湯能夠有效降低膠原誘導關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)大鼠血清中促炎細胞因子，如IL-6、IL-15、干擾素(IFN)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CFS)的含量，且與烏頭湯濃度呈負相關(guān)[14]。同樣，對于佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant induced arthritis，AIA)模型大鼠，烏頭湯不同配伍組均能不同程度下調(diào)血清中IL-1β、TNF-α水平。在配伍研究方面，全方組與其他各組比較較，差異有統(tǒng)計學意義，在調(diào)節(jié)IL-18、TNF-α水平上，全方組的效果最好[15]。烏頭湯也可通過影響趨化因子的表達來調(diào)節(jié)RA的炎癥網(wǎng)絡(luò)達到治療效果。MCP-1屬于趨化因子CC亞家族，能趨化單核/巨噬細胞的遷移，參與RA等自身免疫性疾病的發(fā)病。MCP-1與其受體CCR2結(jié)合后能將ERK1/2磷酸化，進而激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，最終調(diào)節(jié)炎癥細胞因子的生成。研究發(fā)現(xiàn)烏頭湯能降低CIA大鼠血清及踝關(guān)節(jié)局部MCP-1的含量，降低踝關(guān)節(jié)中CCR2和磷酸化ERK1/2的表達水平，提示烏頭湯通過下調(diào)CIA大鼠體內(nèi)MCP-l/CCR2/ERK1/2信號通路，來調(diào)節(jié)RA炎癥網(wǎng)絡(luò)。此外，烏頭湯對巨噬細胞趨化因子受體5(CCR5)信號通路的調(diào)節(jié)作用被證實在抑制RA炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞中CCR5信號通路是與細胞免疫應(yīng)答和細胞因子信號傳導相關(guān)的最重要信號通路，而CCR5敲除能改善AIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥[16]。該途徑中蛋白激酶C(PKC)和p38被視為RA中烏頭湯的靶蛋白，而PKC、p38可以促進巨噬細胞中的趨化因子[如巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1α)、受激活調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌因子(RANTES)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、干擾素誘導蛋白10(IP-10)]的表達，從而趨化和募集巨噬細胞、中性粒細胞、T細胞等到關(guān)節(jié)處，加重關(guān)節(jié)滑膜的炎癥。與CIA模型組大鼠比較，烏頭湯治療組大鼠血清中趨化因子MIP-lα、MIP-2、RANTES、IP-10和MCP-1的蛋白水平及踝關(guān)節(jié)中趨化因子MIP-lα、RANTES和IP-10的mRNA相對表達水平均明顯降低。此外，烏頭湯還降低來自CIA大鼠踝關(guān)節(jié)巨噬細胞中CCR5，PKC和p38的磷酸化水平[17]。以上實驗表明烏頭湯可以通過MCP-l/CCR2/ERK1/2信號通路和CCR5信號通路來調(diào)節(jié)CIA大鼠中的炎癥因子網(wǎng)絡(luò)，改善關(guān)節(jié)滑膜的炎癥，而達到治療RA目的。

2.3烏頭湯的鎮(zhèn)痛作用 研究觀察烏頭湯對小鼠熱板法和醋酸扭體法兩種疼痛模型的鎮(zhèn)痛作用結(jié)果表明，烏頭湯能顯著提高小鼠熱刺激所致疼痛的痛閾值，亦能明顯延長醋酸刺激所致扭體反應(yīng)的潛伏期，并減少其發(fā)生的次數(shù)，這些證明烏頭湯有很好的鎮(zhèn)痛作用[20]。與AIA大鼠模型組比較，大、中劑量烏頭湯能降低大鼠關(guān)節(jié)腫脹度，烏頭湯各劑量能升高冷板痛閾值，大、中劑量能提高機械痛閾值，大劑量對熱輻射痛閾值也有一定的增高作用。同時，烏頭湯能降低血漿前列腺素E(prostaglandin E，PGE)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)和背根神經(jīng)節(jié)瞬時感受器電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)表達水平，提高瞬時感受器電位M8(transient receptor potential melastatin 8，TRPM8)表達水平。這些提示烏頭湯具有鎮(zhèn)痛作用，其機制可能與降低血漿中PGE和5-HT水平以及調(diào)節(jié)背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1、TRPM8的表達有關(guān)[21-22]。另外，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，根據(jù)烏頭湯主要化學成分，找出烏頭湯中化合物可能作用于誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、p38、c-Jun 氨基末端激酶 1、TNF-α、磷酸二酯酶4A(phosphodiesterase 4A，PDE-4A)和 Kappa 阿片受體等靶標，提示其可能調(diào)控p38MAPK等信號通路，抑制NO釋放；調(diào)控JNK信號通路，減弱機械痛敏；作用于Kappa 阿片受體，最終導致突觸后膜超極化，阻止痛覺沖動的傳導和傳遞等，達到多靶點、多途徑治療疼痛的效果[23]。

2.4烏頭湯的抑制血管生成作用 烏頭湯顯著降低CIA大鼠炎癥關(guān)節(jié)滑膜組織中的未成熟血管，還抑制雞胚中體內(nèi)血管生成和體外血管內(nèi)皮生長因子165(vascular endothelial growth factor165，VEGF165)誘導的微血管芽形成。同時，烏頭湯抑制MH7A誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的遷移、侵襲、粘附和血管形成。此外，烏頭湯顯著降低CIA大鼠滑膜中和HUVEC中促血管生成細胞因子的表達，包括VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)、白細胞介素1β(IL-1β)、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGFβ)、血小板衍生生長因子、胎盤生長因子、血管生成素(AngⅠ/Ⅱ)等[24]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，WTD改善滑膜血管生成的潛在機制可能與PI3K-AKT-mTOR和HIF-1α途徑有關(guān)[25]。

2.5其他 此外，烏頭湯在抗氧化、減輕關(guān)節(jié)損傷，表觀遺傳學及網(wǎng)絡(luò)藥理學方面也取得一些研究進展。烏頭湯可以通過升高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，降低AIA大鼠血清中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量而起到抗氧化作用；抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(消化基質(zhì)蛋白多糖、糖蛋白的基質(zhì)酶MMP-3、能特異性降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原的膠原酶MMPs-1，13和水解蛋白聚糖的金屬蛋白酶ADAMTs)的產(chǎn)生，減輕CIA大鼠的軟骨損傷[26]。

在表觀遺傳方面，烏頭湯可以通過調(diào)節(jié)DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA，來改善RA的癥狀。已有研究顯示，與健康者比較，RA患者免疫細胞內(nèi)甲基化異常及甲基轉(zhuǎn)移酶表達異常，與細胞遷移、細胞黏附、細胞外基質(zhì)代謝相關(guān)的一些基因DNA甲基化出現(xiàn)紊亂，外周血單個核細胞組蛋白去乙?；?histone decetylases，HDAC)的活性顯著增加[27]。改善組蛋白乙酰化水平，RA癥狀也得到緩解[28]。研究發(fā)現(xiàn)，與CIA模型組比較，烏頭湯組DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的mRNA表達顯著降低、DNA甲基化水平顯著降低，而PBMC的組蛋白3(H3)乙?；^表達。這表明烏頭湯可通過DNA甲基化和組蛋白修飾，達到改善RA病情的作用[29]。此外，WTD還可以通過激動芳香烴受體 (AhR)，促進長鏈非編碼RNA LOC101928120的轉(zhuǎn)錄，進而降低SHC1，最終抑制了IL-1β引起的軟骨細胞凋亡和ROS產(chǎn)生[30]。

通過將藥物靶標預測，網(wǎng)絡(luò)分析和實驗驗證相結(jié)合的方法，分析出烏頭湯可能通過調(diào)節(jié)產(chǎn)熱PPAR-γ共激活因子發(fā)揮緩解寒性RA癥狀的作用。通過實驗驗證與PPAR-γ共激活因子產(chǎn)熱通路相關(guān)蛋白，包括PPAR-γ、核受體輔助活化因子1(nuclear receptor coactivator 1，NC0A1)、核受體輔助活化因子2(NC0A2)、轉(zhuǎn)錄中介體復合物1(mediator comple 1，MED1)、類視黃醇X受體α(retinoid X receptor α，RXR-α)和轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding binding protein，CREBBP)等6個分子在大鼠踝關(guān)節(jié)組織及體外培養(yǎng)的RA-FLS細胞中的蛋白表達水平均顯著降低。烏頭湯治療后，CIA寒證模型組的PPAR-γ，RXR-α，MED1和NC0A2蛋白表達水平呈濃度依賴性增加，且作用效果與CIA寒熱證型相關(guān)。烏頭湯在CIA熱證模型組中對六種蛋白的調(diào)節(jié)作用較對CIA寒性組的作用弱[31-32]。烏頭湯可能是通過調(diào)節(jié)PTGS2、ESR1、ESR2、NOS2、AR等靶點，調(diào)控TNF信號通路、人巨細胞病毒感染、IL-17信號通路、Th17細胞分化、NOD樣受體信號通路、Th1和Th2細胞分化、T細胞受體信號通路、FOXO信號通路、Toll樣受體信號通路等通路，從而抑制炎癥，調(diào)節(jié)免疫功能達到治療RA的目的[33]。

3 結(jié)論

烏頭湯具有抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抑制血管生成等作用，可以抑制炎癥細胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，抑制細胞因子對滑膜和軟骨細胞的刺激作用，阻止滑膜炎癥細胞浸潤，抑制關(guān)節(jié)炎性遞質(zhì)和蛋白水解酶的釋放，從而減少關(guān)節(jié)軟骨、骨質(zhì)的吸收，阻止骨的破壞，減少血管翳的形成，減輕病情，這可能是烏頭湯治療RA主要機制之一。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學和表觀遺傳學的發(fā)展，對烏頭湯治療RA臨床研究和實驗研究進一步的深入，有利于探索傳統(tǒng)方劑烏頭湯治療RA多靶點、多途徑的具體機制，為烏頭湯的臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)，有利于揭示RA的發(fā)病機制，為新藥的開發(fā)提供基礎(chǔ)。