李海東，王旭，王藝睿，馮桂澤，倪佳慧，游艷，沈曉燕

(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，上海 200120)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以自身產(chǎn)生大量抗體、損害自身組織、累及多系統(tǒng)多臟器、反復(fù)發(fā)作等為特征的自身免疫疾病[1]。SLE的病因較為復(fù)雜，異質(zhì)性較強(qiáng)，與多種遺傳與環(huán)境因素密切相關(guān)[2]。SLE的臨床表現(xiàn)多樣，主要特征為因自身抗體的產(chǎn)生和免疫復(fù)合物的沉積而引起多器官的炎癥和組織損傷[3]。其中，腎臟炎癥及腎損傷是最常見且最嚴(yán)重的SLE并發(fā)癥之一，通常表現(xiàn)為大量炎癥細(xì)胞浸潤，內(nèi)皮增生，腎血管壞死，微血栓形成，腎小球重吸收與濾過功能急劇下降，腎功能殘缺不全，是SLE患者預(yù)后不良及死亡的主要原因[4]。在全球范圍內(nèi)，SLE發(fā)病率逐年上升[5]。

目前對于SLE，臨床治療藥物主要有糖皮質(zhì)激素、抗炎藥、免疫抑制劑及生物大分子制劑[6]。然而使用這些藥物的副作用仍是困擾人們多年的難題。蘆丁(rutin)，又名蕓香苷、維生素P，廣泛存在于蕓香、棗、杏、橙皮、番茄、蕎麥等植物中，屬于天然黃酮苷[7]。蘆丁具有廣泛的藥理作用，主要包括抗自由基、抗脂質(zhì)過氧化、拮抗血小板活化因子、維持血管張力以及抗炎等作用。同時(shí)，蘆丁在抗衰老、抗過敏、抗病毒等方面也具有顯著功效[8]。然而，蘆丁對于SLE的作用研究甚少，筆者在本實(shí)驗(yàn)探究蘆丁對MRL/lpr自發(fā)性紅斑狼瘡小鼠的作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 雌性Balb/c小鼠和雌性MRL/lpr小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2022-0004，分籠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院無特定病原體(SPF)級動物房。飼養(yǎng)溫度 20～24 ℃，相對濕度(50±5)%。飼料與水均經(jīng)過消毒，并由動物自由攝取。小鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d。

1.1.2藥品與試劑 蘆丁(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：MB5118，含量：>97%)。醋酸潑尼松片(prednisone acetate，PA，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：190337)。肌酐(CRE)測定試劑盒(貨號：C011-2-1，批號：20200603)、尿素氮(BUN)測試盒(貨號：C013-2-1，批號：20200603)和尿蛋白定量測試盒(CBB法)(貨號：C035-2-1，批號：20200527)均購于南京建成生物工程研究所。小鼠抗dsDNA lgM(5130，批號：200618K7)和小鼠抗dsDNA lgG(5120，批號：200618K6)均購于美國Alpha diagnostic。小鼠白細(xì)胞介素(IL)-6 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)(1210602，批號：2005-1)和小鼠干擾素(IFN)-γ ELISA(1210002，批號：2001-1)均購于達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。anti-JAK2 antibody (3230S，批號：201711)，anti-p-JAK2 antibody (3776，批號：201403) 均購于美國Cell Signaling Technology anti-p-STAT3 antibody (610189，批號：2326685) 購于美國Becton Dickinson。anti-GAPDH(AF0006)購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器與設(shè)備 賽多利斯電子天平[型號：Secura324-1C，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，感量：0.1 mg]；電子天平(型號：JY50002，上海良平儀器儀表有限公司，感量：0.01 g)；搖床(型號：KB-800，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；電冰箱(型號：218STPS，青島海爾股份有限公司)；磁力攪拌器(型號：GL-5250B，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；漩渦混合器(型號：VROTEX-1，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(型號：DHG-9030A，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電熱恒溫水槽(型號：DKB-8A，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(型號：Infinite 200 Pro，Tecan)；臺式高速冷凍離心機(jī)(型號：5425R，Eppendorf公司)；-80 ℃冰箱(型號：FDE50086FV-UTLS，Thermo公司)；正置熒光顯微鏡(型號：Axio Observer，Carl Zeiss 公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號：BOX F3，Syngene公司)。

1.2動物分組與給藥 以雌性Balb/c小鼠為正常對照(10只)，雌性MRL/lpr小鼠給藥前稱定質(zhì)量并測定尿蛋白含量，所有MRL/lpr小鼠初始體質(zhì)量均在29.3～30.6 g，按體質(zhì)量分為低質(zhì)量鼠(≤29.9 g，共25只)與高質(zhì)量鼠(>29.9 g，共25只)，低質(zhì)量鼠與高質(zhì)量鼠分別按蛋白尿水平隨機(jī)平均分為5組(每組5只)，1組低質(zhì)量鼠與1組高質(zhì)量鼠最終合并為1組(每組10只)，分別為模型對照組、醋酸潑尼松組及蘆丁小劑量組、中劑量組和大劑量組。醋酸潑尼松組給予醋酸潑尼松0.1 mg·kg-1，蘆丁小、中和大劑量組分別給予蘆丁25，50，100 mg·kg-1；所有藥物稱取所需質(zhì)量后，用對應(yīng)體積0.9%氯化鈉溶液溶解混勻。小鼠8周齡時(shí)開始按10 mL·kg·d-1灌胃給藥，連續(xù)給藥8周，正常對照組和模型對照組給予相同體積0.9%氯化鈉溶液。

1.3尿蛋白濃度的測定 采用提尾反射法收集小鼠尿液，采用尿蛋白檢測試劑盒(CBB法)檢測小鼠尿蛋白濃度。用雙蒸水調(diào)零，以563 mg·L-1蛋白標(biāo)準(zhǔn)液為標(biāo)準(zhǔn)，吸取尿液樣品5 μL與CCB(考馬斯亮藍(lán))試劑300 μL，充分混勻后，室溫反應(yīng)5 min，使用多功能酶標(biāo)儀在波長595 nm處測定吸光度(A)值。

1.4血肌酐(CRE)與血尿素氮(BUN)的檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采用CRE 測定試劑盒檢測小鼠血清CRE含量，BUN測試盒檢測小鼠BUN含量，按照試劑盒說明書操作。

1.5腎臟病理學(xué)檢測 取小鼠右側(cè)腎臟，于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水，石蠟包埋，制備石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。在顯微鏡下觀察切片，并進(jìn)行病理評分，對腎小球、腎間質(zhì)以及血管的病理損傷進(jìn)行分級評分[9]。

1.6血清中自身抗體與細(xì)胞因子檢測 采用ELISA法檢測血清中Anti-dsDNA IgG、Anti-dsDNA IgM、IFN-γ、IL-6的含量，按照試劑盒說明書操作。

1.7免疫印跡分析蛋白含量 通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離小鼠腎臟組織裂解物的等量總蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，根據(jù)已建立的方法進(jìn)行免疫印跡分析[10]。

2 結(jié)果

2.1尿蛋白含量 每2周進(jìn)行小鼠尿蛋白水平檢測顯示，最初每組小鼠尿蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，從第4周開始，模型對照組小鼠尿蛋白水平逐漸升高，并明顯高于正常對照組，說明由于自身抗體的沉積，MRL/lpr小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的自發(fā)性腎損傷。而在第4與第6周，與模型對照組比較，各劑量給藥組小鼠尿蛋白濃度有下降的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥8周后，與模型對照組比較，醋酸潑尼松組和蘆丁大劑量組小鼠平均尿蛋白含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，結(jié)果見圖1。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.醋酸潑尼松組；D.蘆丁小劑量組；E.蘆丁中劑量組；F.蘆丁大劑量組。①與正常對照組比較，t=2.641，P<0.05；②與正常對照組比較，t=4.115，6.312，P<0.01；③與模型對照組比較，t=3.022，P<0.05；④與模型對照組比較，t=4.804，P<0.01。

2.2小鼠血清中Anti-dsDNA IgG和IgM含量 醋酸潑尼松組和蘆丁中、大劑量組小鼠血清中Anti-dsDNA IgG含量顯著低于模型對照組(P<0.05或P<0.01)，并且與劑量呈正相關(guān)。說明蘆丁可以抑制Anti-dsDNA IgG在血液的累積。醋酸潑尼松組和蘆丁中、大劑量組小鼠血清中Anti-dsDNA IgM含量均顯著低于模型對照組(P<0.05或P<0.01)。此外，蘆丁大劑量組小鼠血清中Anti-dsDNA IgM的含量顯著低于蘆丁小劑量組(P<0.05)，體現(xiàn)出一定的劑量依賴性，結(jié)果見圖2。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.醋酸潑尼松組；D.蘆丁小劑量組；E.蘆丁中劑量組；F.蘆丁大劑量組。①與正常對照組比較，t=7.856，9.233，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.506，2.998，P<0.05；③與模型對照組比較，t=3.895～5.515，P<0.01；④與蘆丁小劑量組比較，t=2.723，P<0.05。

2.3腎功能的影響 醋酸潑尼松組和蘆丁小、中、大劑量組小鼠血清中CRE含量顯著低于模型對照組(均P<0.01)。醋酸潑尼松組和蘆丁中、大劑量組小鼠BUN含量顯著低于模型對照組(P<0.05或P<0.01)，且蘆丁大劑量組小鼠血清中BUN含量顯著低于蘆丁小劑量組(P<0.05)，說明蘆丁可劑量依賴性地抑制MRL/lpr小鼠的自發(fā)性腎損傷，結(jié)果見圖3。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.醋酸潑尼松組；D.蘆丁小劑量組；E.蘆丁中劑量組；F.蘆丁大劑量組。①與正常對照組比較，t=5.093，6.626，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.748，P<0.05；③與模型對照組比較，t=2.631～5.390，P<0.01；④與蘆丁小劑量組比較，t=2.575，P<0.05。

2.4小鼠血清IL-6和IFN-γ含量 醋酸潑尼松組和蘆丁中、大劑量組小鼠血清中IL-6含量均顯著低于模型對照組(P<0.05或P<0.01)，蘆丁在25～100 mg·kg-1劑量范圍內(nèi)呈明顯的劑量關(guān)系(P<0.05)。另外，醋酸潑尼松組和蘆丁大劑量組小鼠血清中IFN-γ的含量顯著低于模型對照組(P<0.05或P<0.01)，結(jié)果見圖4。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.醋酸潑尼松組；D.蘆丁小劑量組；E.蘆丁中劑量組；F.蘆丁大劑量組。①與正常對照組比較，t=6.520，6.994，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.508，2.878，P<0.05；③與模型對照組比較，t=5.157～5.221，P<0.01；④與蘆丁小劑量組比較，t=2.488，P<0.01。

2.5小鼠腎臟病變的影響 模型對照組小鼠腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重的腎小球、腎間質(zhì)及血管病理損傷，腎小球硬化并形成新月體，大量細(xì)胞浸潤在血管周及間質(zhì)區(qū)域，腎小球出現(xiàn)腫脹與增生。醋酸潑尼松組和蘆丁小、中、大劑量組小鼠的腎小球、腎間質(zhì)及血管病理損傷有一定程度的減輕，小鼠腎臟病理評分顯著低于模型對照組(P<0.05或P<0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)。表明蘆丁在25～100 mg·kg-1劑量范圍能顯著減輕MRL/lpr自發(fā)性腎臟病變，結(jié)果見圖5。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.醋酸潑尼松組；D.蘆丁小劑量組；E.蘆丁中劑量組；F.蘆丁大劑量組。①與正常對照組比較，t=18.62，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.990，P<0.05；③與模型對照組比較，t=5.820～6.212，P<0.01；④與蘆丁小劑量組比較，t=2.788，P<0.05。

2.6對小鼠腎臟組織JAK2-STAT3 信號通路活化的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠腎臟組織p-JAK2、p-STAT3的水平顯著上調(diào)。與模型對照組比較，醋酸潑尼松組和蘆丁小、中、大劑量組小鼠腎臟組織p-JAK2、p-STAT3的水平受到一定程度的抑制，結(jié)果見圖6。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.醋酸潑尼松組；D.蘆丁小劑量組；E.蘆丁中劑量組；F.蘆丁大劑量組。①與正常對照組比較，t=5.863，6.443，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.978，P<0.05；③與模型對照組比較，t=3.751～5.624，P<0.01；④與蘆丁小劑量組比較，t=4.211，P<0.01；⑤與蘆丁中劑量組比較，t=3.506，P<0.01。

3 討論

SLE是一種多系統(tǒng)參與的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)多樣，從輕微的皮膚黏膜損傷到嚴(yán)重的多器官及中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累[11]。SLE 病因尚不明確，遺傳、免疫、內(nèi)分泌及環(huán)境等多種因素在其發(fā)病進(jìn)程中起重要作用[11]。MRL/lpr小鼠是常用的SLE模型小鼠，帶有與凋亡相關(guān)的Fas基因，F(xiàn)as基因發(fā)生插入突變，導(dǎo)致異常轉(zhuǎn)錄，出現(xiàn)淋巴細(xì)胞增生基因(lymphoproliferative，lpr)，并產(chǎn)生大量抗體，并沉積在腎小球微血管，導(dǎo)致多種炎癥遞質(zhì)的合成，最終引起細(xì)胞浸潤，從而產(chǎn)生蛋白尿和功能性腎損害，是導(dǎo)致MRL/lpr小鼠死亡的重要原因[12]。本實(shí)驗(yàn)中模型對照組小鼠尿蛋白顯著升高，血清中CRE、BUN等指標(biāo)顯著上升，炎性細(xì)胞大量浸潤，腎臟病理損傷嚴(yán)重，提示該模型成功發(fā)病、癥狀明顯。

Fas蛋白屬于腫瘤壞死因子受體家族，是介導(dǎo)凋亡的重要蛋白。MRL/lpr小鼠由于逆轉(zhuǎn)座子可轉(zhuǎn)錄成分ETn插入Fas基因的第二內(nèi)含子中，導(dǎo)致Fas基因轉(zhuǎn)錄異常，引起Fas蛋白發(fā)生功能性缺陷而阻斷淋巴細(xì)胞凋亡[13]。免疫系統(tǒng)依賴凋亡機(jī)制清除對自身抗原有特異性并產(chǎn)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞(包括T、B細(xì)胞)，而MRL/lpr小鼠存在凋亡缺陷，導(dǎo)致外周活化的T、B細(xì)胞大量存在，并出現(xiàn)高γ球蛋白血癥。Fas突變使這些淋巴細(xì)胞增生卻難以凋亡，在體內(nèi)過度蓄積，細(xì)胞的基因組DNA作為抗原在體內(nèi)產(chǎn)生大量anti-ANA、anti-ssDNA、anti-dsDNA、anti-snRNP等抗體，并在腎臟中沉積，造成功能性腎損傷[14]。因此，本研究中模型對照組小鼠體內(nèi)dsDNA抗體大量沉積。而蘆丁各劑量組則劑量依賴性地明顯改善。其原因可能與蘆丁對異?；罨腡、B細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)，具體機(jī)制需進(jìn)一步探討。

MRL/lpr小鼠在紅斑狼瘡發(fā)病過程中，腎臟會因dsDNA抗體沉積而發(fā)生損傷，使腎小球?yàn)V過功能和重吸收能力下降，具體表現(xiàn)為小鼠尿蛋白水平會逐漸升高[15]。本實(shí)驗(yàn)給予不同劑量蘆丁后，小鼠尿蛋白水平較模型對照組顯著降低，說明蘆丁能夠一定程度保護(hù)腎的濾過和重吸收功能。

BUN和CRE分別是人體蛋白質(zhì)和肌肉的代謝產(chǎn)物，其終排泄器官為腎臟。因此當(dāng)腎功能受損后，BUN和CRE無法有效排出，BUN和CRE的濃度因潴留而升高。因此血清中BUN和CRE水平是臨床上反映腎功能的主要指標(biāo)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)模型對照組小鼠血清BUN和CRE的濃度較高，而不同劑量蘆丁組BUN和CRE的水平顯著降低，表明Rutin具有保護(hù)腎功能的作用。

隨著時(shí)間的推移，MRL/lpr小鼠后期腎臟會出現(xiàn)嚴(yán)重的腎小球、腎間質(zhì)及血管病理損傷，腎小球硬化并內(nèi)凹，出現(xiàn)嚴(yán)重的腫脹與增生，腎間質(zhì)及血管出現(xiàn)大量細(xì)胞浸潤。這些病理變化是由抗體沉積以及多種炎癥細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)途徑共同作用的結(jié)果[17]。研究表明，蘆丁具有抗炎、抗氧化等藥理活性，同時(shí)對肝、腎、神經(jīng)等具有保護(hù)作用[18]。與正常小鼠相比，模型對照組小鼠腎臟病理評分顯著升高，模型對照組小鼠的腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重病變，而各劑量蘆丁組腎臟病變明顯緩解，病理損傷評分顯著降低。其原因與炎癥有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

SLE可以促進(jìn)腎臟炎癥的發(fā)展?？乖贵w結(jié)合形成免疫復(fù)合物，于各組織器官沉積，腎臟尤為嚴(yán)重。免疫復(fù)合物沉積腎小球后破壞免疫平衡，引發(fā)炎癥反應(yīng)，IL-6、IFN-γ等炎性因子大量表達(dá)。在炎癥細(xì)胞浸潤及其他介質(zhì)參與下，極易發(fā)展為狼瘡性腎炎[19]。本研究顯示，模型對照組小鼠炎性因子表達(dá)水平顯著升高，而不同劑量蘆丁組IL-6、IFN-γ炎性因子表達(dá)量顯著下調(diào)。JAK-STAT被認(rèn)為是與炎癥相關(guān)的主要信號通路之一，介導(dǎo)IL-6、IFN-γ等炎性因子的表達(dá)[20]。研究表明，蘆丁可以靶向結(jié)合JAK2，抑制JAK2-STAT3信號通路的激活并阻斷下游炎癥級聯(lián)反應(yīng)[21]。本研究結(jié)果顯示蘆丁可以抑制小鼠腎組織中JAK2與STAT3的磷酸化，并顯著抑制IL-6、IFN-γ的表達(dá)。提示蘆丁的抗炎作用可能與抑制JAK2-STAT3信號通路活化有關(guān)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

目前SLE治療藥物以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物大分子為主，雖即刻有效，然而長期服用易產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)常見的并發(fā)癥也會嚴(yán)重影響 SLE 患者的正常生活[22]。因此，研發(fā)更安全有效的抗SLE藥物具有重要意義。蘆丁作為常見植物中的常見成分，低毒安全，藥理作用廣泛，對SLE中的腎損傷和炎癥反應(yīng)具有較好的保護(hù)作用。其機(jī)制可能是通過抑制JAK2活化并阻斷下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻礙相應(yīng)的免疫應(yīng)答。本研究顯示，蘆丁對SLE小鼠的腎損傷和炎癥反應(yīng)具有明顯的改善作用，其機(jī)制可能與抑制JAK2激活有關(guān)。

綜上所述，MRL/lpr小鼠腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重病理性損傷，尿蛋白增多、腎功能受損嚴(yán)重，血清中抗體含量與促炎因子含量顯著增加。而蘆丁可能通過對JAK2-STAT3的抑制作用調(diào)節(jié)MRL/lpr小鼠的炎癥反應(yīng)，減輕腎損傷，改善腎功能。具體機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。深入研究蘆丁對SLE人群的保護(hù)作用將為臨床防治SLE和并發(fā)腎損傷提供新的解決思路。