張陽，賈龍剛，耿偉濤，袁媛，楊帆，張寅靜，樊柏林，王艷萍*

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.諾佰克（武漢）生物科技有限公司，湖北 武漢 430090；3.湖北省疾病預(yù)防控制中心湖北省應(yīng)用毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430079）

益生菌被定義為對(duì)人類或其他動(dòng)物宿主健康具有有益影響的活的微生物[1-2]。許多研究表明，益生菌在緩解或預(yù)防人類疾病方面具有有益作用，如便秘[3]、腸易激綜合征[4]、炎癥性腸病[5]和神經(jīng)退行性疾病[6]等。此外，研究發(fā)現(xiàn)很多益生菌具有恢復(fù)和維持腸道健康或平衡口腔微生物群落的功能[7-8]。許多有潛力的益生菌菌株也被分離篩選出來，有望被添加到食品或微生態(tài)藥物中，給人類帶來健康益處，預(yù)防或治療人類疾病[9-10]。與此同時(shí)，對(duì)菌株進(jìn)行全面系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)也非常重要，這是菌株作為功能性原料被廣泛使用的前提和基礎(chǔ)。

kefir是一種黏稠、含微碳酸、對(duì)健康有許多益處的傳統(tǒng)發(fā)酵乳，是益生菌的良好來源[11-13]。在前期研究中，從西藏采集的kefir粒中分離篩選出一株馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3，它具有高產(chǎn)胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）[14-15]、顯著改善乳制品質(zhì)地、延長(zhǎng)乳品保質(zhì)期的特性[16]。功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ZW3具有調(diào)節(jié)腸道微生物群、改善抑郁樣行為障礙、減少免疫炎癥[17]等功效。馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3是一種很有潛力的食品原料或功能成分，可應(yīng)用于食品工業(yè)和疾病預(yù)防及治療領(lǐng)域。然而目前國內(nèi)外關(guān)于馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的綜合毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究報(bào)道較少。因此，本研究旨在通過大鼠急性經(jīng)口毒理實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)、哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)，評(píng)估馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3的遺傳毒性、致突變、潛在致癌作用及食用安全性，為其應(yīng)用作食品原料提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要試劑

馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3：天津科技大學(xué)微生物資源與開發(fā)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3凍干菌粉（活菌濃度6×1010CFU/g）：諾佰克（武漢）生物科技有限公司；血液稀釋液、溶血?jiǎng)荷虾|湖生物醫(yī)學(xué)有限公司；疊氮鈉、瓊脂粉（生物純）：美國Amresco公司；環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）：德國 Baxter Oncology GmbH 公司；敵克松、1，8-二羥基蔥醌蔥：德國Dr.EhrenstorferGmbH公司；DME/F12 1∶1（體積比）無血清培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液（pH值7.2～7.4）：美國 HyClone公司；葡萄糖-6-磷酸鹽（分析純）：美國SIGMARLife Science公司；2-氨基菊、絲裂霉素 C（mitomycin C，MMC）、秋水仙素：美國默克公司；L-組氨酸（分析純）、D-生物素（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；氯化鉀、氯化鎂、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、氯化鈉、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸、磷酸氫鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

急性經(jīng)口毒理實(shí)驗(yàn)選擇7～8周齡、SPF級(jí)的SD大鼠20只，雌雄各半，體重：180 g～220 g。哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)選擇7～12周齡、SPF級(jí)的昆明小鼠50只，雌雄各半，體重：25 g～35 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

中國倉鼠卵巢細(xì)胞株（CHO-K1細(xì)胞株）：中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)）；5株鼠傷寒沙門氏菌菌株（組氨酸缺陷型 TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535）：美國 moltox公司。

1.4 主要儀器設(shè)備

MEK-6318K型自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀：日本光電工業(yè)株式會(huì)社；MCO-18AIC（UV）CO2培養(yǎng)箱：日本 SANYO公司；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣凈化有限公司；DMIL LED倒置顯微鏡、DM500 R H三目生物顯微鏡：德國徠卡微系統(tǒng)股份公司。

1.5 方法

1.5.1 急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)參考GB 15193.3—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》[18]中限量法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2只同性別一籠，共10籠進(jìn)行飼養(yǎng)。設(shè)定一次灌胃劑量為10.0 g/kg體重，準(zhǔn)確配制濃度為0.5 g/mL的ZW3菌液，以20 mL/kg體重劑量對(duì)每只大鼠進(jìn)行灌胃。觀察期14 d，灌胃當(dāng)天停留0.5 h連續(xù)觀察，其余時(shí)間每日上、下午各觀察1次大鼠臨床體征，記錄動(dòng)物中毒癥狀及死亡數(shù)，并對(duì)異常情況作詳細(xì)記錄；實(shí)驗(yàn)前后測(cè)量并記錄動(dòng)物體重；分別在給予受試物前，給予受試物后1、24、48、72 h及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)所有動(dòng)物各測(cè)量1次肛溫；在適應(yīng)性喂養(yǎng)期、給藥后24 h和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)所有存活的動(dòng)物進(jìn)行尾靜脈采血并測(cè)量血液學(xué)指標(biāo)；最后，頸椎脫位處死動(dòng)物，收集并觀察動(dòng)物各組織器官情況。

1.5.2 細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)參考GB 15193.4—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》[19]進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)對(duì)照組，即自發(fā)回變對(duì)照組、陰性對(duì)照組（1和2，1為蒸餾水，2為DMSO）、陽性對(duì)照組（敵克松、疊氮鈉、2-氨基芴、1，8-二羥基蒽醌）。準(zhǔn)確配制濃度為 50、20、8、3.2 和1.28 mg/mL的ZW3菌液；將0.1 mL各劑量ZW3菌液和0.5 mL S9（需要活化時(shí)）加入測(cè)試平板頂部瓊脂中，混合并倒入底層培養(yǎng)基平板上，制備出5個(gè)劑量組的測(cè)試平板，每個(gè)劑量組均設(shè)含或不含S9代謝活化系統(tǒng)的兩個(gè)組別。每個(gè)菌株測(cè)試組和每個(gè)對(duì)照組在每個(gè)濃度下做3組平行，且在相同條件下重復(fù)整個(gè)測(cè)試一次。以上所有平板均在37℃下孵育48 h～52 h，計(jì)算每個(gè)培養(yǎng)皿中回變的菌落數(shù)并進(jìn)行結(jié)果分析。

1.5.3 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)參考GB15193.5—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)》[20]進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和高、中、低劑量組。對(duì)小鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分成5組，每組雌雄各5只，同性別5只一籠進(jìn)行飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)開始前，給動(dòng)物稱重，并排除疾病或其他異常跡象；準(zhǔn)確配制濃度為500、250、125 mg/mL的ZW3菌液，供高、中、低劑量灌胃使用；通過管飼法，對(duì)每組小鼠進(jìn)行兩次灌胃，兩次灌胃間隔24 h，小鼠灌胃容量均為20 mL/（kg體重/次），陰性對(duì)照組給予無菌蒸餾水，陽性對(duì)照組給予40 mg/kg體重的環(huán)磷酰胺溶液，高、中、低劑量組分別給予 10、5.0、2.5 g/kg 體重的ZW3菌液；第二次灌胃后6 h處死動(dòng)物，取動(dòng)物股骨骨髓，按照標(biāo)準(zhǔn)要求制片、觀察、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以P＜0.05被判定為具有顯著性差異。

1.5.4 體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)參考GB 15193.23—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)》[21]進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)設(shè)置高、中、低3個(gè)測(cè)試劑量組（ZW3濃度分別為5 000、2 500、1 250 μg/mL），陰性對(duì)照組（等量無血清培養(yǎng)液），陽性對(duì)照組1（終濃度為15 μg/mL的環(huán)磷酰胺）和陽性對(duì)照組2（終濃度為0.8 μg/mL的絲裂霉素C），其中各劑量組及陰性對(duì)照組均分別設(shè)置加和不加S9代謝活化系統(tǒng)的組別，而陽性對(duì)照組1為加S9、陽性對(duì)照組2為不加S9的情況下測(cè)試。中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1經(jīng)48 h培養(yǎng)（37℃，5%CO2）后，棄其培養(yǎng)液，各組分別暴露于受試物（或?qū)φ眨囵B(yǎng)4 h后棄上清，用生理鹽水洗滌3次，加入5 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h。在收獲前4 h，加入秋水仙素（終濃度為1 μg/mL），按常規(guī)方法消化、低滲、固定、制片、染色。每劑量組選200個(gè)分散良好的中期分裂相細(xì)胞，觀察記錄染色體畸變類型及畸變數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞畸變率（裂隙和多倍體單獨(dú)記錄不作為畸變率統(tǒng)計(jì)），計(jì)算公式如下。

1.6 數(shù)據(jù)處理

急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)法，并按動(dòng)物性別分別統(tǒng)計(jì)。其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件建立數(shù)據(jù)庫，采用卡方檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)前后動(dòng)物體重見表1，大鼠肛溫檢測(cè)結(jié)果見表2，血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表3。

表1 大鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Summary of acute oral toxicity test results in rats

表2 大鼠肛溫檢測(cè)結(jié)果Table 2 Rat anal temperature test results

表3 大鼠血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 3 Rat blood routine index test results

由表1可知，雌雄大鼠體重變化情況符合動(dòng)物正常生長(zhǎng)規(guī)律。由表2可知，雌性和雄性大鼠灌胃ZW3前后直腸溫度相似，差異不明顯。由表3可知，雌雄大鼠灌胃ZW3前后白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞值，均無明顯差異，且動(dòng)物灌胃ZW3后的血液學(xué)指標(biāo)與其他益生菌如M1[22]、唾液乳桿菌REN[23]、發(fā)酵乳桿菌HM3和布氏乳桿菌FD2[24]的相關(guān)研究結(jié)果相似。在整個(gè)14 d的觀察期內(nèi)，未見受試動(dòng)物死亡或出現(xiàn)明顯中毒反應(yīng)癥狀，運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、呼吸、消化和神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)正常，皮膚、毛發(fā)、眼睛、口腔等均未見異常，水分和飼料攝取量正常。處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后檢查胸腹部主要臟器，包括心臟、肺、肝、脾、腎、胃腸和生殖器，均無任何明顯的病理改變。上述結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3的大鼠急性經(jīng)口毒性LD50大于10.0 g/kg體重，按照急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于實(shí)際無毒級(jí)。

2.2 細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)菌回復(fù)突變第一次及重復(fù)實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照物結(jié)果見表4和表5。細(xì)菌回復(fù)突變第一次及重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6和表7。

表4 細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)第一次實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照物結(jié)果Table 4 Positive control result for the first experiment of Ames test

表5 細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照物結(jié)果Table 5 Positive control result for the repeat test of Ames test

表6 細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 First test results of Ames test

表7 細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Repeat test results of Ames test

由表4可知，所有的陽性對(duì)照劑在含或者不含S9代謝活化系統(tǒng)中均誘導(dǎo)了回復(fù)突變菌落的大幅成倍增加，而由表6可知，添加不同劑量的ZW3，在任何含或者不含S9代謝活化系統(tǒng)及不同測(cè)試菌株的組別中，測(cè)得的回復(fù)突變菌落計(jì)數(shù)數(shù)值，與蒸餾水、DMSO和自發(fā)回復(fù)突變對(duì)照組的數(shù)值相似。由表5及表7可知，重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3對(duì)5株實(shí)驗(yàn)菌株，在含或者不含S9代謝活化系統(tǒng)時(shí)，以及設(shè)置的各劑量組中，均未產(chǎn)生明顯抑菌作用，且各劑量組回變菌落數(shù)均未超過溶媒對(duì)照組菌落數(shù)2倍，且無劑量-反應(yīng)關(guān)系，判定ZW3的細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.3 小鼠紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小鼠骨髓紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 Micronucleus test results of mouse bone marrow cells

由表8可知，ZW3的各個(gè)劑量組中，嗜多染紅細(xì)胞與紅細(xì)胞總數(shù)的比率[PCE/（PCE+NCE）]均不少于陰性對(duì)照組的20%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及觀察樣本符合要求。陽性對(duì)照組的雌性和雄性小鼠的微核率分別為（1.57±0.26）%和（1.69±0.51）%，均與陰性對(duì)照組的微核率有極顯著性差異（P＜0.01）；相比之下，ZW3各劑量組的雄性和雌性小鼠的微核率，與陰性對(duì)照組的微核率無顯著性差異，且均正常值范圍內(nèi)。表明ZW3不會(huì)導(dǎo)致哺乳動(dòng)物嗜多染紅細(xì)胞含微核細(xì)胞率增加，不具有誘導(dǎo)細(xì)胞變異的風(fēng)險(xiǎn)。

2.4 體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)

馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3對(duì)CHO-K1細(xì)胞的毒性見表9。

表9 馬乳酒樣乳桿菌ZW3對(duì)CHO-K1細(xì)胞的毒性Table 9 Cytotoxicity of L.kefiranofaciens ZW3 on CHO-K1 cells

由表9可知，當(dāng)ZW3濃度達(dá)到5 000 μg/mL時(shí)，在含或不含S9的體系中CHO-K1細(xì)胞存活率分別為84.3%和83.0%，細(xì)胞相對(duì)增長(zhǎng)率分別為69.0%和75.5%，且ZW3在5 000 μg/mL濃度下有少量沉淀，因而設(shè)置ZW3在體外細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)中的最大劑量為 5 000 μg/mL。

ZW3體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表10。

表10 ZW3體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 10 In-vitro mammalian cell chromosome aberration test results of ZW3

由表10可知，陰性對(duì)照組有25個(gè)（+S9）和22個(gè)（-S9）染色體異常細(xì)胞，染色體畸變率分別為3.0%（+S9）和3.5%（-S9）；陽性對(duì)照環(huán)磷酰胺組有76個(gè)染色體異常細(xì)胞，絲裂霉素C組有66個(gè)，染色體畸變率分別為 15.0%（+S9）和 14.0%（-S9），極顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.01）。而ZW3的不同劑量組（-S9和+S9），染色體異常細(xì)胞和染色體畸變率均與陰性對(duì)照組沒有顯著性差異。表明馬乳酒樣乳桿菌ZW3體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

3 結(jié)論

本文通過大鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)、小鼠紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)對(duì)馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3進(jìn)行了全面的毒理學(xué)評(píng)估，以支持長(zhǎng)期食用馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3的安全性。結(jié)果表明，大鼠急性經(jīng)口毒性研究中，在單劑量為10 g/kg體重劑量下未觀察到與給藥相關(guān)的死亡率、發(fā)病率或毒性臨床癥狀。在細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)、小鼠紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)中，ZW3未表現(xiàn)出致誘變、致裂或基因毒性作用。因此，根據(jù)我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)判斷，馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3具有良好的食用安全性，為該菌株后續(xù)的功能研究以及其在產(chǎn)品中的應(yīng)用，提供有力的安全性支持。