林小蘭，吳銅，賴婷婷，龍櫟冰，方娣，韓冬梅，吳振先，3*，羅燾*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東省果蔬保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方園藝產(chǎn)品保鮮教育部工程研究中心，廣東 廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3.廣東省荔枝工程技術(shù)中心，廣東 廣州 510642）

砂糖橘是原產(chǎn)于廣東省四會(huì)的名特優(yōu)柑橘品種，以其甜味如砂糖而得名，又稱“十月桔”[1]。標(biāo)準(zhǔn)砂糖橘果實(shí)呈扁球形，具有皮薄、果汁豐富、化渣性好、總糖含量高等優(yōu)點(diǎn)[2]。但砂糖橘的組織結(jié)構(gòu)和生理特性較特殊，耐貯性較差，在成熟過(guò)程和采后環(huán)節(jié)中易受機(jī)械傷，易被病原菌侵染而發(fā)生腐爛，自然條件下采后貨架期僅1周～2周。真菌性病害是砂糖橘貯運(yùn)過(guò)程中常發(fā)生的病害，主要是貯藏前期頻發(fā)的青綠霉病和貯藏后期的酸腐病，感染綠霉病的砂糖橘果實(shí)7 d內(nèi)全果腐爛，感染青霉病則14 d內(nèi)全果腐爛。酸腐病主要發(fā)生在貯藏后期果實(shí)抗病力下降后，低溫貯藏2個(gè)月左右為發(fā)病高峰[3]。因此，尋找有效的保鮮方法對(duì)于減少砂糖橘采后損耗至關(guān)重要。目前我國(guó)砂糖橘的采后保鮮主要以化學(xué)藥劑保鮮為主，生產(chǎn)上還輔以水溶性蠟液為主的保鮮蠟。但長(zhǎng)期使用化學(xué)保鮮劑會(huì)使果實(shí)病原菌產(chǎn)生抗藥性，且實(shí)際生產(chǎn)中化學(xué)保鮮劑的超標(biāo)使用和殘留易造成食品安全問(wèn)題。植物天然提取物用于果蔬保鮮具有安全無(wú)毒的特點(diǎn)，主要有植物精油、酚類、生物堿、有機(jī)酸等[4]，多種植物特定器官或組織的提取物被報(bào)道對(duì)微生物具有抑菌潛力[5]，如劍麻提取液可以有效降低綠霉病發(fā)病率[6]；印度楝樹(shù)皮提取物處理番茄可以抑制由茄腐鐮孢引起的果實(shí)腐爛[7]。

竹子被當(dāng)作治療發(fā)燒和解毒的傳統(tǒng)中藥有很長(zhǎng)的歷史[8]。竹子的多個(gè)部位富含抗氧化物質(zhì)，作為公認(rèn)的食品抗氧化劑天然來(lái)源，竹葉抗氧化物目前已被列入GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》。竹子的各種產(chǎn)品中富含促進(jìn)健康的次生代謝物，也有越來(lái)越多的竹產(chǎn)品被報(bào)道用于新鮮產(chǎn)品的采后處理。竹醋液（bamboo pyroligneous acid，BPA）是一種在有限氧氣條件下熱解竹子獲得的產(chǎn)品[9]，在農(nóng)藥增效[10]、抑菌和殺菌[11]、土壤改良[12]、鮮切花保鮮[13]等多方面均有應(yīng)用。有研究表明，BPA對(duì)人體安全可靠[14-15]。朱忠貴等[16]在金針菇液體培養(yǎng)基里加入不同濃度BPA，發(fā)現(xiàn)0.01%、0.1%BPA對(duì)金針菇生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。BPA作為主要成分被制作成復(fù)合天然食品添加劑。BPA對(duì)維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和抑制真菌病原體有效，能有效激活苯丙素代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而提高總黃酮和酚類物質(zhì)的含量，保持蘋果品質(zhì)并提高抗性[17]。近年來(lái)竹醋液應(yīng)用于柑橘果實(shí)采后保鮮的相關(guān)報(bào)道逐漸增多，如臍橙浸泡竹醋液后貯藏105 d，其腐爛率相比清水對(duì)照降低了14.77%，總糖和可溶性固形物則比清水對(duì)照高1%和1.55%[18]；以1.5%竹醋液和1%殼聚糖復(fù)合物處理?xiàng)崭?，明顯降低了爛果率，有效抑制膜脂過(guò)氧化作用[19]，但竹醋液在砂糖橘果實(shí)上的保鮮效果未見(jiàn)系統(tǒng)研究。因此，本試驗(yàn)對(duì)常溫貯藏的砂糖橘、機(jī)械傷果和接種指狀青霉砂糖橘果實(shí)進(jìn)行不同濃度的竹醋液處理，系統(tǒng)研究竹醋液對(duì)砂糖橘果實(shí)的防腐保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

砂糖橘：廣州市從化華隆果蔬保鮮有限公司；指狀青霉：孢子活化后培養(yǎng)3 d，湘潭大學(xué)陶能國(guó)教授饋贈(zèng)；竹醋液（BPA）：江陰中炬生物科技有限公司；次氯酸、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、Na2B4O7·10H2O、硼酸、濃鹽酸（均為分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

恒溫箱（BAO-150A）：施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；保鮮盒（22 cm×14 cm×14.5 cm、33 cm×21 cm×10 cm）：上海樂(lè)扣樂(lè)扣貿(mào)易有限公司；超聲波萃取儀（KQ 5200E）：昆山市超聲儀器有限公司；渦旋機(jī)（QL-901）：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；微型離心機(jī)（5426）：Eppendorf（中國(guó)）有限公司；酶標(biāo)儀（1530-801285）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV759CRT）：上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 竹醋液處理砂糖橘

1.2.1.1 竹醋液處理和貯藏

挑選成熟度相對(duì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害和無(wú)機(jī)械損傷的砂糖橘，混勻隨機(jī)分成4組，分別置于250 mL/L（T1）、150 mL/L（T2）和 50 mL/L（T3）竹醋液和蒸餾水（CK）中，浸泡5 min后撈出自然晾干。將晾干的砂糖橘裝入聚乙烯薄袋（厚度0.03 mm），每袋10個(gè)，排放整齊并扎口。每個(gè)處理不少于20袋，于（25±1）℃、85%～90%相對(duì)濕度下貯藏。分別在貯藏10、20、30 d和36 d觀察和取樣。固定其中5袋進(jìn)行觀察，其余用于后期取樣。

1.2.1.2 定期觀察和取樣

每隔10 d觀察各處理和對(duì)照組固定的5袋果，記錄果實(shí)腐爛率和病害侵染率。每個(gè)處理組隨機(jī)拿3袋果進(jìn)行取樣，將果皮和果肉分離，用液氮冷凍完全，研成小塊后保存在-80℃冰箱備用。果實(shí)腐爛率和果實(shí)侵染率計(jì)算公式如下。

果實(shí)腐爛率/%=∑（腐爛果實(shí)數(shù)量）/10×100

果實(shí)侵染率/%=∑（發(fā)病果實(shí)數(shù)量）/10×100

1.2.2 砂糖橘機(jī)械造傷和竹醋液處理

1.2.2.1 造傷處理

挑選成熟度相對(duì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害和無(wú)機(jī)械傷的果實(shí)，用自制的扎孔器在每個(gè)果赤道面上等距離扎3組孔（2 mm深，直徑4 mm，12個(gè)針孔）。將造傷的果混勻隨機(jī)分成 4 組，分別放入 250 mL/L（T1）、150 mL/L（T2）和 50 mL/L（T3）竹醋液和蒸餾水（CK）中，浸泡 5 min后撈出，瀝干，鋪放在清潔和滅菌過(guò)的超凈工作臺(tái)上微風(fēng)晾干。

1.2.2.2 貯藏和數(shù)據(jù)記錄

保鮮盒清潔后用75%乙醇消毒、晾干，用于果實(shí)貯藏。每個(gè)保鮮盒放10個(gè)果實(shí)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，蓋上密封蓋后，置于90%～95%相對(duì)濕度和25℃下貯藏。每48 h開(kāi)蓋換氣，記錄每個(gè)處理的果實(shí)侵染率、傷口侵染率和果實(shí)腐爛率，計(jì)算公式如下。

傷口侵染率/%=∑（發(fā)病傷口數(shù)量）/30×100

1.2.3 竹醋液處理砂糖橘接種指狀青霉孢子

1.2.3.1 接種指狀青霉

參考朱從一[20]的方法接種，略有修改?；罨? d～4 d的菌株，挑選孢子懸浮于無(wú)菌水中，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制成濃度1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液。挑選成熟度相對(duì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害和無(wú)機(jī)械傷的砂糖橘，用2%次氯酸鈉溶液浸泡，表面消毒3 min后快速撈出，無(wú)菌水沖洗后放于超凈工作臺(tái)上微風(fēng)晾干。用自制扎孔器在每個(gè)果實(shí)的果皮赤道面上等距扎2個(gè)孔（深2 mm，圓形直徑4 mm，12個(gè)小針孔）。用無(wú)菌水將竹醋液稀釋成250 mL/L（T1）、150 mL/L（T2）和 50 mL/L（T3），以蒸餾水為對(duì)照（CK），用移液槍吸取10 μL竹醋液注射到每個(gè)果皮傷口。超凈工作臺(tái)中微風(fēng)晾干10 min后，移液槍吸取指狀青霉孢子懸浮液接種至每個(gè)果皮傷口，每孔 10 μL，微風(fēng)晾干 10 min。

1.2.3.2 貯藏和數(shù)據(jù)記錄

保鮮盒（33 cm×21 cm×10 cm）清潔后用75%乙醇消毒、晾干。每個(gè)保鮮盒放20個(gè)接種的果實(shí)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于90%～95%相對(duì)濕度和25℃下貯藏。每24 h進(jìn)行開(kāi)蓋換氣，每個(gè)處理固定3盒用于記錄果實(shí)侵染率、傷口侵染率、腐爛率和病斑指數(shù)，用十字交叉法測(cè)定病斑直徑。接種后4、24、48 h取樣，每個(gè)處理隨機(jī)取10個(gè)果實(shí)，削取以接種點(diǎn)為中心、直徑2 cm的果皮，作為接種點(diǎn)果皮樣品，同時(shí)削取未接種點(diǎn)的果皮，用液氮冷凍后，研碎后保存在-80℃冰箱備用。計(jì)算公式如下。

傷口侵染率/%=∑（發(fā)病傷口數(shù)量）/40×100

病斑指數(shù)/mm=∑（病斑直徑）/總接種點(diǎn)

1.2.4 總酚和總類黃酮含量的測(cè)定

1.2.4.1 樣品提取液的制備

果皮樣品用液氮研磨成粉末后，稱取0.1 g至2 mL離心管中，加入1 000 μL預(yù)冷的80%乙醇，超聲波萃取60 min（加冰降溫），結(jié)束后取出置于4℃冰箱，萃取過(guò)夜（10±2）h。第2天繼續(xù)超聲波萃取（加冰降溫）2 h，每隔0.5 h渦旋1次。4℃下以12 000×g離心10 min，吸取上清液至另一2 mL離心管，用于總類黃酮和總酚含量測(cè)定。

1.2.4.2 總類黃酮含量測(cè)定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測(cè)定總類黃酮含量[21-23]。準(zhǔn)確吸取500 μL果肉提取液或35 μL果皮提取液（加465 μL的80%乙醇補(bǔ)齊）于2 mL離心管中。另取500 μL 80%乙醇加入2 mL離心管中，作為空白對(duì)照。配制0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取0、10、20、40、60、80、100、200、300、400 μL 至 2 mL 帶刻度的離心管中，加80%乙醇補(bǔ)齊至500μL。所有樣品管、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品管和空白對(duì)照管分別加入50μL的5%NaNO2溶液，搖勻后避光放置6min。加入50μL的10%Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min。加入400 μL的4%NaOH溶液，搖勻，放置10 min。測(cè)定510 nm下吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=133.7x+0.75，R2=0.999）。通過(guò)外標(biāo)法以蘆丁當(dāng)量計(jì)算樣品中總類黃酮含量。

1.2.4.3 總酚含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定總酚含量[23-24]，并稍作修改。準(zhǔn)確吸取50μL果肉提取液?。诱麴s水550μL）或15 μL果皮提取液（加蒸餾水585 μL）于 5 mL離心管中，搖勻。另取600 μL蒸餾水加入5 mL離心管中，作為空白對(duì)照。配制110 μg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，準(zhǔn)確吸取 0、40、80、120、160、200、240、280 μL 于 5 mL離心管中，加蒸餾水補(bǔ)齊至600 μL。所有樣品管、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品管和空白對(duì)照管分別加入50 μL福林酚試劑，充分混勻。然后加入150 μL的20%Na2CO3溶液，充分混合后用蒸餾水定容至2.5 mL。室溫（25±1）℃避光（黑色塑料袋覆蓋）放置0.5 h，測(cè)定760 nm下吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=22.46x-0.28，R2=0.990 3）。通過(guò)外標(biāo)法以沒(méi)食子酸當(dāng)量計(jì)算樣品中總酚含量。

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶和過(guò)氧化物酶酶活測(cè)定

1.2.5.1 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）酶活測(cè)定

參照龐學(xué)群等[25]的方法，稍作修改。果皮用液氮研磨成粉末后，稱取0.2 g粉末于2 mL離心管中，加入1 mL、pH8.8的100 mmol/L硼酸鈉緩沖液混勻，萃取50 min。4℃下12 000×g離心20 min，制得的上清液為粗酶提液。將100 μL粗酶提液與1 mL 200 mmol/L苯丙氨酸和2 mL硼酸鈉緩沖液混勻，水浴鍋中37℃反應(yīng)1 h后，用100 μL 6 mmol/L鹽酸終止反應(yīng)。測(cè)定290 nm下吸光度，將每克鮮重（FW）每分鐘OD290增加0.01定義為一個(gè)酶活單位U。

1.2.5.2 過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）酶活測(cè)定

參照Huang等[26]的方法，稍作修改。果皮用液氮研磨成粉末后，稱取0.2 g于2 mL離心管中，加入1.0 mL pH7.0的磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）混勻。萃取50 min，4℃下12 000×g離心20 min，制得的上清液為粗酶提液。比色皿中加入50 μL粗酶提液，之后依次混入0.95 mL 0.2%愈創(chuàng)木酚、1.0 mL 0.3%H2O2和1.0 mL PBS，記錄470 nm下吸光度的變化，將每克鮮重（FW）每分鐘OD470增加0.01定義為一個(gè)酶活單位U。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010錄入和整理數(shù)據(jù)，使用SPSS Statistics 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析（單因素多重比較，Duncan法），使用Origin 8.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹醋液處理對(duì)砂糖橘常溫貯藏的影響

竹醋液處理對(duì)常溫貯藏過(guò)程中砂糖橘果實(shí)侵染率、果實(shí)腐爛率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 竹醋液處理對(duì)常溫貯藏過(guò)程中砂糖橘果實(shí)侵染率和果實(shí)腐爛率的影響Fig.1 The effect of BPA treatements on the total infection ratio and total decay ratio of‘Shatangju’fruits during storage at room temperature

如圖1所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組砂糖橘的果實(shí)侵染率和果實(shí)腐爛率逐漸上升。從10 d開(kāi)始，各組砂糖橘均出現(xiàn)病害侵染，貯藏第36天，CK組果實(shí)侵染率高達(dá)86%，各處理組果實(shí)侵染率均低于CK組。整個(gè)貯藏期間，T2和T3組果實(shí)侵染率均低于CK組，其中T2組處理可更為有效地抑制病菌對(duì)砂糖橘的侵染。果實(shí)腐爛率與果實(shí)侵染率呈現(xiàn)大致相同的趨勢(shì)，貯藏第10天，除T2組外，其他3組處理果實(shí)均出現(xiàn)腐爛；第20天，T2組果實(shí)首次出現(xiàn)腐爛；第36天，T2和T3組果實(shí)腐爛率僅為20%左右，而CK和T1組超過(guò)35%。綜合果實(shí)侵染率和果實(shí)腐爛率，各處理對(duì)砂糖橘均有防腐效果，其中T2處理對(duì)砂糖橘的防腐效果較為理想，T3次之，T1最差。

砂糖橘在常溫貯藏過(guò)程中易被各種病菌侵染導(dǎo)致腐爛[27]，而竹醋液是一種安全有效且適用于果蔬采后保鮮的生物源抑菌劑，在蘋果、臍橙、甜椒等果蔬上的處理試驗(yàn)結(jié)果顯示，竹醋液可以明顯提高果蔬的采后貯藏性，抑制擴(kuò)展青霉的侵染[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，竹醋液處理砂糖橘能增強(qiáng)砂糖橘對(duì)病菌的抵抗力，提高砂糖橘常溫條件下的貯藏性。但竹醋液濃度過(guò)高可能會(huì)適得其反，150 mL/L為最佳濃度，其次為50 mL/L。

2.2 竹醋液處理對(duì)機(jī)械傷砂糖橘的影響

砂糖橘果皮較薄，運(yùn)輸過(guò)程中易產(chǎn)生機(jī)械傷，病菌從傷口侵染，加快果實(shí)腐爛。機(jī)械傷組的果實(shí)中，只要有一個(gè)傷口受到病害侵染，即視為果實(shí)受到侵染。竹醋液處理對(duì)常溫貯藏過(guò)程中機(jī)械傷砂糖橘果實(shí)的傷口侵染率、果實(shí)侵染率和果實(shí)腐爛率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 竹醋液處理對(duì)常溫貯藏過(guò)程中機(jī)械傷砂糖橘果實(shí)的傷口侵染率、果實(shí)侵染率和果實(shí)腐爛率的影響Fig.2 The effect of BPA treatements on the spot infection ratio，fruit infection ratio and rot ratio of mechanical injured‘Shatangju’fruits during the storage at room temperature

如圖2A和圖2B所示，貯藏4 d～6 d，各處理組果實(shí)侵染率和傷口侵染率顯著低于CK組（P＜0.05），貯藏第8天開(kāi)始快速上升，12 d之后除CK處理外，其他處理果實(shí)侵染率均達(dá)到100%，傷口侵染率超過(guò)85%。對(duì)照組和處理組的果實(shí)侵染和腐爛進(jìn)程不一。如圖2C所示，CK組果實(shí)在貯藏后期迅速腐爛，12 d～14 d果實(shí)腐爛率從17%上升至37%，而3個(gè)處理組果實(shí)腐爛率在10 d～14 d保持穩(wěn)定，T1和T2處理組低于T3組。上述結(jié)果表明，竹醋液處理可較為有效地延緩機(jī)械損傷砂糖橘果實(shí)的腐爛，以250 mL/L濃度最佳。

2.3 竹醋液處理對(duì)指狀青霉接種導(dǎo)致的砂糖橘腐爛的影響

竹醋液處理對(duì)常溫貯藏過(guò)程中接種指狀青霉砂糖橘果實(shí)的傷口侵染率、果實(shí)腐爛率和病斑直徑的影響見(jiàn)圖3。

圖3 竹醋液處理對(duì)常溫貯藏過(guò)程中接種指狀青霉砂糖橘果實(shí)的傷口侵染率、果實(shí)腐爛率和病斑指數(shù)的影響Fig.3 The effect of BPA treatements on the total spot infection ratio，total decay ratio and lesion diameter of‘Shatangju’fruits inoculated with Penicillium digitatum during the storage at room temperature

由圖3可知，接種青霉菌后，砂糖橘在短時(shí)間內(nèi)即發(fā)生腐爛，這與文獻(xiàn)的研究結(jié)果相符[3]。貯藏2 d內(nèi)，各組的傷口侵染率超過(guò)了80%，竹醋液處理組的果實(shí)傷口侵染率略低于對(duì)照組（圖3A）。貯藏3 d后，處理組和對(duì)照組果實(shí)的傷口侵染率無(wú)顯著差異（P＞0.05），4 d時(shí)全部達(dá)到100%。砂糖橘果實(shí)在貯藏第4天開(kāi)始出現(xiàn)腐爛，T1和T3組的果實(shí)腐爛率低于對(duì)照（圖3B），然而各果盒中腐爛進(jìn)度和個(gè)數(shù)不一，各處理間果實(shí)腐爛率并無(wú)顯著差異。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，接種青霉后貯藏的砂糖橘病斑直徑快速增長(zhǎng)（圖3C），到第5天時(shí)總體病斑直徑約為60 mm，T1組在2 d～5 d病斑直徑略低于對(duì)照和其他處理組，且在前期（2 d～3 d）抑制病斑直徑發(fā)展效果明顯，可見(jiàn)竹醋液短期內(nèi)對(duì)于減少指狀青霉接種導(dǎo)致的傷口侵染率、果實(shí)腐爛率以及抑制病斑直徑的擴(kuò)大有效果，且隨著濃度的增加，保鮮效果越明顯。

2.4 竹醋液處理對(duì)常溫貯藏過(guò)程中砂糖橘果皮總酚和總類黃酮含量、PAL和POD酶活的影響

總酚和類黃酮作為重要的化學(xué)屏障，能夠參與植物抗病的防御反應(yīng)[28]。因此本研究測(cè)定了總酚和總類黃酮含量，以及與這兩類物質(zhì)合成相關(guān)的POD和PAL的酶活。竹醋液處理對(duì)常溫貯藏過(guò)程中砂糖橘果皮總酚含量、總類黃酮含量、PAL酶活和POD酶活的影響見(jiàn)圖4。

圖4 竹醋液處理對(duì)常溫貯藏過(guò)程中砂糖橘果皮總酚含量、總類黃酮含量、PAL酶活和POD酶活的影響Fig.4 The effect of BPA treatements on the total phenolic content，total flavonoid content，PAL activity and POD activity in the‘Shatangju’fruits pericarp during the storage at room temperature

在砂糖橘常溫貯藏過(guò)程中，T1組表現(xiàn)并不出色，因此僅測(cè)定CK、T2和T3組的相關(guān)物質(zhì)。如圖4A所示，測(cè)定常溫貯藏砂糖橘果皮的總酚含量后發(fā)現(xiàn)，T3組在0d時(shí)果皮總酚含量顯著高于CK（6.75mg/g）和T1組（6.01mg/g），為 7.39mg/g（P＜0.05）。但在 10d 時(shí)，CK 組顯著高于T2和T3組。20 d～30 d對(duì)照和處理組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。如圖4B所示，貯藏0～30d期間，T3組總類黃酮含量明顯高于CK和T2組，貯藏第10天時(shí)急劇下降至18.85 mg/g，至第30天又回升至24.22 mg/g，T2組總類黃酮含量在貯藏期間整體有所升高，但各時(shí)期均低于T3組。CK組則整體呈下降趨勢(shì)，30 d時(shí)總類黃酮水平與T2組持平。綜上，竹醋液處理可能增加內(nèi)源酚類和黃酮類物質(zhì)的累積，維持果實(shí)對(duì)病原菌的化學(xué)防御屏障從而達(dá)到保鮮效果。

PAL是苯丙烷類物質(zhì)代謝途徑中的關(guān)鍵酶，與酚類物質(zhì)合成和誘導(dǎo)抗病性有關(guān)[29]。從圖4C可看出，竹醋液處理的砂糖橘在0 d時(shí)PAL活性顯著高于CK組（P＜0.05），第10天時(shí)CK組的PAL活性上升且高于竹醋液處理的兩組砂糖橘，但10 d后CK組的PAL活性急劇下降，而T3組PAL活性在10 d～20 d大幅上升，至第30天一直保持在60.22 U/（g·min）FW，顯著高于CK組的44.56 U/（g·min）FW（P＜0.05），T2組在30 d時(shí)酶活性為54.05 U/（g·min）FW，顯著高于CK組（P＜0.05）。

POD是植物中清除活性氧自由基的重要酶，能夠提高植物抗病能力。在30 d的貯藏時(shí)間內(nèi)，無(wú)論是CK組還是竹醋液處理組的POD活性均呈下降趨勢(shì)，但T2組在0～20 d保持較高的POD活性，到第30天，T3組顯著高于CK組和T2組（圖4D）。陳藝等[19]用竹醋液殼聚糖復(fù)合涂膜處理?xiàng)崭毯螅l(fā)現(xiàn)POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，貯藏期間，處理組的POD活性組明顯高于對(duì)照組。周漢軍等[30]用藍(lán)桉葉精油處理砂糖橘也呈現(xiàn)相似結(jié)果。在本試驗(yàn)中，T2和T3處理組分別在貯藏第20天和第30天高于CK組，但在貯藏前期（0 d和10 d）均低于CK組。以上結(jié)果表明，竹醋液處理可明顯提高砂糖橘果皮總類黃酮積累，維持貯藏期間果皮的PAL和POD活性，這可能是竹醋液處理對(duì)常溫貯藏砂糖橘具有保鮮作用的原因之一。

2.5 竹醋液處理對(duì)指狀青霉接種砂糖橘果皮總酚和總類黃酮含量、POD和PAL酶活的影響

在前述的貯藏試驗(yàn)中，以250 mg/L竹醋液處理接種指狀青霉的砂糖橘效果最佳，因此僅測(cè)定CK和T1組的抗病相關(guān)物質(zhì)。竹醋液處理對(duì)接種指狀青霉砂糖橘果皮總酚含量、總類黃酮含量、PAL活性和POD活性的影響見(jiàn)圖5。

圖5 竹醋液處理對(duì)接種指狀青霉砂糖橘果皮總酚含量、總類黃酮含量、PAL活性和POD活性的影響Fig.5 The effect of BPA treatements on the total phenolic content，total flavonoid content，PAL avtivity and POD activity in the pericarp of‘Shatangju’fruits inoculated with Penicillium digitatum

如圖5A所示，CK組接種和未接種指狀青霉的果皮總酚含量呈下降趨勢(shì)，至48 h時(shí)分別為4.97 mg/g和4.84 mg/g，而T1接種組總酚含量在48 h內(nèi)保持在5.40 mg/g左右，未接種組則是先下降后上升，48 h時(shí)含量顯著高于 CK 未接種組，為 5.46 mg/g（P＜0.05）（圖5A）?？傤慄S酮含量呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，T1組果皮總類黃酮含量在貯藏48h后顯著高于CK組（P＜0.05）（圖5B）。從T1組總酚和總類黃酮含量的變化來(lái)看，竹醋液對(duì)提高砂糖橘對(duì)病害的防御能力有一定作用。付陳梅[31]研究發(fā)現(xiàn)，類黃酮對(duì)微生物的抑制一方面通過(guò)對(duì)微生物的微細(xì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使其生理功能失調(diào)，從而導(dǎo)致菌絲體或者孢子的生長(zhǎng)減緩；另一面參與機(jī)體防御機(jī)制的啟動(dòng)，使次生代謝產(chǎn)物的含量發(fā)生明顯變化，促進(jìn)相關(guān)酶活性的提高或者抗性蛋白的合成等，從而抑制微生物的生長(zhǎng)。檸檬中的類黃酮能短時(shí)間內(nèi)迅速破壞青霉細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整性，并造成大量?jī)?nèi)容物滲出，青霉的分生孢子發(fā)生明顯變形，菌絲也有一定程度變化[32]。

在貯藏48 h期間，T1接種組的PAL活性穩(wěn)定在53.00 U/（g·min）FW，CK接種和T1未接種組呈先下降后升高的趨勢(shì)，CK未接種組的PAL活性則先上升后下降，48 h時(shí)，CK接種組顯著低于其他3組（P＜0.05）（圖5C）。各處理組的POD活性均在貯藏0～24 h時(shí)出現(xiàn)劇烈下降，而貯藏24 h～48 h時(shí)，各處理組的POD活性均升高，CK和T1組中接種指狀青霉的POD活性顯著高于未接種組（P＜0.05）。研究結(jié)果表明，竹醋液本身具有良好的抗氧化性，表現(xiàn)出較好的清除自由基能力[33]。貯藏24 h時(shí)T1兩個(gè)處理組的POD活性顯著低于CK組（P＜0.05），可能是竹醋液在執(zhí)行清除自由基的功能。

以上結(jié)果表明，250 mL/L的竹醋液處理能保持接種指狀青霉砂糖橘較高的PAL活性，PAL活性增強(qiáng)可以使總酚、總類黃酮等抗病性相關(guān)物質(zhì)增加，從而達(dá)到提高抗病性的效果。

2.6 常溫貯藏和指狀青霉接種砂糖橘抗病相關(guān)指標(biāo)和發(fā)病率的相關(guān)性分析

經(jīng)竹醋液處理后，常溫貯藏和指狀青霉接種砂糖橘抗病相關(guān)指標(biāo)和發(fā)病率（傷口侵染率、果實(shí)侵染率和果實(shí)腐爛率統(tǒng)稱為發(fā)病率）的相關(guān)性如圖6所示。

圖6 常溫貯藏和指狀青霉接種砂糖橘抗病相關(guān)指標(biāo)和發(fā)病率的相關(guān)性Fig.6 Correlation between disease resistance indexes and incidence of‘Shatangju’fruits stored at room temperature and inoculated with Penicillium digitatum

如圖6A所示，常溫貯藏的砂糖橘果皮中，PAL活性、POD活性、總酚和總類黃酮含量，與果實(shí)侵染率、果實(shí)腐爛率具潛在負(fù)相關(guān)性，其中POD酶活與果實(shí)侵染率呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；PAL、POD 酶活與總酚和總類黃酮具潛在正相關(guān)性。而接種指狀青霉的砂糖橘果皮中，POD活性、總酚含量與傷口侵染率、果實(shí)腐爛率具潛在負(fù)相關(guān)性；PAL活性、總類黃酮含量與發(fā)病率則具潛在正相關(guān)性（圖6B）。PAL和POD活性等的高低是評(píng)價(jià)植物抗性水平的重要參考標(biāo)準(zhǔn)，其中PAL是合成酚類物質(zhì)的關(guān)鍵酶之一，POD則可以催化酚類物質(zhì)的前體聚合成木質(zhì)素，加固細(xì)胞壁，以此來(lái)抵御病害[34]。在常溫貯藏的砂糖橘果皮中，這兩種酶的酶活均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，抗病相關(guān)物質(zhì)總酚和總類黃酮的合成也隨之減少，這可能是貯藏后期（20 d以后）發(fā)病率急劇升高的原因。而接種指狀青霉的砂糖橘果皮中只有POD、總酚與發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這意味著砂糖橘受到青霉菌侵染時(shí)，POD和總酚在果皮中作為主要抗病物質(zhì)，其作用比PAL和總類黃酮更直接有效。竹醋液可能促進(jìn)了砂糖橘果皮中抗病相關(guān)物質(zhì)的合成或抑制其降解，提高砂糖橘的抗病能力，從而起到保鮮作用。

3 結(jié)論

50、150 mL/L竹醋液處理常溫貯藏砂糖橘后，降低了果實(shí)侵染率和果實(shí)腐爛率，150 mL/L竹醋液處理效果更佳；50 mL/L竹醋液處理顯著提高了果皮總類黃酮含量（P＜0.05），使砂糖橘果皮在貯藏期間保持較高的PAL和POD活性；150 mL/L竹醋液對(duì)總酚含量無(wú)明顯影響，提高了10 d～20 d總類黃酮含量、砂糖橘貯藏期間PAL活性、0～10 d的POD活性。50、150 mL/L竹醋液降低了機(jī)械傷砂糖橘的果實(shí)腐爛率，減緩腐爛速度。250 mL/L竹醋液處理對(duì)于降低接種指狀青霉的砂糖橘5 d內(nèi)的果實(shí)腐爛率和病斑直徑有一定作用。接種后，相比對(duì)照，250 mL/L竹醋液處理提高了48 h接種點(diǎn)的總酚含量、總類黃酮含量、PAL活性，但對(duì)POD活性沒(méi)有明顯影響，提高了未接種組的總類黃酮含量。抗病指標(biāo)（PAL、POD、總酚和總類黃酮）和發(fā)病率的相關(guān)性分析結(jié)果說(shuō)明，砂糖橘受到青霉菌侵染時(shí)，POD和總酚的抗病作用對(duì)比PAL和總類黃酮更直接有效，竹醋液的使用可以促進(jìn)抗病物質(zhì)的合成或抑制其降解。以上結(jié)果表明，常溫貯藏砂糖橘時(shí)推薦以150 mL/L竹醋液進(jìn)行處理，其對(duì)無(wú)傷和機(jī)械損傷的果實(shí)均可取得較好的防腐保鮮效果，而對(duì)于青霉菌侵染風(fēng)險(xiǎn)較高的貯藏環(huán)境，則推薦以250 mL/L竹醋液對(duì)砂糖橘進(jìn)行處理。