李春花，王有為，羅才會(huì)，李雪茹，田詠梅

電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院/四川省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，四川成都 610072

人乳頭瘤病毒(HPV)是尖銳濕疣的病原體，尖銳濕疣是以生殖器部位皮膚黏膜的良性增生性損傷為主的一種性傳播疾病，其復(fù)發(fā)率及傳染性強(qiáng)，居國(guó)內(nèi)性傳播疾病的第二位[1]。高危型HPV感染與陰莖癌[2-3]、宮頸癌[4-6]、口咽鱗狀細(xì)胞癌[7-8]等發(fā)病密切相關(guān)。因此HPV的檢測(cè)，特別是HPV-DNA分型檢測(cè)對(duì)疾病的預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)與治療有重要意義[9-11]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HPV亞型的分布因地區(qū)不同而有所區(qū)別，感染與致病力因亞型的不同而有所差異[12-15]。為了解成都地區(qū)HPV的流行特征，比較四價(jià)與九價(jià)HPV疫苗對(duì)其覆蓋率的差異,本研究對(duì)2018年1月至2019年6月于本院皮膚性病門(mén)診就診患者的HPV感染情況進(jìn)行分析，并進(jìn)一步研究了HPV21型基因分型特征，為HPV相關(guān)疾病的防治提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2019年6月于本院皮膚性病門(mén)診進(jìn)行HPV檢測(cè)且未接種過(guò)HPV疫苗,近3個(gè)月內(nèi)未接受系統(tǒng)或局部免疫治療，未局部使用抗病毒藥物治療的16～80歲初診患者3 303例，平均年齡33.7歲。所有患者均自愿進(jìn)行HPV基因型別檢測(cè)，并簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑 HPV分型檢測(cè)試劑盒(廣東凱普生物科技有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(廣州達(dá)安基因科技有限公司)、核酸分子快速雜交儀(廣東凱普生物科技有限公司)、恒溫金屬浴(杭州博日公司)、高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本的采集與保存 先用消毒棉簽拭去皮損表面分泌物，以專用脫落細(xì)胞采集器采樣，采取皮損組織液及脫落細(xì)胞,將其放入裝有細(xì)胞保存液的標(biāo)本管中，在管口處將多余的刷柄折斷，將刷頭留在標(biāo)本管中，旋緊管蓋，于4 ℃保存，并在3 d內(nèi)檢測(cè)。

1.3.2病毒DNA的提取 將采有標(biāo)本的細(xì)胞保存液管振蕩混勻，取0.8 mL到EP管中，12 000 r/min離心5 min，去上清液，加入400 μL溶液Ⅰ，混勻，100 ℃裂解15 min,加入400 μL溶液Ⅱ,混勻，放置5 min,12 000 r/min離心5 min，去上清液,12 000 r/min離心1 min，再次去上清液，加入60 μL溶液Ⅲ充分溶解提取DNA。

1.3.3導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測(cè)HPV-DNA 將提取的DNA用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物25 μL在95 ℃變性5 min后立即冰浴2 min，再與導(dǎo)流雜交儀含DNA單鏈探針膜條上0.5 mL的預(yù)熱至45 ℃的雜交緩沖液混合孵育15 min，然后進(jìn)行導(dǎo)流雜交。雜交后再用0.8 mL雜交緩沖液清洗3次，在25 ℃條件下，用封阻液封阻孵育5 min后，加入0.5 mL酶標(biāo)液孵育3.5 min，用沖洗緩沖液A清洗雜交膜，去除未結(jié)合的酶標(biāo)液。顯色過(guò)程加入0.5 mL NBT/BCIP底物在36 ℃保持3～5 min,顯色后1 h內(nèi)分析結(jié)果，包括15種高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型)，6種低危型(6、11、42、43、44、CP8304型)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定性資料采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HPV感染模式的性別構(gòu)成 在3 303例檢測(cè)標(biāo)本中，男2 101例、女1 202例，共檢出HPV陽(yáng)性1 802例，檢出率為54.56%。HPV檢出率在男性和女性就診者中分別為53.26%(1 119/2 101)和56.82%(683/1 202)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.912,P=0.048)。單一基因型感染中男性感染低危型較女性感染比例高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.138,P<0.001)；多重基因型感染中，男女性均以低危型合并高危型感染為主，且女性多重基因型合并感染高于男性，兩者比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.753,P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 HPV感染模式在不同性別患者中構(gòu)成[n(%)]

2.2HPV感染模式分析 在1 802例HPV陽(yáng)性檢出者中，HPV 21種常見(jiàn)基因型的每個(gè)基因型都有檢出，不同基因型檢出比例見(jiàn)圖1。感染模式及構(gòu)成情況見(jiàn)表2。單一基因型感染主要以6、11、16、52、58型為主；多重感染模式中二重感染以6/11、6/16、6/52、6/58型為主，3重感染以11/16/52、6/39/52、6/51/CP8304型為主，4～7重感染中各型別均為散在隨機(jī)分布，分別為67、34、15、6例；其中，四重感染中除了有5例基因型別是高危型+高危型組合外，其余4～7重感染均為低危型+高危型組合。

圖1 HPV陽(yáng)性檢出者基因型別分布情況

表2 HPV陽(yáng)性檢出者感染模式和基因型別分布基本情況(n=1 802)

續(xù)表2 HPV陽(yáng)性檢出者感染模式和基因型別分布基本情況(n=1 802)

2.3HPV感染模式的年齡組構(gòu)成 將3 303例患者分為6個(gè)年齡組，分別為<20歲，20～29歲，>29～39歲，>39～49歲，>49～59歲，>59歲,各年齡組HPV檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.937,P=0.024)。除<20歲和>59歲組以多重基因型感染為主，其余各組以單基因低危型感染為主；各年齡組多重基因型感染檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(χ2=41.006,P<0.001)，其中>59歲年齡組的多重基因型感染檢出率明顯高于其他年齡組。見(jiàn)圖2和表3。

表3 HPV感染模式在不同年齡組患者中構(gòu)成[n(%)]

圖2 HPV感染不同年齡組檢出率的變化趨勢(shì)

2.4四價(jià)及九價(jià)HPV疫苗覆蓋率假設(shè) 假設(shè)本研究對(duì)象在感染HPV前預(yù)先接種HPV疫苗，則本研究納入的1 802例HPV感染者中能被四價(jià)疫苗(HPV6/11/16/18型)和九價(jià)疫苗(HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58型)完全覆蓋例數(shù)分別為936例(51.94%)和1 165例(64.65%),兩種疫苗的有效覆蓋率經(jīng)χ2檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=59.851,P<0.001)。

3 討 論

HPV是一種結(jié)構(gòu)為雙鏈閉合環(huán)狀小分子DNA病毒，無(wú)包膜，屬于多孔病毒科乳頭瘤病毒屬。其感染有種屬特異性特點(diǎn)，主要針對(duì)人的皮膚或黏膜上皮細(xì)胞，可導(dǎo)致尖銳濕疣以及宮頸病變，其中高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要因素[5,9-11,16-18]。本研究3 303例皮膚性病門(mén)診患者的HPV感染檢出率為54.56%，明顯高于國(guó)外報(bào)道的6.60%～45.20%[12,19-20]，原因可能是皮膚性病門(mén)診的多數(shù)患者為有癥狀而來(lái)就診，或因性伴感染而來(lái)體檢。本研究中單一的低危型感染檢出率較高的是6型和11型，高危型感染檢出率前5名的有16、52、58、39、51型，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的尖銳濕疣患者的HPV亞型分布相似[12,21-23]。本研究顯示多重合并感染形式有低-低危型、低-高危型和高-高危型三種，以二重低-高危型組合形式感染檢出最多。

據(jù)本研究顯示，HPV感染與患者性別因素關(guān)系非常密切，女性感染檢出率明顯高于男性，這與相關(guān)研究在2007年和2019年的研究報(bào)道一致[24-25]。在感染型別上，男性感染型別主要為6、11型等低危型，而女性感染型別主要為16、52、58型等高危型。男女HPV多重感染結(jié)果顯示，女性多重感染檢出比例明顯高于男性，而且女性比男性更容易感染多重高危型HPV，這一結(jié)果與張琰等[21]、LI等[23]對(duì)尖銳濕疣患者的流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果相似。

據(jù)國(guó)外報(bào)道，HPV感染檢出率隨年齡分布呈“中間低兩頭高”的U型分布，感染檢出率最低為40～49歲，兩個(gè)感染高峰分別為18～29歲和70～79歲[6]；本研究顯示感染檢出率最低為30～39歲，第1個(gè)感染高峰為<20歲，都比國(guó)外感染高峰提前了10歲左右，與國(guó)外研究稍有差異。<20歲和>59歲年齡組的感染檢出率高于其他年齡組，可見(jiàn)本地區(qū)HPV的感染偏向年輕化和老齡化；<20歲患者性生活活躍以及性伴不固定，但生殖系統(tǒng)免疫相對(duì)不夠成熟，易受HPV感染，而>59歲患者不安全性行為以及絕經(jīng)期后女性免疫力下降、各項(xiàng)激素水平分泌較低、自身清除HPV能力降低等原因易受HPV感染[5,26]，可見(jiàn)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)HPV感染的宣傳教育、管理和干預(yù)。

大量研究表明，HPV感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，90%以上的宮頸癌患者有HPV感染[4-6，27]。HPV預(yù)防性疫苗主要以具有天然空間結(jié)構(gòu)的合成L1晚期蛋白病毒樣顆粒(VLP)作為主要靶抗原[28]。本研究顯示九價(jià)HPV疫苗對(duì)研究人群的有效覆蓋率更高，這與成媛媛等[29]的研究結(jié)果一致，提示九價(jià)HPV疫苗可能對(duì)本地區(qū)HPV感染高危人群免疫預(yù)防保護(hù)效果更好。因此，除適齡女性應(yīng)接種HPV疫苗外，給男性也接種該疫苗將減少其HPV感染，降低其罹患HPV相關(guān)惡性病變的風(fēng)險(xiǎn)。

本地區(qū)HPV感染以單基因亞型為主，低危型以6、11型多見(jiàn),高危型以16、52、58型多見(jiàn)；九價(jià)HPV疫苗可能比四價(jià)疫苗對(duì)HPV感染人群免疫預(yù)防保護(hù)效果更好。分析HPV感染基因型分布對(duì)HPV疫苗的開(kāi)發(fā)應(yīng)用和防治效果的評(píng)估以及預(yù)測(cè)不典型鱗狀細(xì)胞、高危型HPV陽(yáng)性而細(xì)胞學(xué)檢查陰性的患者罹患HPV相關(guān)惡性病變的風(fēng)險(xiǎn)具有參考價(jià)值。