趙建越，孫 宇，顧李霖，王會(huì)中

中國(guó)人民解放軍第三〇五醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100017

高尿酸血癥是臨床上一種常見的疾病，高尿酸一旦形成晶體并沉積就會(huì)誘發(fā)局部炎癥反應(yīng)和組織破壞，即形成痛風(fēng)。高尿酸血癥的形成原因比較復(fù)雜，且患病率呈逐年增加并出現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)[1-2]。目前有研究表明，高尿酸血癥和痛風(fēng)是慢性腎病、高血壓、心腦血管疾病及糖尿病等疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是引起死亡的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[3-4]，因此高尿酸血癥逐漸引起相關(guān)學(xué)科的高度重視。尿酸是一種關(guān)鍵性的促炎因子，隨著尿酸濃度的增高其能夠抑制細(xì)胞增殖、衰老甚至凋亡，尿酸還能夠?qū)€粒體DNA和三磷酸腺苷(ATP)合成造成影響[5-7]。線粒體是細(xì)胞中的重要細(xì)胞器之一，是細(xì)胞內(nèi)最重要的生物能量轉(zhuǎn)化裝置，在線粒體內(nèi)依靠電子傳遞和質(zhì)子漏來控制ATP的產(chǎn)生。線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)作為解偶聯(lián)蛋白家族中重要成員是線粒體內(nèi)重要的跨膜蛋白，且與質(zhì)子調(diào)控高度關(guān)聯(lián)，是線粒體內(nèi)電化學(xué)梯度的重要調(diào)節(jié)蛋白，研究表明UCP2能調(diào)節(jié)線粒體損傷指標(biāo)活性氧(ROS)的生成，調(diào)控ATP的合成和線粒體膜電位差等來調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激能力[8-9]。尿酸特別是高尿酸作為一種促氧劑能夠?qū)?xì)胞以及線粒體造成損傷[10]，但目前高尿酸對(duì)線粒體UCP2及其相關(guān)指標(biāo)的影響研究較少，尿酸對(duì)線粒體損傷的生理功能還尚未清晰，尿酸對(duì)線粒體內(nèi)環(huán)境以及線粒體內(nèi)能量轉(zhuǎn)化等的影響問題還尚待解決，因此還有許多基礎(chǔ)工作要做。本文則在細(xì)胞水平上分析了高尿酸對(duì)細(xì)胞線粒體損傷，分析了UCP2表達(dá)水平變化及尿酸對(duì)UCP2相關(guān)指標(biāo)ROS、線粒體膜電位、ATP合成的影響，初步探討高尿酸對(duì)細(xì)胞線粒體損傷的可能機(jī)制，為深入研究尿酸對(duì)線粒體損傷原理提供相關(guān)支持，并通過這些分析為高尿酸血癥的臨床控制和治療提供可能的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)采用HL7702細(xì)胞，為健康者肝源細(xì)胞，購(gòu)自上海富衡生物有限公司。

1.2儀器與試劑 噻唑藍(lán)(MTT)、尿酸試劑由sigma公司生產(chǎn)并根據(jù)使用說明書進(jìn)行所需濃度配制；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640由HyClone (SH30809.01)公司生產(chǎn)；胎牛血清由美國(guó)GIBCO(10270-106)公司生產(chǎn)；總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司(00266)；所需引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成； FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒從天根生化科技(北京)有限公司購(gòu)買(KR118-02)；Real-time PCR試劑盒從北京全式金生物有限公司購(gòu)買(AQ131-01)；Western blot蛋白裂解液從上海碧云天生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(P0013)；UCP2一抗從Proteintech Group公司購(gòu)買(11081-1-AP)；GAPDH一抗(BM1623)、二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(A0208)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216))從上海碧云天生物技術(shù)有限公司購(gòu)買；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)從索萊寶科技有限公司購(gòu)買(中國(guó)，M8650)；ROS檢測(cè)熒光探針-DHE(二氫乙錠)從江蘇凱基生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(KGAF019)；ATP水平檢測(cè)試劑盒從北京索萊寶科技有限公司購(gòu)買(BC0305)，所有試劑均在效期內(nèi)。 ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)儀(ThermoFisher,美國(guó))；酶標(biāo)儀(Thermo，型號(hào)：MULTISKAN FC，美國(guó))；生物熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS(IX71)，德國(guó))；所有儀器均經(jīng)過校準(zhǔn)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) HL7702細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在恒溫培養(yǎng)箱中以5% CO2、37 ℃以及飽和濕度條件下松蓋培養(yǎng)，每1～2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿80%培養(yǎng)瓶時(shí)再消化傳代。

1.3.2MTT實(shí)驗(yàn)篩選尿酸作用時(shí)間 實(shí)驗(yàn)分為3組，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每組依據(jù)參考文獻(xiàn)加入終濃度分別為400、800、1 200 μmol/L的尿酸作用細(xì)胞，對(duì)照組加等量的生理鹽水，對(duì)不同時(shí)間分組細(xì)胞加入100 μL 10% MTT反應(yīng)液，酶標(biāo)儀測(cè)定在595 nm處的吸光度，分析細(xì)胞活性確定培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.3Q-PCR法比較UCP2的mRNA表達(dá)水平 采用TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用20 μL Q-PCR反應(yīng)體系[引物各0.4 μL，2×supermix(預(yù)混液)10 μL，PASSIVE DYE(參比染料) 0.4 μL,模板 2 μL，水 6.8 μL]，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，比較HL7702細(xì)胞UCP2的mRNA表達(dá)差異，引物見表1。內(nèi)參及UCP2引物大小均為20 bp。

表1 UCP2和內(nèi)參GAPDH的引物序列(5′-3′)

1.3.4Western blot檢測(cè)HL7702細(xì)胞UCP2水平 離心收集細(xì)胞，每份樣品加150 μL裂解液，于冰上裂解45 min，并輕搖細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞充分裂解，4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。分別取100 μg不同尿酸濃度處理的細(xì)胞總蛋白，用SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，于5%脫脂奶粉的封閉液(TBST)封閉2 h，再用UCP2和GAPDH一抗4 ℃過夜，洗去多余一抗，二抗37 ℃ 2 h，洗去多余二抗，電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色分析結(jié)果。

1.3.5免疫熒光法檢測(cè)ROS生成 以二甲基亞砜(DMSO)溶解DHE為 5 mmol/L 的溶液，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入1 mL稀釋好的DHE，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20～30 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DHE，孵育結(jié)束后，用新鮮培養(yǎng)液清洗細(xì)胞，熒光顯微鏡進(jìn)行熒光拍照，通過熒光強(qiáng)度對(duì)ROS生成量進(jìn)行評(píng)估。

1.3.6JC-1熒光探針法檢測(cè)線粒體膜電位 按要求配置好染色工作液，細(xì)胞中加入 1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min，孵育結(jié)束后，吸除上清，用 JC-1 染色緩沖液(1×)洗滌2次，加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.7ATP水平檢測(cè) 按試劑盒要求進(jìn)行ATP的提取，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為340 nm測(cè)定吸光度，根據(jù)試劑盒參考共識(shí)進(jìn)行ATP水平的數(shù)據(jù)測(cè)算。

2 結(jié) 果

2.1MTT法篩選尿酸作用細(xì)胞時(shí)間 從圖1可見細(xì)胞培養(yǎng)72 h后不同濃度尿酸的MTT吸光度值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此選取72 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。圖1 MTT實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果圖

2.2細(xì)胞UCP2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及UCP2蛋白表達(dá)水平數(shù)據(jù)分析 不同濃度尿酸處理后UCP2 mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)，3個(gè)濃度組(400、800、1 200 μmol/L)細(xì)胞的UCP2mRNA轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比均呈現(xiàn)出明顯下降趨勢(shì)，分別占對(duì)照組的46.30%、16.40%和5.00%。同時(shí)，UCP2蛋白表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，UCP2的蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比均呈現(xiàn)出明顯下降趨勢(shì)，且隨著尿酸濃度的增加呈逐漸遞減趨勢(shì)。

注：**表示P<0.01。圖2 不同濃度尿酸處理的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，線粒體UCP2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

圖3 不同濃度尿酸處理的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，線粒體UCP2的蛋白表達(dá)結(jié)果

2.3細(xì)胞線粒體ROS生成量的分析 與對(duì)照組相比,3個(gè)濃度組(400、800、1 200 μmol/L)的ROS熒光強(qiáng)度分別為對(duì)照組的133倍、184倍和253倍(圖4、圖5)，細(xì)胞線粒體中ROS的生成量呈逐漸升高狀態(tài)。

注：熒光越強(qiáng)說明ROS生成量越大，**表示P<0.01。圖4 不同濃度尿酸處理的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度量化分析圖

注：隨著尿酸濃度增加熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，ROS生成量越多。圖5 不同濃度尿酸處理的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞ROS熒光顯示圖

2.4細(xì)胞線粒體膜電位的變化分析 與對(duì)照組相比，3個(gè)濃度組(400、800、1 200 μmol/L)線粒體膜電位分別為對(duì)照組的14.53%、8.30%和4.70% (圖6、圖7)，細(xì)胞線粒體中線粒體膜電位呈逐漸降低趨勢(shì)，說明高尿酸對(duì)線粒體UCP2抑制作用會(huì)造成線粒體膜電位的降低，即降低線粒體基質(zhì)與內(nèi)膜間的電位差。

注：**表示P<0.01。圖6 不同濃度尿酸處理的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，尿酸對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響變化圖

注：隨著尿酸濃度增加綠色熒光強(qiáng)度越強(qiáng),線粒體膜電位越低。圖7不同濃度尿酸處理的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞綠色熒光示意圖

2.5ATP水平檢測(cè)分析 與對(duì)照組相比，3個(gè)濃度組(400、800、1 200 μmol/L)ATP合成率為對(duì)照組的83.45%、69.92%和55.64%，隨著尿酸的濃度增加而ATP水平逐漸減少。見圖8。

注：**表示P<0.01。圖8不同濃度尿酸處理的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，ATP水平變化圖

3 討 論

近年來高尿酸血癥發(fā)病率逐年升高，尿酸的高低與否已經(jīng)成為備受重視的一項(xiàng)指標(biāo)，而隨著尿酸濃度的逐漸升高細(xì)胞內(nèi)特別是線粒體內(nèi)則發(fā)生著氧化應(yīng)激和慢性炎癥等一系列的反應(yīng)[6]。氧化應(yīng)激是細(xì)胞氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡，是氧化自由基和ROS過度產(chǎn)生的結(jié)果[10-11]。而高尿酸作為一種促氧化劑在多個(gè)細(xì)胞和動(dòng)物模型中被證實(shí)能夠引起局部炎癥和氧化應(yīng)激，能夠造成ROS的增加并抑制細(xì)胞增殖和影響細(xì)胞形態(tài)甚至是促進(jìn)細(xì)胞走向凋亡[10,12]。線粒體內(nèi)膜蛋白UCP2是UCP家族中的重要一員，它與電子傳遞中的質(zhì)子泄露相關(guān)聯(lián)，能夠通過調(diào)控質(zhì)子泄露來影響細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，并影響電子傳遞鏈的過程中的ROS的生成、線粒體膜電位的變化和ATP的合成[8,13-14]。而在目前的研究中發(fā)現(xiàn)，UCP2蛋白表達(dá)水平與多種疾病相關(guān)如肥胖、糖尿病、心臟疾病和高血壓等，并在這些疾病中起到調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激壓力的作用[15-18]。有研究發(fā)現(xiàn)UCP2能夠降低ROS的產(chǎn)生起到保護(hù)細(xì)胞的作用[11,17-18]，如一些關(guān)于慢性高糖的相關(guān)研究中就證實(shí)UCP2是能夠降低ROS的產(chǎn)生，這可能是由于葡萄糖為細(xì)胞所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，葡萄糖會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖從而導(dǎo)致UCP2過表達(dá)。但這些研究都是以糖類和脂類代謝為基礎(chǔ)進(jìn)行研究，并未將尿酸作為一個(gè)獨(dú)立因素進(jìn)行研究。特別是在近年來高尿酸血癥越來越年輕化的趨勢(shì)下，將尿酸特別是高尿酸作為一個(gè)影響身體健康的指標(biāo)來研究具有一定的指導(dǎo)意義，因此研究尿酸對(duì)體內(nèi)細(xì)胞的損傷機(jī)制將成為一個(gè)重要課題。

線粒體UCP2是細(xì)胞內(nèi)與能量代謝相關(guān)的重要蛋白，是控制線粒體膜間隙與基質(zhì)之間電勢(shì)的關(guān)鍵性蛋白，因此研究尿酸對(duì)UCP2的影響將關(guān)系著整個(gè)細(xì)胞的能量代謝和生命活動(dòng)。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同濃度尿酸處理72 h后，細(xì)胞中線粒體UCP2蛋白表達(dá)呈明顯降低趨勢(shì)；線粒體UCP2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別為對(duì)照組的46.30%、16.40%和5.00%，這說明尿濃度越高對(duì)線粒體UCP2的表達(dá)抑制越強(qiáng)。而且本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同濃度尿酸處理72 h后線粒體膜電位分別為對(duì)照組的14.53%、8.30%和4.70%；ATP合成率分別為對(duì)照組的83.45%、69.92%和55.64%。由于線粒體UCP2表達(dá)減少則會(huì)造成線粒體膜間隙與基質(zhì)之間質(zhì)子梯度變小，結(jié)果會(huì)降低線粒體內(nèi)膜內(nèi)外的電勢(shì)，而膜電位的降低則會(huì)造成ATP合成的減少，而且從結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)尿酸濃度越高則對(duì)線粒體UCP2的影響就越大，對(duì)線粒體UCP2影響越大則線粒體膜電位和ATP合成率就越低,可見尿酸的濃度與線粒體UCP2表達(dá)、膜電位和ATP合成呈負(fù)相關(guān)，且上述結(jié)果說明尿酸特別是濃度越高的尿酸對(duì)線粒體UCP2的影響越大，對(duì)線粒體的損傷就越大。在另一項(xiàng)線粒體UCP2的相關(guān)評(píng)估指標(biāo)ROS中，則是隨著尿酸濃度增加，3個(gè)濃度尿酸處理細(xì)胞的ROS熒光強(qiáng)度分別為對(duì)照組的133、184和253倍，呈逐漸升高的趨勢(shì)，這說明隨著尿酸濃度的逐漸升高，尿酸抑制了UCP2的生成進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，而不是起到促進(jìn)UCP2過表達(dá)降低ROS的作用，這與高糖高脂等可能促進(jìn)UCP2過表達(dá)而降低ROS的研究產(chǎn)生了不一致的結(jié)果，而且隨著尿酸濃度的升高ROS生成就越多，對(duì)線粒體損傷性就越大，這說明高尿酸對(duì)細(xì)胞的損傷可能是一種不可逆性的損傷。從上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及結(jié)合其他研究成果，可以得到以下結(jié)論：高尿酸對(duì)線粒體UCP2的表達(dá)可能存在著抑制作用，高尿酸對(duì)細(xì)胞的損傷作用可能的機(jī)制之一就是高尿酸對(duì)線粒體UCP2的損傷，進(jìn)而造成膜電位的降低、ATP合成的減少以及ROS的大量產(chǎn)生并最終引起線粒體和細(xì)胞的損傷。如果能夠切斷或者減少高尿酸對(duì)UCP2的表達(dá)抑制就可能會(huì)對(duì)高尿酸血癥的治療起到更好的協(xié)同作用。但本實(shí)驗(yàn)主要是在細(xì)胞水平上進(jìn)行初步的分析，還缺少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面的數(shù)據(jù)來支持，在下一步的實(shí)驗(yàn)中將更加細(xì)致的分析高尿酸在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)線粒體UCP2的影響，分析高尿酸對(duì)線粒體以及線粒體內(nèi)微生態(tài)的損傷機(jī)制。

綜上所述，本文著重研究了尿酸在不同濃度情況下對(duì)線粒體UCP2蛋白表達(dá)的影響，初步闡述了高尿酸對(duì)線粒體UCP2相關(guān)聯(lián)的ROS的生成、線粒體膜電位的變化和ATP的合成在不同濃度下的影響程度，初步驗(yàn)證了高尿酸對(duì)細(xì)胞損傷的可能的機(jī)制之一即對(duì)細(xì)胞線粒體UCP2蛋白表達(dá)的抑制作用，并為進(jìn)一步研究高尿酸對(duì)細(xì)胞中線粒體損傷機(jī)制提供了理論支持。本研究還發(fā)現(xiàn)隨著尿酸濃度的增高，尿酸對(duì)細(xì)胞的危害就越大，這就提示人體內(nèi)也可能存在著類似情況，而且長(zhǎng)時(shí)間的高尿酸不被重視后還可能和高血壓、高血糖、高血脂、心肌炎、動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)疾病相互作用。因此，高尿酸必須要引起重視，特別是一些年輕患者，早發(fā)現(xiàn)、早控制、早治療是應(yīng)對(duì)高尿酸的最正確的選擇。