秦薈鈞，王樹急 綜述，段曉雷，2△ 審校

1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000

微小RNA(miRNA)是一類長度約21～23 nt的短鏈非編碼RNA分子，其通過與靶向mRNA結(jié)合在基因沉默和翻譯表達(dá)中發(fā)揮作用，在基因表達(dá)調(diào)控中以及廣泛的生理、病理過程中具有重要的功能[1]。有研究表明，miRNA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。因此，在腫瘤等疾病的早期篩查中檢測特異性miRNA具有重要的臨床意義。但是由于在發(fā)病早期或預(yù)后階段血液中某種miRNA水平極低[3]，因此臨床診斷miRNA需要高度靈敏的檢測方法。目前miRNA常見的檢測方法主要包括探針雜交與擴(kuò)增技術(shù)，前者包括Northern印跡技術(shù)、微陣列芯片技術(shù)等[4]，后者有實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)、測序技術(shù)等[5]。但是由于實(shí)驗(yàn)中放射性元素的使用，臨床樣品對聚合酶的抑制作用，以及所需的設(shè)備和試劑成本高等相關(guān)問題，導(dǎo)致傳統(tǒng)的miRNA檢測方法在靈敏度和特異度方面存在一定局限；而目前芯片技術(shù)雖能實(shí)現(xiàn)快速、高通量的檢測，但其缺點(diǎn)是重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差[6]，所以研發(fā)出高靈敏、高特異檢測miRNA的新方法尤為重要。

近幾年來，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)發(fā)展迅速，主要包括滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)[7]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)[8]、催化發(fā)夾自組裝(CHA)[9]等，可以有效對靶標(biāo)核酸分子進(jìn)行信號放大；其中，基于雙鏈特異性核酸酶(DSN)水解反應(yīng)的信號放大策略是一類比較特殊的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其具有僅水解DNA-RNA雜交鏈中DNA的特點(diǎn)[10]。DSN是一種降解雙鏈核酸中DNA鏈的蛋白酶，其作為非特異性DNA/RNA內(nèi)切酶家族中的一員，其表現(xiàn)出獨(dú)特的底物選擇性[11]，DSN僅水解dsDNA或DNA-RNA雜交鏈中DNA，對單鏈DNA或RNA不裂解，且與核苷酸序列無關(guān)[10]，非常適宜檢測RNA類靶標(biāo)分子。近年來，DSN水解反應(yīng)被作為一種新的信號放大策略正在被逐漸廣泛用于miRNA的高靈敏度檢測中，基于DSN水解反應(yīng)特性對靶標(biāo)分子miRNA實(shí)現(xiàn)循環(huán)再利用，促使微量的miRNA觸發(fā)大量“信號分子”的釋放，從而顯著提高了檢測方法的靈敏度[12]。本文著重分析與歸納了DSN介導(dǎo)的比色傳感器、熒光傳感器、電化學(xué)與電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測miRNA的方法學(xué)研究進(jìn)展，幫助醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作者認(rèn)識此類新興技術(shù)在本領(lǐng)域的最新發(fā)展。同時(shí)還討論了基于DSN水解放大效應(yīng)檢測miRNA新方法研究所面臨的挑戰(zhàn)及在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用中的巨大前景。

1 DSN介導(dǎo)的比色傳感器檢測miRNA

比色測定法為miRNA的檢測提供了快速便捷的選擇，其無需任何先進(jìn)的儀器，甚至可以用肉眼觀察結(jié)果[13]。在2012年，TIAN等[14]最早成功設(shè)計(jì)出基于DSN的miRNA靈敏且便捷的比色檢測新方法。該方法主要是通過DSN水解DNA探針-miRNA雜交鏈中DNA部分，使miRNA循環(huán)利用，而DNA剩余部分形成G-四鏈體(單鏈富含G序列)與血紅素結(jié)合具有過氧化物酶活性，從而使2,2-疊氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS2-)氧化，與H2O2反應(yīng)引起底物顏色變化[15]。該傳感器的優(yōu)點(diǎn)是無需昂貴的設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)分子的裸眼檢測，并且在該系統(tǒng)中，無需標(biāo)記探針就可以有效放大檢測信號?；谄錂z測優(yōu)點(diǎn)，該方法可被開發(fā)成商業(yè)試劑盒，并用于實(shí)際樣品分析。因此，其檢測潛力非?？捎^。

為了進(jìn)一步構(gòu)建靈敏度高與方便快捷的新型miRNA比色檢測技術(shù)，王奎宇等[16]將DSN與CHA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合研發(fā)出一種雙重放大信號的方法。該實(shí)驗(yàn)以試紙條作為信號輸出方式用于miRNA的檢測，DSN循環(huán)反應(yīng)酶切釋放CHA的啟動序列并引發(fā)CHA反應(yīng)，最終的產(chǎn)物可以在試紙條檢測線上出現(xiàn)紅線。該實(shí)驗(yàn)的最低檢測限可達(dá)7.66 pmol/L，且能夠區(qū)分單堿基序列；這種體系以試紙條作為穩(wěn)定、低廉的信號輸出方式，且無需昂貴的染料標(biāo)記物，在今后miRNA的臨床診斷領(lǐng)域中提供了全新的檢測手段。

最近，CHOI等[17]開發(fā)了一種短時(shí)間(30 min)內(nèi)快速檢測靶標(biāo)miRNA的比色方法，這種檢測miRNA的高效診斷工具是基于nPfu DNA聚合酶[18]進(jìn)行引物延伸來進(jìn)行比色測定。該方法采用Cu2+螯合pp探針(焦磷酸鹽傳感探針)來識別引物延伸過程中產(chǎn)生焦磷酸鹽，然后Cu2+和焦磷酸鹽形成的復(fù)合物會從探針中去除Cu2+，從而導(dǎo)致顏色的變化[19]。這種巧妙的發(fā)夾結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的診斷方法可以通過焦磷酸鹽的傳感實(shí)現(xiàn)非常簡單和快速的miRNA比色檢測；該傳感器的優(yōu)點(diǎn)在于整個(gè)檢測過程僅需要30 min，并且其在人血清中的miRNA檢測限較低，可進(jìn)一步發(fā)展為床旁即時(shí)檢測(POCT)。上述這些比色傳感新方法都清晰的表明，DSN介導(dǎo)的比色傳感器檢測miRNA新方法正在逐步滿足診斷的重要要求：快速、高靈敏度、即時(shí)檢測，在臨床應(yīng)用中顯示出廣闊前景。

2 DSN介導(dǎo)的熒光傳感器檢測miRNA

由于熒光傳感器具有靈活簡便、檢測限低和易于操作等特點(diǎn)，因此在各種靶標(biāo)分子的檢測方法學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。然而，靶標(biāo)miRNA通常處于低豐度狀態(tài)，常規(guī)的熒光檢測無法定量檢測出低濃度的miRNA(特別是在臨床標(biāo)本中)，限制了熒光技術(shù)在低濃度miRNA檢測領(lǐng)域的發(fā)展。近年來，基于DSN水解反應(yīng)的miRNA信號放大策略很好地解決了上述困境，DSN水解miRNA-DNA雜交雙鏈中的DNA部分，miRNA解離后可循環(huán)利用，將微量miRNA信號轉(zhuǎn)變?yōu)榇罅康腄NA信號，再結(jié)合熒光技術(shù)的優(yōu)勢，可以很好地改善低濃度miRNA檢測效果。為了設(shè)計(jì)出一種新型恒溫信號放大方法用于miRNA的高靈敏度檢測，李曉利等[20]將氧化石墨烯(GO)與DSN水解放大效應(yīng)相結(jié)合。由于DSN可以水解雙鏈中的DNA而不降解miRNA，GO對酶切產(chǎn)生的DNA碎片吸附能力顯著降低，使得熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離GO表面而不被淬滅，通過DSN的不斷酶切作用，熒光信號可以得到顯著放大。該方法的優(yōu)點(diǎn)是直接方便、靈敏度高，而且全程在恒溫下進(jìn)行，因此技術(shù)上易于實(shí)施。

除了結(jié)合使用常規(guī)的納米材料作為檢測miRNA外，PENG等[21]還設(shè)計(jì)了一種通過DSN輔助裂解熒光信號，再利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)靈敏、特異性地檢測出多種miRNA。帶有熒光納米球(FS)的單鏈DNA(ssDNA)固定在二氧化硅(SiO2)微球表面上，形成SiO2-ssDNA-FS探針；當(dāng)靶標(biāo)miRNA與SiO2-ssDNA-FS探針雜交后，DSN選擇性地水解ssDNA，并通過多個(gè)循環(huán)釋放FS，使得SiO2-ssDNA-FS的熒光信號明顯衰減，從而顯著提高靶標(biāo)miRNA的檢測靈敏度。它還實(shí)現(xiàn)了對臨床血液標(biāo)本miRNA的簡單、準(zhǔn)確和定量檢測。該研究新方法的優(yōu)點(diǎn)正是基于DSN輔助miRNA循環(huán)再利用，并借助臨床檢驗(yàn)中常用的FCM技術(shù)用于miRNA檢測，并且該方法允許在體外臨床血液樣品中miRNA的多重檢測。該方法作為一種新穎的一步式淬滅熒光信號傳感器，具有較高的精確度和靈敏度，可成功檢測臨床樣品，未來該方法在腫瘤相關(guān)miRNA等的早期臨床診斷中具有巨大的潛力。

miRNA家族成員通常是高度同源的序列，甚至只有一個(gè)堿基的差異[22]，由于DSN只具有核酸雙鏈體特異性而非序列特異性，因此進(jìn)一步研發(fā)基于DSN的高特異性miRNA檢測新方法至關(guān)重要。XIAO等[23]設(shè)計(jì)了一種新型的納米探針——MoS2納米材料的分子信標(biāo)(MBs)用于DSN介導(dǎo)的miRNA高靈敏度和特異度檢測。MoS2納米材料不僅表現(xiàn)出對MBs的高親和力，而且還充當(dāng)了MBs的有效淬滅劑[24]；MoS2與DSN結(jié)合的強(qiáng)淬滅熒光能力有助于該方法獲得更高的靈敏度，其檢測限(LOD)比傳統(tǒng)檢測方法低4個(gè)數(shù)量級；由于MBs和DSN的單堿基區(qū)分能力，還顯示出較高的選擇性，可用于區(qū)分具有單一堿基差異的同類miRNA序列；此外，裝載MoS2的MBs納米探針還可用于miRNA的多重檢測。鑒于其高靈敏度和多重檢測功能，這種新型傳感器在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。

除了上述常規(guī)的基于DSN的熒光傳感器檢測miRNA外，還有新開發(fā)的基于磁性納米材料及以量子點(diǎn)為信號分子的熒光生物傳感器。目前在已經(jīng)報(bào)道出多種基于DSN的miRNA檢測生物傳感器，其常常采用多種有機(jī)染料作為“信號分子”，并且他們大多數(shù)都結(jié)合一些功能強(qiáng)大的納米材料例如金納米(AuNPs)、氧化石墨烯(GO)、MoS2納米片等來淬滅熒光團(tuán)的熒光，以設(shè)計(jì)新穎的基于DSN的miRNA生物傳感器[25-26]。由于這些檢測方法具有可量化、高靈敏度和特異度等優(yōu)點(diǎn)，因此檢測miRNA效果更佳。研究表明，磁性納米珠(MNs)由于其優(yōu)異的磁選性能，在磁芯組裝方面具有廣闊的應(yīng)用前景[27-28]，并且量子點(diǎn)在同時(shí)檢測多種病毒核酸序列或病毒粒子方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢[29]。最近，WANG等[30]設(shè)計(jì)了一種利用磁性納米珠和量子點(diǎn)組裝的“衛(wèi)星結(jié)構(gòu)”用于檢測多種腸道病毒71型(EV71)相關(guān)的miRNA，通過記錄懸浮液中量子點(diǎn)的熒光信號，還可以輕松實(shí)現(xiàn)定量檢測。該磁性納米材料及量子點(diǎn)形成的“衛(wèi)星結(jié)構(gòu)”，結(jié)合DSN水解反應(yīng)實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)miRNA循環(huán)，既降低了樣品污染和降解的風(fēng)險(xiǎn)，又可以同時(shí)檢測多種miRNA。目前，該方法已成功用于監(jiān)測EV71感染細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的miRNA表達(dá)水平，充分展示了其診斷與治療應(yīng)用的潛力。

3 DSN介導(dǎo)的電化學(xué)傳感器檢測miRNA

電化學(xué)傳感器與熒光、比色傳感器相比，具有檢測靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡便且能在復(fù)雜體系的臨床標(biāo)本中實(shí)現(xiàn)miRNA檢測等優(yōu)勢[31]；電化學(xué)發(fā)光法則進(jìn)一步在電極表面發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)與化學(xué)發(fā)光持續(xù)循環(huán)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)超高靈敏度分析與顯著光學(xué)信號檢測[32]。近年來，利用DSN水解效應(yīng)放大miRNA信號并基于電化學(xué)與電化學(xué)發(fā)光平臺，研發(fā)出許多獨(dú)居匠心的新型生物傳感器。2019年，ZHUANG等[33]研發(fā)出一種偶聯(lián)捕獲探針(CPs)的AuNP修飾金電極(AuNP-AuE)的電化學(xué)生物傳感器，用于胃癌血清中miR-100的快速、靈敏和特異性檢測。當(dāng)靶標(biāo)miR-100與CPs在電極表面雜交，加入DSN水解雜交鏈中的CPs部分使電極的暴露產(chǎn)生電化學(xué)信號；該電化學(xué)傳感器對miR-100的檢測范圍為100 aM～10 pM，檢測限(LOD)大約為10 aM，且可直接用于臨床胃癌血清中的miRNA檢測，因此該方法在惡性腫瘤的早期臨床診斷中有著巨大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

為了突破生物識別組件的保質(zhì)期有限與非特異性吸附等電化學(xué)檢測中的技術(shù)“瓶頸”，WANG等[34]在電極表面共修飾金納米和銀納米顆粒(AgNPs)中成功的開發(fā)了一種高度特異性檢測靶標(biāo)miRNA的電化學(xué)生物傳感器。在存在靶標(biāo)miRNA的情況下，AuNPs上的DNA與miRNA雜交，加入DSN將水解雜交鏈中的DNA，裸露AuNPs允許AgNPs結(jié)合產(chǎn)生電化學(xué)信號；而干擾性miRNA存在時(shí)則DSN反應(yīng)不發(fā)生，AuNPs上的DNA阻礙AgNPs結(jié)合而無電化學(xué)信號。該方法最大優(yōu)點(diǎn)在于有效區(qū)分檢測靶標(biāo)miRNA和干擾性miRNA，LOD低至0.62 fM，未來該傳感器可能用于miRNA相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究和疾病診斷的miRNA生物標(biāo)志物篩選。

近年來，新型納米材料被逐漸應(yīng)用于miRNA的高靈敏、高特異的電化學(xué)發(fā)光檢測研究中。2017年，南京大學(xué)的HUO等[35]利用靜電斥力和體積排斥作用研發(fā)出一種基于AuNPs修飾的DNA探針(DNA-AuNPs)與魯米諾陰離子探針、陽極氧化鋁(AAO)納米孔電極協(xié)同作用的miRNA電化學(xué)發(fā)光傳感器。當(dāng)靶標(biāo)miR-107存在并與AuNPs修飾的DNA探針雜交時(shí)，加入DSN可水解其中DNA部分，AAO反應(yīng)膜上的魯米諾電化學(xué)發(fā)光信號增強(qiáng)；相反，沒有靶標(biāo)miRNA時(shí)AAO反應(yīng)膜上的Ru(bpy)32+電化學(xué)發(fā)光信號增強(qiáng)。該雙陽性信號體系可高靈敏、高特異地檢測miRNA，并調(diào)整捕獲DNA探針序列就可擴(kuò)展到其他miRNA的檢測應(yīng)用中。

ZHU等[36]首次提出了一種基于DSN酶切循環(huán)和量子點(diǎn)修飾西瓜種子狀介孔納米球的雙信號放大電化學(xué)發(fā)光(ECL)生物傳感器。通過嵌入CdTe量子點(diǎn)成功制備了納米微晶納米粒子(mSQSNSs)進(jìn)入到二氧化硅的介孔材料從而極大增加了電化學(xué)發(fā)光的信號：當(dāng)靶標(biāo)miRNA存在時(shí)，AuNPs修飾的磁珠(Fe3O4@Au)表面的發(fā)卡型DNA探針被打開，加入DSN水解DNA-miRNA雜交鏈中的 DNA 部分產(chǎn)生連接短鏈DNA的Fe3O4@Au，并進(jìn)一步與mSQSNSs耦聯(lián)形成電化學(xué)發(fā)光的二次信號放大，巨大的納米復(fù)合物富集在電化學(xué)發(fā)光電極表面產(chǎn)生信號。該電化學(xué)發(fā)光法檢測miRNA達(dá)到33 fM，并實(shí)現(xiàn)臨床血液標(biāo)本檢測，為腫瘤早期篩查提供了潛在的技術(shù)工具。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，基于DSN水解反應(yīng)信號放大策略在特異性檢測體內(nèi)微量濃度miRNA方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，其只水解與miRNA互補(bǔ)的DNA序列，靶標(biāo)miRNA得以循環(huán)再利用；這使得基于DSN的miRNA檢測分析新方法因其優(yōu)越的傳感性能而備受關(guān)注[37-38]?；贒SN新方法的靈敏度和特異度與miRNA分析金標(biāo)準(zhǔn)(qRT-PCR方法)相似，但比qRT-PCR方法更快、更方便、更便宜；其結(jié)合比色、熒光、電化學(xué)、電化學(xué)發(fā)光等分析平臺，近年來已經(jīng)發(fā)展出多種類型的miRNA檢測新策略和新方法。基于DSN的信號放大策略是目前提高miRNA檢測靈敏度和特異度的最有效方法之一，在特定miRNA的早期診斷中顯示出良好的潛力。

當(dāng)然，盡管基于DSN信號放大策略檢測miRNA的方法學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)取得了許多重要進(jìn)展，但是要真正實(shí)現(xiàn)臨床實(shí)際樣品中miRNA的高選擇性和高靈敏度的普適性檢測方法仍面臨許多挑戰(zhàn)。其中，與靶標(biāo)miRNA結(jié)合DNA探針的設(shè)計(jì)應(yīng)是目前基于DSN水解反應(yīng)放大策略檢測miRNA時(shí)最大的問題，這主要是由于傳統(tǒng)ssDNA探針與DSN反應(yīng)前后都會存在ssDNA的非特異性后續(xù)反應(yīng)的假陽性信號；近年來人們逐漸引入發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針[17]、雙發(fā)卡探針[39]、G4 DNA探針[40]等抵消非特異單鏈DNA導(dǎo)致的假陽性。另一方面，DSN的酶活性本身有一定的局限性：DSN需要至少10 bp的雜交底物才能有效切割[41]，DSN只切割雙鏈DNA(不具有序列特異性)使得多重檢測難以實(shí)現(xiàn)[11]；因此，需要額外的材料、新策略來輔助提升檢測低豐度miRNA的分析靈敏度，正如本文歸納描述中的納米技術(shù)和新型材料(金納米顆粒、石墨烯、磁珠、量子點(diǎn)等)被大量引入基于DSN放大策略檢測MiRNA的新方法中[42-43]，用來增加探針的數(shù)量或檢測信號的強(qiáng)度。這些問題的逐漸解決正是未來更多新穎的DSN信號放大策略檢測miRNA的方法學(xué)研究的前進(jìn)方向，科研人員不斷開發(fā)出更加靈敏、穩(wěn)定、高通量的 miRNA 生物傳感器，將在腫瘤等疾病相關(guān)miRNA的臨床標(biāo)本早期檢測領(lǐng)域中取得更加豐碩的成果。