贠丹丹， 耿 男， 李菊萍， 劉 璞， 張 婷

(1.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 陜西 西安 710077 2.西北政法大學(xué)公安學(xué)院， 陜西 西安 710061)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以滑膜增生、骨和軟骨破壞為主要特征的慢性炎性關(guān)節(jié)疾病，嚴(yán)重時可造成患者殘疾，影響患者生存質(zhì)量。滑膜成纖維細(xì)胞(synovial fibroblasts，SF)是RA滑膜增生和侵襲的主要效應(yīng)細(xì)胞，抑制SF增生和侵襲對控制RA發(fā)生發(fā)展尤為重要。三七總皂苷(PNS)是中藥三七的主要活成分，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化等藥理活性。臨床研究顯示，PNS配合西藥治療RA有助于改善患者癥狀，降低疾病活動性[1]；另研究顯示，PNS可減輕膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型的炎癥反應(yīng)和滑膜血管形成；在兔關(guān)節(jié)炎模型中，PNS可保護(hù)軟骨細(xì)胞免受RA相關(guān)損傷，減輕關(guān)節(jié)炎兔的關(guān)節(jié)破壞[2]。以上研究提示，PNS在RA的治療中具有重要作用。miR-335-5p是RA滑膜組織和滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的微小RNA(miRNA)，上調(diào)miR-335-5p可通過靶向抑制DKK1的表達(dá)阻礙RASF增殖和侵襲，并誘導(dǎo)RASF凋亡，miR-335-5p是RA治療的潛在分子靶點[3]。本研究探究PNS可能通過miR-335-5p對MH7A細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑：MH7A細(xì)胞系(寧波明舟生物科技有限公司)；PNS(南京本草益康生物科技有限公司(純度98%))；胎牛血清(浙江天杭)；BCA蛋白檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒、DMEM培養(yǎng)液、LipofectamineTM 2000試劑盒和CCK-8試劑盒(均北京索萊寶)；qRT-PCR實驗所需試劑盒(大連寶生物)；蛋白質(zhì)印跡實驗所需抗體(英國Abcam公司)；引物序列、miR-335-5p 模擬物(mimcs)和抑制劑(anti-miR-335-5p)、模擬對照序列(miR-NC)和抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)(均上海生工)。

1.2細(xì)胞的分組和處理：取6孔板，加200μL(5.0×104個/mL)的MH7A細(xì)胞懸液。培養(yǎng)4h后，用含0、0.5、1.0、2.0mg/mL三七總皂苷培養(yǎng)24h，記為對照(Con)組、三七總皂苷低、中、高劑量組；轉(zhuǎn)染miR-335-5p mimics、miR-NC、anti-miR-335-5p或anti-miR-NC，具體轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM 2000試劑盒，轉(zhuǎn)染12h。轉(zhuǎn)染miR-335-5p mimics、miR-NC的細(xì)胞，記為miR-335-5p組、miR-NC組；轉(zhuǎn)染anti-miR-335-5p、anti-miR-NC的細(xì)胞均按照PNS-H組處理，記為PNS+anti-miR-335-5p組、PNS+anti-miR-NC組。

1.3CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率：取各組細(xì)胞，培養(yǎng)48h后加CCK-8(10μL/孔)，孵育2h后，用酶標(biāo)儀(波長450 nm)檢測各吸光度(A)值。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：按照上述1.2.1分組處理24h，收集各組細(xì)胞。經(jīng)PBS清洗后，加500μL Binding Buffer，重懸細(xì)胞。加10μL Annexin V-FITC、5μL PI，避光孵育15min后，1h內(nèi)于流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率(%)=早期凋亡+晚期凋亡。

1.5劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移：取6孔板，加2.5mL(5.0×104個/mL)MH7A細(xì)胞懸液。培養(yǎng)4h后，棄培養(yǎng)液，于各孔底部劃兩條等間距的平行線，間距記為d0h，并用PBS清洗掉劃痕間細(xì)胞。然后按照上述1.2.2分組處理24h后，再次測量細(xì)胞間距離，記為d24h。劃痕愈合率(%)=(d0h-d24h)/d0h×100 %。

1.6Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲：取6孔板，加2.5mL(5.0×104個/mL)MH7A細(xì)胞懸液。培養(yǎng)4h后，棄培養(yǎng)液，按照上述1.2.1分組處理24h，收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞為5.0×105個/mL。將Transwell小室上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，自然晾干。取100μL各組細(xì)胞懸液加至上室，加500μL完全培養(yǎng)液加至下室。培養(yǎng)24h后，棄培養(yǎng)液，用多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察，計數(shù)。

1.7蛋白質(zhì)印跡法檢測Ki-67、PCNA、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)：處理結(jié)束后，收集細(xì)胞。將細(xì)胞中總蛋白用RIPA試劑進(jìn)行提取，并檢測蛋白濃度(BCA法)。行SDS-PAGE實驗分離總蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，進(jìn)行封閉處理(5%脫脂奶粉孵育2h)。于4℃中分別用Ki-67(1∶1000)、PCNA(1∶1000)、E-cadherin(1∶500)、N-cadherin(1∶500)、GAPDH(內(nèi)參，1∶1 000)一抗孵育過夜，洗膜后，再用山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1h。加顯影液顯影，曝光拍照，ImageJ軟件分析蛋白條帶吸光度值。

1.8qRT-PCR檢測miR-335-5p表達(dá)：細(xì)胞接種和處理同上述1.2.1，用miRNA提取試劑盒對細(xì)胞中總RNA進(jìn)行提取，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：miR-335-5p上游5'-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3'，下游5'-TGCTTCAAGAGCAATAACGA-3'；U6上游5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。2-△△Ct法計算miR-335-5p相對U6的表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1PNS對MH7A細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：與對照組比較，PNS各劑量組細(xì)胞A值、細(xì)胞中Ki-67和PCNA蛋白的表達(dá)量均降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖1、表1。

圖1 PNS對MH7A細(xì)胞凋亡和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響A：PNS對MH7A細(xì)胞凋亡的影響；B：PNS對MH7A細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表1 PNS對MH7A細(xì)胞增殖凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.2PNS對MH7A細(xì)胞遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：與對照組比較，PNS各劑量組細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲數(shù)及細(xì)胞中N-cadherin蛋白的表達(dá)量均降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白的表達(dá)量升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖2、表2。

表2 PNS對MH7A細(xì)胞遷移侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 PNS對MH7A細(xì)胞遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響A：PNS對MH7A細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；B：PNS對MH7A細(xì)胞遷移的影響；C：PNS對MH7A細(xì)胞侵襲的影響

2.3PNS對MH7A細(xì)胞miR-335-5p表達(dá)的影響：與對照組比較，PNS各劑量組細(xì)胞中miR-335-5p的表達(dá)量均升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表3。

表3 PNS對MH7A細(xì)胞中miR-335-5p表達(dá)的影響

2.4上調(diào)miR-335-5p對MH7A細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：miR-335-5p在轉(zhuǎn)染miR-335-5p mimics的MH7A細(xì)胞中的表達(dá)量高于轉(zhuǎn)染miR-NC的MH7A細(xì)胞(3.12±0.24 vs 1.00±0.00，t=26.500，P<0.05)。miR-335-5p組MH7A細(xì)胞A值、劃痕愈合率、侵襲數(shù)及細(xì)胞中Ki-67、PCNA和N-cadherin蛋白的表達(dá)量均低于miR-NC組(P<0.05)，凋亡率、E-cadherin蛋白表達(dá)量高于miR-NC組(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 上調(diào)miR-335-5p對MH7A細(xì)胞凋亡、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響A：上調(diào)miR-335-5p對MH7A細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；B：上調(diào)miR-335-5p對MH7A細(xì)胞凋亡的影響；C：上調(diào)miR-335-5p對MH7A細(xì)胞遷移的影響；C：上調(diào)miR-335-5p對MH7A細(xì)胞侵襲的影響

表4 上調(diào)miR-335-5p對MH7A細(xì)胞增殖凋亡遷移侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5下調(diào)miR-335-5p逆轉(zhuǎn)PNS對MH7A細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的作用：轉(zhuǎn)染anti-miR-335-5p至MH7A細(xì)胞后期表達(dá)量低于轉(zhuǎn)染anti-miR-NC至MH7A細(xì)胞(0.34±0.03 vs 1.00±0.00，t=66.000，P<0.05)。PNS+anti-miR-335-5p組MH7A細(xì)胞A值、劃痕愈合率、侵襲數(shù)及細(xì)胞中Ki-67、PCNA和N-cadherin蛋白的表達(dá)量均高于PNS+anti-miR-NC組(P<0.05)，凋亡率、E-cadherin蛋白表達(dá)量低于PNS+anti-miR-NC組(P<0.05)。見圖4、表5。

表5 下調(diào)miR-335-5p逆轉(zhuǎn)PNS對MH7A細(xì)胞增殖凋亡遷移和侵襲的作用

圖4 下調(diào)miR-335-5p逆轉(zhuǎn)PNS對MH7A細(xì)胞凋亡、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的作用A：下調(diào)miR-335-5p逆轉(zhuǎn)PNS對MH7A細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的作用；B：下調(diào)miR-335-5p逆轉(zhuǎn)PNS對MH7A細(xì)胞凋亡的作用；C：下調(diào)miR-335-5p逆轉(zhuǎn)PNS對MH7A細(xì)胞遷移的作用；D：下調(diào)miR-335-5p逆轉(zhuǎn)PNS對MH7A細(xì)胞侵襲的作用

3 討 論

三七，又被成為田七，是中國傳統(tǒng)中藥材之一，PNS是三七的主要活性成分，對多種腫瘤具有抑制作用。研究顯示，PNS可通過上調(diào)E-cadherin及下調(diào)纖維連接蛋白、波形蛋白的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]；PNS可通過抑制VEGF/PI3K/AKT信號通路阻礙子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞增殖和侵襲，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗子宮內(nèi)膜癌作用[5]。Ki-67、PCNA是細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PNS降低MH7A細(xì)胞增殖活性、增殖標(biāo)志性蛋白(Ki-67、PCNA)表達(dá)及細(xì)胞遷移及侵襲，同時促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性，這提示PNS有可能對治療RA具有積極作用。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是細(xì)胞獲得遷移及侵襲的重要過程，在此過程中，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)增加。本研究顯示，PNS促進(jìn)MH7A細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)，而抑制N-cadherin蛋白表達(dá)，提示PNS可能通過間接抑制MH7A細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來阻礙細(xì)胞遷移和侵襲。

MiRNA可參與RA在內(nèi)的多種疾病發(fā)生發(fā)展，可作為疾病治療的分子靶點。目前miR-335-5p的研究多集中在腫瘤方面，如miR-335-5p在乳腺癌[6]、卵巢癌[7]和結(jié)直腸癌[8]等多種癌癥中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-335-5p可發(fā)揮抑癌基因作用阻礙這些腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。RASF也具有腫瘤細(xì)胞特性，本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-335-5p降低細(xì)胞增殖活性、劃痕愈合率、侵襲數(shù)，Ki-67、PCNA、N-cadherin蛋白表達(dá)，并增加凋亡率、E-cadherin蛋白表達(dá)量，提示上調(diào)miR-335-5p對MH7A細(xì)胞增殖、遷移及侵襲具有顯著抑制作用，而對細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用，這與結(jié)果[3]報道一致，提示miR-335-5p可作為抑制RA發(fā)生發(fā)展的分子靶點。本實驗顯示，PNS可呈劑量依賴性上調(diào)MH7A細(xì)胞中miR-335-5p的表達(dá)，而恢復(fù)實驗結(jié)果表明，下調(diào)miR-335-5p逆轉(zhuǎn)了PNS對MH7A細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的作用，這提示PNS可能通過上調(diào)miR-335-5p來發(fā)揮對MH7A細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的作用。

但PNS上調(diào)miR-335-5p是通過何種途徑或分子發(fā)揮抗RA作用的還有待進(jìn)一步探究。在先前的研究中，miR-335-5p被報道可通過靶向下調(diào)其靶基因SDC1[6]、BCL2L2[7]、LDHB[8]的表達(dá)而發(fā)揮作用。BCL2L2已被證實在RASF系MH7A細(xì)胞中表達(dá)升高，靶向下調(diào)BCL2L2表達(dá)具有抗RA作用[9]；SDC1也被認(rèn)為是與RA發(fā)展相關(guān)的中樞基因[10]；LDHB與RA炎癥性疾病活動度有關(guān)[11]。在后續(xù)的研究中，將對miR-335-5p發(fā)揮抗RA作用的下游靶基因進(jìn)行深入分析。綜上，PNS抑制RASF細(xì)胞系MH7A增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)凋亡，其作用機(jī)制可能與增加miR-335-5p的表達(dá)有關(guān)。