周郁斌

（廣東醫(yī)科大學/廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，藥學院，廣東東莞 523808）

上個世紀80 年代，Johnstone 和Pan 首次在綿羊網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)具有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡[于1987 年被命名為“外泌體”（“exosome”），后多以“exosomes”形式出現(xiàn)][1-2]。在隨后的30 多年，外泌體的研究經(jīng)歷了快速發(fā)展。本世紀初Théry 等[3]建立了較為通用的外泌體提取分離和鑒定標準，大大地推動了外泌體的基礎和應用研究。2013 年的“諾貝爾生理或醫(yī)學獎”授予了Rothman、Schekman 和Südhof 3 位科學家，以表彰其關于細胞內(nèi)囊泡（包括外泌體）運輸調(diào)節(jié)機制的研究，這把外泌體領域推上了新的高地，吸引著越來越多研究者的興趣，包括臨床醫(yī)生、藥劑學家、免疫學家和材料學家等。外泌體是一種納米級的膜性囊泡，包含多種重要生物分子，在診斷和治療方面具有重要的生物醫(yī)學應用前景[4]。本文將簡介外泌體的基本特征和相關研究方法，并探討其在診斷和治療方面的研究進展，旨在使讀者對該領域具有總體上的認識，為其提供研究策略參考和啟發(fā)新思路。在最后部分，本評述側(cè)重于討論外泌體研究當前存在的問題并對未來的研究方向進行展望。

1 外泌體簡介

外泌體是一種由細胞分泌的囊泡，廣泛存在于血液、尿液、唾液、乳汁等多種體液中，其粒徑為30～150 nm（密度為1.13～1.19 g·mL-1，不同文獻報道中定義的粒徑范圍會有所差異）。外泌體起初只被當作是細胞活動的“排泄物”，但后來越來越多的研究表明其可能是細胞間通訊和物質(zhì)交換的重要物質(zhì)[5]。外泌體包含多種生物分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、mRNA 和miRNA 等，這些物質(zhì)基礎使得其在生物醫(yī)學應用中備受關注。近30年來，外泌體相關文章的發(fā)表數(shù)量呈快速增長趨勢（根據(jù)Web of Science 檢索數(shù)據(jù)，從1991 年的3 篇急增到2021 年的6 014 篇）。目前，外泌體的研究正處于高速發(fā)展階段，是當前的研究熱點，國內(nèi)外一些相關公司也相繼成立。本部分將對外泌體的基本概況進行介紹。

1.1 外泌體的形成及組成

一般認為，外泌體的形成經(jīng)歷早期內(nèi)體的膜內(nèi)陷、多囊泡體的形成、囊泡的釋放分泌等系列過程[6]。然而，其確切形成機制的闡明仍是當前的研究難點。根據(jù)其形成過程不難理解，外泌體可包裹供體細胞的生物分子，以及含有一些外泌體共有的特征物質(zhì)。常見的外泌體裝載物包括脂類、四跨膜蛋白家族（如CD9、CD63、CD81）、主要組織相容性復合體、生長因子、黏附蛋白、熱休克蛋白、核酸等[7]。其中，四跨膜蛋白家族、熱休克蛋白等常作為外泌體的標志物用于其提取分離和分析鑒定。此外，外泌體所攜帶的供體細胞源蛋白或核酸分子反映著供體細胞自身以及細胞間交流的重要信息，是目前備受關注的生物標志物。

1.2 外泌體的分離與表征

外泌體研究首要步驟是對其進行提取分離。目前常用的外泌體提取分離方法包括差速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、免疫親和捕獲法、分子排阻色譜法、試劑沉淀法等[8]。差速離心法主要是通過不同的離心速度把特定密度的外泌體進行分離提取。該方法是外泌體的經(jīng)典提取方法，但存在耗時較長、工作量大、產(chǎn)率不高、不易將外泌體與微泡碎片分離等問題。為了提高純度，可在此基礎上進行密度梯度離心（如加入蔗糖或者碘克沙醇）。免疫親和捕獲法利用外泌體的特征蛋白進行分離提取，具有較高的特異性，常用于純化操作。分子排阻色譜法和超濾離心法基于粒子的大小進行分離。值得注意的是，對于分子排阻色譜法，色譜柱的孔徑、凝膠填充物的類型、洗脫速度等因素可能會影響外泌體的分離效果。試劑沉淀法常用高分子將溶液中的粒子沉淀從而得到外泌體。在實際研究中，可根據(jù)不同的需要采用適當?shù)耐饷隗w提取分離方法，也可以結(jié)合不同方法的特點聯(lián)合應用。

外泌體的表征是驗證其提取效果的重要手段，為其應用提供物質(zhì)基礎依據(jù)。針對外泌體的物理學和生物學性質(zhì)以及實際需要，可選用相應的表征方法。如，通過透射電子顯微鏡可以直觀觀察到外泌體的形貌，有“所見即所得”的特點，但并不容易測定其濃度等信息。納米追蹤分析技術(shù)不僅可觀察外泌體的粒徑，還可以測定其濃度，是常用外泌體表征手段。此外，動態(tài)光散射、蛋白印跡法等技術(shù)也常用于外泌體的表征。近年來，新型外泌體檢測技術(shù)有了較快的發(fā)展，這也促進了其在診斷中的應用。值得注意的是，外泌體在表征過程中也可能發(fā)生物理或生物學性質(zhì)上的變化?？偠灾瑢ν饷隗w的全面表征有助于從多角度獲取其特性，為其后續(xù)的應用提供有力支撐。

1.3 外泌體的主要應用

由于外泌體常參與體內(nèi)的各種生理病理活動，因此被認為是疾病檢測中重要的標志物，可為液體活檢提供豐富的信息[9]。此外，外泌體的天然來源及其裝載的重要生物分子使得其在治療應用（如作為治療劑或遞送載體）中具有巨大潛力。目前來說，外泌體相關產(chǎn)業(yè)中，與外泌體診斷和治療相關的企業(yè)占了絕大多數(shù)，這也側(cè)面暗示了其在診斷和治療方面的應用前景。本文將從這兩方面進行總結(jié)和展開討論。

2 外泌體的檢測及診斷應用

2.1 外泌體作為生物標志物的潛力

外泌體作為細胞間通訊和物質(zhì)交換的重要載體，參與多種生理和病理活動（如參與腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移及耐藥），攜帶著疾病的重要信息，被認為是一種液體活檢中的重要生物標志物，具有無創(chuàng)、易獲取、檢測便捷等優(yōu)點[10]。此外，一些生物分子在體液循環(huán)過程中容易被各種酶等降解從而表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性，而外泌體的包裹可對其進行一定程度上的保護，從而可以延長其存活時間[11]。外泌體體內(nèi)天然來源的特點賦予了其裝載和保護重要生物標志分子的能力，其檢測和診斷應用備受關注。另一方面，已有研究表明一些腫瘤組織分泌的外泌體數(shù)量會比正常組織多[12-14]。更重要的是，一些疾病相關的標志物也會在其相應的外泌體中富集。因此，外泌體作為重要生物標志物的檢測分析是近年來的熱點。

2.2 外泌體在臨床診斷中的應用

有研究表明，對外泌體的分析可有助于一些疾病的診斷。如，胰導管癌（PDAC）和結(jié)直腸癌（CRC）患者的循環(huán)外泌體中磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（GPC1）的水平相對于健康對照組明顯偏高[15-17]。在Cheshomi等[18]的報道中，膠原蛋白反應介導蛋白2（CRMP-2）可在結(jié)腸腺癌細胞系Colo205 和SW480 分泌的外泌體中檢出，并可以此為基礎進一步區(qū)分CRC 患者和正常人。此外，通過檢測尿液中的前列腺特異性膜抗原適體的陽性外泌體，可以進行前列腺癌的診斷、提高效率[19]。Jakobsen 等[20-21]開發(fā)了一種可以分析外泌體中37 種肺癌相關蛋白水平的細胞外陣列技術(shù)。該方法可基于10 μL 血漿樣本的檢測以區(qū)分非小細胞肺癌患者與健康個體，準確率達75%。外泌體中的膜蛋白和miRNA 可以作為胰腺癌早期監(jiān)測和預后監(jiān)察的生物標志物，有助于降低胰腺癌的死亡率[22]。Li 等[19]構(gòu)建了一種基于適配體的納米平臺，通過檢測尿液中的前列腺特異性膜抗原（PSMA）陽性的外泌體，以進行前列腺癌的診斷。外泌體在診斷應用中有著較快的發(fā)展，基于外泌體的癌癥診斷產(chǎn)品已在美國推出[9,23]。

2.3 外泌體的檢測分析進展

外泌體的納米尺度大小使得其檢測分析具有一定的挑戰(zhàn)性。為了克服傳統(tǒng)檢測方法時間較長、儀器昂貴和操作復雜等問題，研究人員已開發(fā)出多種用于外泌體檢測的新型分析方法（尤其是新型生物傳感器），并表現(xiàn)出快速、靈敏、低價、實時檢測等特點。如，Yu 等[24]以外泌體特異蛋白CD63 作為檢測目標構(gòu)建場效應管生物傳感器，成功地檢測了胰腺癌外泌體。Jiang 等[25]報道了基于外泌體中蛋白檢測的金納米粒子比色傳感器，并可分別檢測CD63 及與腫瘤相關的多種標志蛋白。該方法并不需要昂貴的儀器進行分析，只需要通過肉眼觀察得到的顏色即可分析外泌體中的蛋白組分。Aβ42 低聚體可影響阿爾茨海默癥的進展，是一種重要的監(jiān)測指標。以氧化石墨烯（GO）為熒光淬滅劑，結(jié)合熵驅(qū)動鏈位移反應原理，構(gòu)建熒光信號放大型生物傳感器，可用于外泌體中Aβ42 的檢測分析[26-27]。此外，He 等[28-29]通過構(gòu)建抗體-適配體夾心免疫分析納米裝置，實現(xiàn)了單外泌體成像。目前，對外泌體的檢測主要集中在外泌體本身，以及其所攜帶的蛋白質(zhì)、核酸等重要分子的分析上。針對這些目標物，近年已涌現(xiàn)了大量相關的傳感檢測策略，并朝著超靈敏、高通量、多目標物檢測等趨勢發(fā)展[29-30]。這些檢測分析方法的基礎和應用研究將為外泌體的臨床診斷提供重要依據(jù)。值得注意的是，疾病的診斷往往需要多方面的信息支持。因此，基于外泌體的臨床診斷應用應結(jié)合對外泌體的多維度分析（如同時分析多種蛋白、基因等），以及其他標志性臨床檢測指標，以達到更精確的診斷。

3 外泌體的治療應用

3.1 外泌體在治療應用中的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎及特點

外泌體的顯著特點之一是其天然存在于體內(nèi)，因此被認為具有較好的體循環(huán)穩(wěn)定性[31]。此外，從藥劑學的經(jīng)驗上考量，其納米囊泡結(jié)構(gòu)有利于構(gòu)建藥物/基因遞送系統(tǒng)。藥劑學領域的大量研究表明脂質(zhì)體（具有磷脂雙分子層的囊泡結(jié)構(gòu)）可作為一種優(yōu)異的藥物載體，但其體內(nèi)的穩(wěn)定性問題仍面臨較大的挑戰(zhàn)，而外泌體天然體內(nèi)存在的特點使其在藥物遞送的應用方面引起了較大的關注。已有報道顯示，外泌體中的一些生物分子可能是其能在體內(nèi)穩(wěn)定存在的物質(zhì)基礎。更進一步地，外泌體所裝載的生物分子也可能在藥物遞送中扮演著重要角色。除了穩(wěn)定性方面的性質(zhì)外，外泌體的膜囊泡結(jié)構(gòu)賦予了其一定的生物相容性和親和力。如，得益于其血腦屏障（BBB）的穿透能力，外泌體已被用于一些腦部靶向的研究[32]。另一方面，由于外泌體裝載了多種生物活性分子，其本身亦可能表現(xiàn)出一定的活性。已有多個研究表明，外泌體參與多種生理、病理的調(diào)節(jié)過程。因此，外泌體作為活性物質(zhì)具備作為治療劑的潛力。下面將著重介紹外泌體分別作為遞送載體和生物活性物質(zhì)的治療應用。

3.2 外泌體作為藥物/基因載體的治療應用

由于外泌體的固有特性，包括低免疫原性、體內(nèi)穩(wěn)定性和跨越生物屏障的能力，外泌體作為治療性的藥物/基因的載體具有重要的研究意義和臨床應用前景[33]。目前，外泌體已經(jīng)被用于遞送小分子藥物、蛋白質(zhì)、基因等多種類型的活性物質(zhì)。

藥物的裝載是外泌體給藥系統(tǒng)的重要環(huán)節(jié)。目前常用的藥物裝載方法可分為物理方法、化學方法和生物方法。物理方法是較為常用的裝載方式，主要包括電穿孔法、擠出法、超聲法、凍-融法等；化學方法包括皂苷輔助滲透法和轉(zhuǎn)染法等；生物方法有孵育法和病毒轉(zhuǎn)導法等[34]。每一種方法具有不同的特點，可根據(jù)實際的研究和應用需要選取適合的載藥策略。此外，受到脂質(zhì)體載藥策略的啟發(fā)，研究人員已研究出具有長循環(huán)、靶向等性能的外泌體載藥系統(tǒng)。

目前國內(nèi)外科學家已開發(fā)各種基于外泌體的藥物遞送系統(tǒng)，并通過體內(nèi)外實驗考察其治療效果。如，Kim 等[35]通過超聲處理將化療藥物紫杉醇裝載到巨噬細胞來源的外泌體中，并發(fā)現(xiàn)其對耐藥癌細胞的細胞毒性提高了50 倍，制劑在肺轉(zhuǎn)移小鼠中顯示出很強的抗腫瘤作用。在近期的報道中，Li 等[36]用人結(jié)直腸癌細胞系LIM1215 中分離得到的外泌體作為載體裝載阿霉素，并將其工程化構(gòu)建含超順磁性氧化鐵納米顆粒和A33 抗體的制劑，結(jié)果顯示該制劑對結(jié)腸癌具有良好的靶向性能，而且能降低心臟細胞毒性。此外，外泌體能夠保護核酸免受降解，被認為是基因治療中核酸（如siRNA 和miRNA）的理想載體。Kobayashi 等[37]將腫瘤抑制因子miR-199a-3p 裝載到外泌體中，通過體內(nèi)外實驗研究表明該miRNA-外泌體可有效減少c-Met的產(chǎn)生，并抑制癌細胞增殖和侵襲。另一方面，基于自體乳腺癌細胞外泌體具有有效的肺靶向能力，Zhao等[38]研制了一種由外泌體膜包裹的白蛋白和siS100A4的新型仿生納米顆粒，并發(fā)現(xiàn)該基于外泌體的siRNA遞送系統(tǒng)能夠顯著抑制乳腺癌的術(shù)后轉(zhuǎn)移?？紤]到脂質(zhì)體在藥物遞送中的特性，Lin 等[39]通過外泌體和脂質(zhì)體的雜交構(gòu)建了一種用于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)遞送的納米粒，并使被遞送的基因較好地在間充質(zhì)干細胞中表達。目前，已有多個基于外泌體載體的制劑處于臨床研究階段[40]?？偟膩碚f，生物來源的外泌體表現(xiàn)出了較好的生物分子負載能力，能有效地進行體內(nèi)遞送，是一種具有重大應用前景的藥物/基因載體。

3.3 外泌體作為活性物質(zhì)的治療應用

外泌體通過其中含有的生物活性分子實現(xiàn)細胞間信號傳導，從而誘導一些生理病理事件的發(fā)生。另外由于外泌體的內(nèi)源性，含有各種生物活性物質(zhì)的外泌體有望開發(fā)成為安全有效的治療藥物。間充質(zhì)干細胞（MSCs）具有抗炎和再生作用，也是最常用的外泌體來源。相對于直接的細胞治療，基于外泌體的治療具有穩(wěn)定性好、易于保存和質(zhì)量控制等的優(yōu)勢。有報道稱，MSCs 分泌的外泌體與其治療作用息息相關。通過裝載和傳遞其中的組分，包括miRNA 和蛋白質(zhì)、白介素-10 和轉(zhuǎn)化生長因子-β，MSCs 分泌的外泌體可以抑制促炎細胞因子的表達，發(fā)揮抗炎作用，并通過增強細胞外基質(zhì)重塑促進組織再生[41-42]。因此，MSCs 來源的外泌體具有治療多種疾病的潛力，如心血管疾病、肝損傷、腎損傷和神經(jīng)損傷等。另外，由于樹突狀細胞（DC）的抗原呈遞細胞（APCs）屬性，來源于DC 的外泌體似可用于抗癌治療。有研究表明，來源于成熟DC的外泌體可以誘導強烈的T 細胞反應[43]。除了抗原呈遞外，DC 來源的外泌體可通過其表面蛋白如NKG2D配體和IL-15Rα 激活自然殺傷細胞[44]。因此，來自某些類型的細胞（如MSCs 和DC 等）的外泌體具有重要的治療潛力，可以作為生物相容的有效藥物用于治療各種疾病，如器官損傷、癌癥等。然而，在以外泌體作為治療劑時，由于其較為復雜的組成，應考慮劑量和毒副作用之間的平衡點[45]。

4 小結(jié)與展望

外泌體作為近年來的研究熱點，已引起大量科研人員的興趣。如上文所述，細胞來源的外泌體具有獨特的性質(zhì)，其在診斷和治療應用中的潛力巨大。截至2021 年，已成立了超過50 家外泌體相關的企業(yè)（包括上市公司Codiak bioscience），主要涉及外泌體診斷和外泌體治療兩個方向。目前，基于外泌體的診斷試劑已經(jīng)上市，而外泌體治療相關的臨床試驗正在進行中，相信在不久的將來會看到外泌體的相關治療藥物的臨床應用。外泌體領域的研究仍在不斷的探索和進步中。外泌體組成復雜，其研究開發(fā)尚處于起步階段，其結(jié)構(gòu)組成、作用機制等目前還沒被完全闡明。而不同細胞來源的外泌體可能會包含一些截然不同的組分。此外，外泌體的研究標準尚存在一些爭議。針對此情況，Théry 等于2018 年對外泌體等囊泡進行了進一步定義，以便相關研究進一步統(tǒng)一。另一方面，外泌體的大量提取制備也是當前的一大難點。外泌體的復雜組分也使其安全性考察顯得尤為重要。作為一個較新的研究領域，雖然外泌體存在一些需要解決問題，但是其巨大的應用潛力更是備受矚目。日后的研究可以聚焦于外泌體的形成機制、組成成分等方面的全維度解析，以及質(zhì)量穩(wěn)定可靠的外泌體的大量制備。雖然外泌體的研究目前還存在一些問題，但相信隨著更多關注的投入，這些問題都會逐漸被解決，外泌體將會是診斷和治療中的重要工具。本文對外泌體及其診斷和治療應用進行了介紹和討論，以期為該領域的科研人員提供一定參考。