龔 麗，米紫玥，孔玉潔，徐海霞，田 力，劉 忠

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，合肥 2300322中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院輸血研究所，成都 6100523中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血不良反應(yīng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610052

血小板在保存期間可發(fā)生儲(chǔ)存損傷(platelet storage lesion，PSL)[1]，分泌細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)。EVs數(shù)量隨血小板保存時(shí)間延長(zhǎng)而增加[2]。EVs已被證明具有促凝和促炎活性[3]，參與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈粥樣硬化等血栓并發(fā)癥[4]。血小板EVs主要包括兩類(lèi)：外泌體、微囊泡[5]。外泌體、微囊泡均為雙層膜結(jié)構(gòu)，粒徑大小分別為30 ～ 150 nm，100 ～ 1 000 nm[6]。外泌體攜帶有豐富的蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)[7]。近年來(lái)，研究者們關(guān)注于外泌體在各種生理病理狀態(tài)下生物活性物質(zhì)的變化及可能的影響機(jī)制，而對(duì)于隨著血小板保存時(shí)間延長(zhǎng)，外泌體濃度變化及其對(duì)凝血功能的影響的研究較少，血小板保存期間產(chǎn)生的外泌體是否參與EVs的促凝作用有待研究。因此，該研究著重探討手工血小板中外泌體濃度與保存時(shí)間的關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上探究其對(duì)凝血功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料手工血小板，來(lái)自四川省德陽(yáng)市中心血站。

1.2 儀器與試劑超速離心機(jī)(Beckman Coulter，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)；納米流式分析儀(福流，成都智予醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司)；透射電子顯微鏡(FEI TecnaiTMG 2 Spirit，捷克FEI公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(CLINX ChemiScope 3000 mini，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)；全自動(dòng)凝血分析儀(Sysmex CS-2000 i，成都協(xié)和生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；血栓彈力圖儀(CFMS LEPU-8800，北京樂(lè)普醫(yī)療科技有限責(zé)任公司)；化學(xué)發(fā)光成像分析儀(ImageQuantTMLAS 4000，美國(guó)通用電氣醫(yī)療公司)；單克隆兔抗人CD 9抗體、多克隆鼠抗人TSG 101抗體、鈣聯(lián)蛋白Calnexin抗體、羊抗兔IgG抗體、羊抗鼠IgG抗體(Abcam，英國(guó))；PT檢測(cè)試劑盒、APTT檢測(cè)試劑盒(Simens，德國(guó))；血栓彈力圖檢測(cè)試劑盒(樂(lè)普，北京)；多克隆兔抗人F 7抗體、單克隆鼠抗人β-actin抗體(美國(guó)Proteintech公司)；5% BSA封閉液(Solarbio，北京)。

1.3 方法

1.3.1樣本采集 先后分別取10人份、5人份手工血小板(每人份約50 ml)，分別置于血小板常溫[(22±2)℃]震蕩保存箱中保存0(采集當(dāng)天)、3、5 d(D 0、D 3、D 5)后在無(wú)菌條件下從血小板樣本中取15 ml。血小板樣本以5 480 r/min離心10 min，去除大部分血小板。取上清液至離心管中，-80 ℃保存。

1.3.2外泌體提取 血小板上清液4 ℃解凍后經(jīng)1 380 r/min離心10 min，再經(jīng)3 580 r/min離心10 min后吸取上清液，7 750 r/min離心30 min，去除大細(xì)胞碎片及微囊泡。吸取上清液至超速離心管中，使用0.45 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾以去除小細(xì)胞碎片及微囊泡。使用超速離心機(jī)4 ℃下40 000 r/min離心1 h 30 min，保留沉淀，再加入一定量無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，4 ℃下40 000 r/min離心1 h 30 min 進(jìn)行洗滌[8]。用200 μl無(wú)菌PBS重懸沉淀，-80 ℃凍存。

1.3.3外泌體的鑒定

1.3.3.1Western blot外泌體免疫標(biāo)志物的鑒定 經(jīng)RIPA 裂解后，吸取外泌體蛋白質(zhì)溶液于EP管中，加入上樣緩沖液(Loading buffer)，98 ℃ 5 min金屬浴進(jìn)行蛋白變性，4 ℃下12 000 r/min離心5 min。以10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，使用濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；采用5%脫脂奶粉TBST封閉液對(duì)PVDF膜室溫下封閉1 h；于封閉液稀釋的一抗TSG 101(1 ∶1 000)、CD 9(1 ∶1 000)以及陰性對(duì)照蛋白標(biāo)志物Calnexin(1:1 000)中4 ℃孵育過(guò)夜；1×TBST 充分洗膜后，于封閉液稀釋的相應(yīng)二抗(1 ∶5 000)中室溫孵育1 h，1× TBST充分洗膜。加入化學(xué)發(fā)光工作液反應(yīng)5 min，采用CLINX化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光、顯影。同時(shí)以Hela細(xì)胞裂解液作為對(duì)照樣品。

1.3.3.2透射電鏡鑒定外泌體形態(tài) 吸取外泌體樣本10 μl滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去殘液。吸取10 μl磷鎢酸滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去殘液。常溫下干燥幾分鐘。于100 KV下進(jìn)行電鏡檢測(cè)成像。

1.3.3.3外泌體粒徑大小的鑒定 吸取外泌體懸液于EP管中，按一定比例加入PBS進(jìn)行稀釋后，充分混勻。按照納米流式儀器操作說(shuō)明設(shè)置檢測(cè)參數(shù)，進(jìn)行測(cè)量分析。

1.3.4不同保存時(shí)間血小板中外泌體對(duì)凝血功能的影響

1.3.4.1外泌體對(duì)血漿凝血功能的影響 取10 ml全血于枸櫞酸鹽抗凝管中(全血與枸櫞酸鹽的比例為9 ∶1)，室溫下靜置5 min，水平離心機(jī)中 4 000 r/min 離心15 min，取180 μl離心后上層血漿于若干EP管中，分別向其中加入20 μl D 0、D 5血小板外泌體樣本。同時(shí)，向180 μl新鮮血漿中加入20 μl無(wú)菌PBS作為對(duì)照組。室溫下孵育30 min后使用全自動(dòng)凝血儀檢測(cè)加入外泌體、PBS后血漿的血漿凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)指標(biāo)，以秒(s)為單位。共采集5份不同健康人新鮮全血，以避免個(gè)體差異影響。其中每2份外泌體樣本使用同一份血漿。

1.3.4.2外泌體中凝血因子VII定量檢測(cè) 使用含有1% PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液分別對(duì)50 μl D 0、D 5外泌體進(jìn)行蛋白裂解，加入Loading buffer，98 ℃金屬浴5 min，4 ℃下12 000 r/min離心5 min。以10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；按照蛋白Maker條帶說(shuō)明書(shū)將PVDF膜剪開(kāi)；使用5% BSA封閉液對(duì)PVDF膜室溫下封閉1 h；于封閉液稀釋的一抗F 7(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶10 000)中4 ℃孵育過(guò)夜；1×TBST充分洗膜后，于封閉液稀釋的相應(yīng)二抗(1 ∶10 000)中室溫孵育1 h，經(jīng)1×TBST充分洗膜后加入化學(xué)發(fā)光工作液反應(yīng)5 min，采用ImageQuant化學(xué)發(fā)光成像分析儀進(jìn)行顯影。使用ImageJ軟件對(duì)其進(jìn)行半定量分析。

1.3.4.3外泌體對(duì)全血凝血功能的影響 靜脈采集五份不同健康人新鮮全血至枸櫞酸鈉的抗凝管中，顛倒混勻。取50 μl PBS及D 0、D 5外泌體樣本分別加至1 ml新鮮全血中，室溫下孵育1 h。在血栓彈力圖儀的通道上裝載普通杯，取上述含有外泌體、PBS的全血1 ml至試劑1瓶中，顛倒使之充分混勻，室溫下靜置4 min以激活血液，取340 μl試劑1瓶中血液至盛有20 μl試劑2的普通杯中。按照操作說(shuō)明書(shū)使用血栓彈力圖儀進(jìn)行各樣本的凝血時(shí)間(blood clotting time，R)、凝血速率(clotting rate，α角)、血塊形成時(shí)間(clot formation time，K)、血塊強(qiáng)度(clot intensity，MA)、凝血綜合指數(shù)(blood clotting index，CI)等指標(biāo)的檢測(cè)。

圖1 血小板外泌體鑒定 ×10 000

2 結(jié)果

2.1 血小板外泌體的鑒定血小板中外泌體經(jīng)Western blot法鑒定顯示，特異性免疫學(xué)標(biāo)志物TSG 101和CD 9在外泌體中出現(xiàn)富集，而非特異性免疫學(xué)標(biāo)志物Calnexin蛋白則在外泌體中未檢出(圖1A)。透射電鏡分析顯示為雙層膜結(jié)構(gòu)、類(lèi)杯狀外形(圖1B)。納米流式粒徑分析表明血小板中外泌體粒徑分布集中于60～80 nm，符合外泌體顆粒大小(圖1C)。

2.2 血小板外泌體濃度隨保存時(shí)間的變化納米流式結(jié)果顯示(表1、圖 2)，保存D 0、D 3、D 5血小板中外泌體顆粒濃度不同，分別為(13.86±7.93)×1012、(23.69±12.80)×1012、(45.81±25.87)×1012個(gè)/L。外泌體濃度隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而增加，且不同保存時(shí)間的外泌體濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D 3外泌體濃度為D 0的1.8倍(P<0.01)，D 5外泌體的顆粒濃度為D 0的4.0倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。D 5外泌體濃度約為D 3的2.2倍(P<0.05)。

2.3 不同保存時(shí)間血小板中外泌體對(duì)凝血功能的影響

2.3.1血小板中外泌體對(duì)血漿凝血功能的影響 不同保存時(shí)間血小板外泌體對(duì)凝血功能的影響結(jié)果如表2所示。與對(duì)照組相比，D 0與D 5組外泌體分別可使PT減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01、P<0.001)；同時(shí)，與對(duì)照組相比，D 0與D 5組外泌體分別使APTT減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.001)。

表1 不同保存時(shí)間手工血小板外泌體濃度

圖2 血小板中外泌體濃度隨保存時(shí)間的變化

2.3.2血小板外泌體中凝血因子VII的定量檢測(cè) Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示凝血因子VII在血小板保存0 d與5 d所分泌的外泌體中表達(dá)量存在差異。進(jìn)一步通過(guò)半定量軟件ImageJ檢測(cè)各條帶灰度值驗(yàn)證了該結(jié)果，相較于D 0，D 5組VII因子含量是D 0組的1.4倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

表2 不同保存時(shí)間血小板外泌體對(duì)PT、APTT的影響

表3 不同保存時(shí)間血小板外泌體的凝血作用

圖3 血小板外泌體中凝血因子VII表達(dá)差異

2.3.3血小板中外泌體對(duì)全血凝血功能的影響 D 5與D 0血小板外泌體對(duì)新鮮全血凝血指標(biāo)的影響見(jiàn)表3。凝血時(shí)間R值提示凝血因子活性，與PBS組、D 0組相比，D 5組外泌體使全血凝血時(shí)間降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(t=3.21，P<0.05)、(t=2.82，P<0.05)]，表明外泌體樣本具有促凝作用；與PBS組相比，D 0、D 5組外泌體可使K值減小，α角增大，CI指數(shù)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與PBS、D 0組相比，D5組外泌體樣本可使血液中MA值變大，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

已有相關(guān)文獻(xiàn)[9]證明血小板制備與保存過(guò)程中高離心力、劇烈震蕩、產(chǎn)生的激動(dòng)劑(二磷酸腺苷、凝血酶)、低溫(4 ℃)、堿性環(huán)境(pH >7.6)及酸性環(huán)境(pH<6.2)等因素都可使血小板發(fā)生活化，導(dǎo)致血小板EVs增加。微囊泡與外泌體作為血小板EVs兩種主要組成成分，Gao et al[10]研究了常溫震蕩保存條件下單采血小板中微囊泡的變化，結(jié)果顯示保存5 d時(shí)微囊泡含量是保存1 d時(shí)的3倍。而在本研究中則檢測(cè)了常溫震蕩保存手工血小板時(shí)其外泌體隨時(shí)間的變化，結(jié)果顯示外泌體隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)也呈增加趨勢(shì)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

Sinauridze et al[11]研究顯示血小板EVs促凝活性為活化血小板的50～100倍，其認(rèn)為這不僅歸因于促凝血磷脂的表面暴露，促凝血蛋白受體的密度增加也放大了促凝活性。研究[12]指出創(chuàng)傷導(dǎo)致的凝血障礙(trauma-induced coagulopathy，TIC)患者存活率降低時(shí)血小板EVs下降，Lopez et al[13]通過(guò)向出血大鼠模型輸注血小板EVs證明其在體內(nèi)發(fā)揮了促凝和改善酸中毒的作用。上述研究均未將微囊泡與外泌體分離，故無(wú)法明確二者作用大小。外泌體作為EVs重要組成部分，對(duì)其凝血功能的單獨(dú)研究較少。在本研究中，通過(guò)比較保存D 0與D 5血小板中外泌體對(duì)血漿的凝血作用顯示兩組PT、APTT與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血小板保存期間產(chǎn)生的外泌體可能通過(guò)內(nèi)、外源性凝血途徑發(fā)揮促凝作用。進(jìn)一步檢測(cè)兩組血小板外泌體對(duì)全血凝血功能的影響，結(jié)果顯示R值減小，提示凝血酶生成時(shí)間縮短，D 0與D 5外泌體中凝血因子活性存在差異。盡管兩組的K值、α角、MA等數(shù)值上存在差異，但P值顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是樣本量不足的原因。盡管外泌體與微囊泡均含有血小板來(lái)源蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA等成分，但這些生物活性物質(zhì)在外泌體與微囊泡上的表達(dá)并不一致。文獻(xiàn)[14]已證明促凝物質(zhì)PS在外泌體中不表達(dá)，外泌體可能存在與微囊泡相同的Va、Xa等各種凝血因子成分參與促凝作用。

本課題前期進(jìn)行了不同保存時(shí)間血小板中外泌體蛋白譜學(xué)的研究，結(jié)果顯示凝血因子VII在保存5天血小板外泌體中表達(dá)上調(diào)，因此對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)以分析因子VII在促凝反應(yīng)中的作用，結(jié)果顯示因子VII在D 5組外泌體中含量是D 0組的1.4倍，因此可以推測(cè)血小板在保存過(guò)程中分泌的外泌體可富集因子VII發(fā)揮促凝作用。因子III與VIIa形成復(fù)合物后促進(jìn)因子X(jué)a形成，導(dǎo)致凝血酶生成。這些凝血酶可促進(jìn)內(nèi)源性凝血途徑中凝血酶的生成。因子VII還可直接使因子IX裂解為IXa，從而進(jìn)一步擴(kuò)大內(nèi)源性凝血途徑的作用。因此，血小板保存過(guò)程中產(chǎn)生的外泌體發(fā)揮促凝作用，可能是由凝血因子VII參與內(nèi)、外源性凝血途徑介導(dǎo)的。此外，外泌體中富含的非編碼RNA等生物活性物質(zhì)可能也對(duì)其凝血作用產(chǎn)生調(diào)控作用。外泌體含量隨著血小板保存時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，脂質(zhì)在外泌體中不斷積累[15]，某些脂質(zhì)成分也有可能導(dǎo)致其凝血作用增強(qiáng)。外泌體可能通過(guò)凝血因子、脂質(zhì)、RNA等多種物質(zhì)同時(shí)調(diào)節(jié)促凝作用，因此，對(duì)于血小板外泌體中調(diào)節(jié)促凝功能的某種或多種生物活性物質(zhì)仍需進(jìn)一步探究。