鄭銀海，喻 瑩，黎桂珍，吳隆吉，劉玉婷，蒲興祥，李彬彬*

（廣東醫(yī)科大學(xué) 1.第二臨床醫(yī)學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞 523808；3.湖南省腫瘤醫(yī)院胸部?jī)?nèi)二科，湖南長(zhǎng)沙 410031）

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）占頭頸惡性腫瘤的90%以上，近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率明顯上升，已成為全球第八大惡性腫瘤[1]。鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽部上皮細(xì)胞的頭頸部惡性腫瘤，其病理類型主要為鱗狀細(xì)胞癌。NPC 發(fā)生具有明顯的種族、家族聚集性和地區(qū)差異，主要高發(fā)于我國(guó)南方及東南亞地區(qū)，其獨(dú)特的流行病學(xué)分布特點(diǎn)提示著遺傳因素在NPC 發(fā)生中起重要作用[2]?；蚪M改變是腫瘤的重要特征，這些改變包括點(diǎn)突變，插入/缺失，拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）以及結(jié)構(gòu)變異等。基因組改變隨腫瘤的發(fā)展而積累，進(jìn)而導(dǎo)致抑癌基因失活和癌基因激活，成為其主要致病因素之一[3]。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是反映個(gè)體遺傳差異的重要分子標(biāo)志，與多種腫瘤遺傳易感性有關(guān)。miR-423 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)miRNA，其表達(dá)異?；騍NP 參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后[4]，但其在HNSC 中的作用尚不很清楚。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析HNSC 組織中miR-423 的表達(dá)和CNV 表現(xiàn)，并進(jìn)一步探討其rs6505162 位點(diǎn)SNP 與NPC 易感性的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)集篩選和分析

1.1.1 miR-423 在HNSC 中的表達(dá)分析 利用TCGA可視化平臺(tái)UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)，在TCGA 數(shù)據(jù)集中檢索“HNSC”“hsa-miR-423”，分析miR-423 在HNSC 和正常對(duì)照組織中的表達(dá)，并分析其表達(dá)水平與患者組織學(xué)分級(jí)、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1.1.2 miR-423 在HNSC 中的CNV 分析 利用TCGA可視化平臺(tái)cBioPortal 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得Head and Neck Squamous Cell Carcinoma（TCGA，PanCancer Atlas）數(shù)據(jù)集，其中496 例HNSC 樣本具有完整的突變和CNV 資料。CNV 數(shù)據(jù)來(lái)源于Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 陣列平臺(tái)，使用GISTC2.0分析miR-423 的CNV 情況。下載對(duì)應(yīng)樣品的臨床信息，分析CNV 分布與患者年齡、性別、HPV 感染、組織學(xué)分級(jí)、TNM 分期和生存狀態(tài)的關(guān)系。

1.2 一般資料

選取2014 年1 月-2015 年12 月在湖南省腫瘤醫(yī)院確診的NPC 患者156 例（病例組）及健康體檢者195例（對(duì)照組）。病例組中男110 例，女46 例；平均年齡（47.78±11.28）歲。對(duì)照組中男128 例，女67 例；平均年齡（46.98±10.60）歲。兩組受試者的年齡及性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有病例均經(jīng)臨床病理組織活檢確診為鱗狀細(xì)胞癌，尚未接受放、化療治療，并排除合并其它原發(fā)和繼發(fā)腫瘤。對(duì)照組為體檢健康者，臨床和實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)檢查指標(biāo)正常，本人及家族無(wú)惡性腫瘤病史。研究方案通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，受試者均知情后簽署同意書。

1.3 miR-423 rs6505162 多態(tài)性分析

1.3.1 基因組DNA 提取 采集所有受試者的靜脈血各3 mL，采用北京天根生物技術(shù)有限公司的血液基因組DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，并測(cè)定其濃度和純度，-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析針對(duì) miR-423 rs6505162 位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成PCR 擴(kuò)增特異性引物，正向引物：5′-CCCCTCAGTCTTGCTTCGTA-3′，反向引物：5′-ACTTGAGCTTCTGCCAAGGA-3′。PCR反應(yīng)體系為：2× GoTaq Master Mix 7.5 μL，正向和反向引物各1 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O 至15 μL。采用限制性內(nèi)切酶Csp6 I（美國(guó)Thermo 公司）對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，紫外線凝膠成像系統(tǒng)拍照，并進(jìn)行基因分型。隨機(jī)抽取5%樣本送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 和GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用擬和優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析各基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律。采用非條件logistic 回歸模型分析各基因型和等位基因與鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-423 基因在HNSC 中的表達(dá)

利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCGA 中526 例樣本進(jìn)行分析，其中HNSC 組織482 例，正常對(duì)照組織44 例，結(jié)果如圖1A 所示，HNSC 中miR-423 mRNA 的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組織（P＜0.01）。分析miR-423 表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其在HNSC 中的表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性（圖1B～D）。

圖1 基于TCGA 數(shù)據(jù)的miR-423 在HNSC 中表達(dá)及與患者臨床病理特征的相關(guān)性

2.2 miR-423 基因在HNSC 中的CNV 分布

利用cBioPortal 對(duì)TCGA 中496 例HNSC 樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR-423 基因在HNSC 組織中未發(fā)現(xiàn)有氨基酸錯(cuò)義突變，但在125 例樣本中發(fā)生了CNV，變異率為25.20%，其中缺失（Shallow Deletion）45 例（9.07%）、正常（Diploid）371 例（74.8%）、擴(kuò)增（Gain）80 例（16.13%）（見圖2）。分析HNSC 組織中CNV 分布與患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CNV 分布與患者年齡和HPV 感染有關(guān)（P＜0.05），而與性別、組織學(xué)分級(jí)、TNM 分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存狀況無(wú)關(guān)（P＞0.05）（見表1）。

表1 HNSC 中 miR-423 CNV 分布與患者臨床病理特征的關(guān)系

圖2 基于TCGA 數(shù)據(jù)的HNSC 組織中 miR-423 基因CNV分布

2.3 miR-423 rs6505162 基因型分析

采用PCR-RFLP 和測(cè)序鑒定miR-423 rs6505162位點(diǎn)的基因型（見圖3A、B）。miR-423 rs6505162 位點(diǎn)擴(kuò)增目的片段大小為127 bp，經(jīng)酶切后有3 種基因型，AA 基因型僅有127 bp 1 條帶，CC 基因型出現(xiàn)108、19 bp 2 條帶，CA 基因型出現(xiàn)127、108 和19 bp 3 條帶。

圖3 miR-423 rs6505162 的基因型

2.4 miR-423 基因型和等位基因與NPC 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

基因型和等位基因頻率分布見表2。miR-423 rs6505162 在對(duì)照組和病例組中的基因型頻數(shù)分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P＞0.05），提示具有良好的群體代表性。rs6505162 各基因型在病例組和對(duì)照組中分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。采用非條件logistic 分析各基因型與鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，對(duì)年齡和性別校正后，在純合子模型（AAvsCC）、雜合子模型（CAvsCC）、顯性遺傳模型（AA+CAvsCC）和隱性遺傳模型（AAvsCC+CA）中均未發(fā)現(xiàn)各基因型與鼻咽癌易感性具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。但在等位基因模型（AvsC）中，與C 等位基因相比，攜帶A 等位基因可增加NPC 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR=1.419，95% CI 1.009～1.997，P=0.044）。

表2 miR-423 rs6505162 基因型和等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中的分布

3 討論

CNV 屬于染色體結(jié)構(gòu)變異，常由基因組重排導(dǎo)致，相比SNPs，其覆蓋了更大范圍的基因序列，可以捕獲更多的遺傳信息[5]。目前認(rèn)為，CNV 不僅是個(gè)體遺傳差異的基礎(chǔ)，也在體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。CNV 可能通過(guò)改變基因劑量、干擾編碼序列或干擾基因調(diào)控來(lái)影響基因表達(dá)、表型變異和表型適應(yīng)[3，5]。腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 已成為腫瘤細(xì)胞基因組變異檢測(cè)的重要生物標(biāo)志物。

miR-423 被發(fā)現(xiàn)是一個(gè)腫瘤相關(guān)miRNA，但其具體的功能依賴于不同的腫瘤類型。miR-423 在乳腺癌組織中呈明顯高表達(dá)，可通過(guò)靶向鋅指蛋白ZFP36 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，并與其化療抵抗相關(guān)[6]。miR-423 通過(guò)靶向調(diào)控轉(zhuǎn)移抑制基因BRMS1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲[7]。但也有研究顯示miR-423-5p 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯降低，并與腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)，通過(guò)激活caspase 通路誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[8]?；赥CGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組織相比，miR-423 在HNSC 組織中的表達(dá)明顯增高，提示其可能發(fā)揮癌基因的作用。進(jìn)一步分析miR-423 在HNSC 中的基因變異情況，未發(fā)現(xiàn)有氨基酸錯(cuò)義突變，但在125 例（25.20%）樣本中發(fā)現(xiàn)有CNV，其中80 例（16.13%）存在擴(kuò)增；此外，CNV 分布與病人年齡以及HPV 感染有關(guān)，提示miR-423 中CNV 可能影響其表達(dá)，參與HNSC 的發(fā)生、發(fā)展。

近年來(lái)，miRNA SNPs 為腫瘤遺傳易感性研究提供了新的思路。位于pri-miRNA、pre-miRNA 或成熟miRNA 基因序列中的SNPs 可能導(dǎo)致成熟miRNA水平變化、新miRNA 產(chǎn)生和miRNA 與靶序列結(jié)合效應(yīng)改變，影響miRNA 對(duì)靶基因的調(diào)控，進(jìn)而對(duì)腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和進(jìn)展產(chǎn)生影響。位于pre-miRNA 的miR-423 rs6505162 位點(diǎn)的SNP 被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)，但在結(jié)果上存在較大的分歧。Yin 等[9]研究發(fā)現(xiàn)miR-423 rs6505162 CA/AA 基因型可降低中國(guó)非吸煙女性人群肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，A 等位基因可能是一個(gè)保護(hù)性因素。但另一項(xiàng)研究則顯示該多態(tài)性與增高的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[10]，CA/AA 基因型被發(fā)現(xiàn)與較差的腫瘤預(yù)后相關(guān)[11]。本研究對(duì)湖南漢族人群中miR-423 rs6505162 SNP 與NPC 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)rs6505162 各基因型與鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯相關(guān)性，但在等位基因模型中，與C 等位基因相比，A 等位基因可增加NPC 易感性。本次對(duì)照組中的miR-423 rs6505162 最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）為0.226，與已報(bào)道中國(guó)南方人群MAF（0.229）接近，但明顯高于中國(guó)北京漢族人群（0.150）（https://asia.ensembl.org/）。這種分布的地區(qū)差異是否與鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，尚有待進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，miR-423 CNV 可能參與了HNSC 的發(fā)生，并且 rs6505162 A 等位基因可能對(duì)鼻咽癌易感性產(chǎn)生一定的影響，將為鼻咽癌遺傳學(xué)機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但由于本研究納入的樣本量較少，結(jié)果存在一定的局限性，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。