首都醫(yī)科大學(xué)（100069）金良韻 姬曼 孫竹林 楊慧 陳大興 趙君朋

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)為磷脂雙分子層的小囊泡，其直徑范圍在30nm～150nm之間，其在細(xì)胞膜上生成，后分泌到細(xì)胞外，其囊泡內(nèi)包含有蛋白質(zhì)、脂類等多種成分，作用主要是能夠與附近及遠(yuǎn)距離細(xì)胞進(jìn)行通訊聯(lián)系[1]。細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞間重要的信息傳遞器，因此可以被用作藥物傳遞系統(tǒng)或疾病生物標(biāo)志物[2]。外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊主要通過以下三種方式：一是外泌體膜蛋白可以與靶細(xì)胞膜蛋白結(jié)合，進(jìn)而激活靶細(xì)胞內(nèi)的信號通路。二是在細(xì)胞外基質(zhì)中，外泌體膜蛋白可以被蛋白酶剪切，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路。三是外泌體膜可以與靶細(xì)胞膜直接融合，非選擇性的釋放其所含的蛋白質(zhì)、mRNA以及microRNA。外泌體的提取可以分為以下幾種：超速離心法、過濾離心、密度梯度離心法、免疫磁珠法、ps親合法等提取方式。目前來說超速離心法是被應(yīng)用最廣泛的方法。本文用超速離心法對外泌體進(jìn)行提取，所用的改良版外泌體負(fù)染色中加入冷凍超薄切片試劑中的甲基纖維素（MC），由于其能對外泌體膜起到支撐作用，所以期待能得到更佳的外泌體形態(tài)電鏡圖像。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 收集正常小鼠血清樣品，采用超速離心法提取外泌體。2%多聚甲醛（PFA）購置于英國阿法埃莎公司（Alfa Aesar），用0.1M PBS液配置，并于4℃冰箱保存。1%戊二醛（GA）購置于英國阿法埃莎公司（Alfa Aesar），用0.1M PBS液配置。醋酸雙氧鈾（SPI），用超純水配成4%溶液，密閉、避光保存。2%甲基纖維素（MC）購于美國Sigma公司。200目方華膜加碳膜的銅網(wǎng)購自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司。日立-天美HT7700透射電子顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 醋酸雙氧鈾負(fù)染色方法 采用銅網(wǎng)懸浮法，進(jìn)行外泌體的附著和染色方法。操作如下：①將新鮮提取外泌體固定在50～100μl的2%PFA中。②取沉淀5μl，在銅網(wǎng)上孵育20min。③將銅網(wǎng)倒扣在50μl醋酸雙氧鈾液滴上，孵育5min。④轉(zhuǎn)移到100μl的雙蒸水液滴中漂洗2min。⑤濾紙吸干、迅速烤干后，于透射電子顯微鏡下觀察。

附圖1 普通醋酸雙氧鈾染色的結(jié)果。a：低倍可見外泌體形態(tài)不規(guī)則，膜結(jié)構(gòu)（）有塌陷。標(biāo)尺=500nm；b：高倍可見外泌體立體結(jié)構(gòu)不明顯，形態(tài)不規(guī)則，且外泌體膜（）有塌陷。標(biāo)尺=200nm

附圖2 改良版負(fù)染色的結(jié)果。a：低倍可見外泌體形態(tài)基本規(guī)則，立體結(jié)構(gòu)明顯，膜結(jié)構(gòu)（）光滑飽滿。標(biāo)尺=200；b：高倍可見外泌體大小集中在80nm～120nm之間，主要是膜結(jié)構(gòu)光滑、飽滿，反差明顯，觀察效果佳。標(biāo)尺=200nm

2 結(jié)果

2.1 普通醋酸雙氧鈾染色的結(jié)果 見附圖1。

2.2 改良版負(fù)染色法的結(jié)果 見附圖2。

3 討論

用負(fù)染色的方法在透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài)，是目前最可靠的方法，需要在透射電子顯微鏡下找到其符合外泌體形態(tài)特征的囊泡[3]。負(fù)染色方法的原理是利用高密度的、在透射電鏡下不顯示結(jié)構(gòu)的重金屬鹽，將生物標(biāo)本包圍起來，以增強(qiáng)背景散射電子的水平，吸附了重金屬鹽的樣品的超微結(jié)構(gòu)在黑暗的背景上顯示陰性反差[4]。而負(fù)染色既簡單便捷、又節(jié)省試劑耗材，都是其優(yōu)點(diǎn)，故而使其廣泛應(yīng)用在細(xì)菌、病毒、大分子結(jié)構(gòu)的研究中，也是透射電子顯微技術(shù)中一項(xiàng)重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段。

目前幾種方法中醋酸雙氧鈾染色效果被認(rèn)為是最佳，但是仍然有其局限性和不足，故本實(shí)驗(yàn)針對其不足補(bǔ)充了甲基纖維素(MC)和鈾(UA)混合液進(jìn)行雙染的方法，對其膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化染色?？梢姼牧己蟮耐饷隗w形態(tài)結(jié)構(gòu)更完整，外泌體膜結(jié)構(gòu)更光滑，立體結(jié)構(gòu)也更明顯。MC第一次在電子顯微鏡技術(shù)中常規(guī)使用在干燥過程中支持醛固定的冷凍超薄切片技術(shù)中。當(dāng)重金屬被包裹在薄膜中時(shí)，MC可以防止膜結(jié)構(gòu)的崩塌，并能夠出現(xiàn)顯著均勻度對比。從早期的冷凍實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，研究表明尤其在小的細(xì)胞器，如外泌體、內(nèi)小體、自噬體的分離膜中起到支持和對比方面的作用[5]。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者證實(shí)了含有醋酸雙氧鈾的MC膜在脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的對比上提供了顯著的改進(jìn)，優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用醋酸雙氧鈾的負(fù)染色。這種MC嵌入染色程序提供了吸附粒子的全面可視化，并限制了這些軟生物結(jié)構(gòu)的膜崩潰。MC和UA的雙染方法有可能大大改善常規(guī)表征和定量的廣泛的合成以及自然發(fā)生的膜結(jié)構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)中需要注意的細(xì)節(jié)有：①應(yīng)用甲基纖維素試劑時(shí)，應(yīng)該在冰上操作。②筆者盡量用新鮮提取的外泌體樣本，直接浸在PFA液體中，以及時(shí)固定膜結(jié)構(gòu)，固定后可在4℃冰箱保存一周，越早做結(jié)構(gòu)越好。③應(yīng)避免對提出的外泌體樣本進(jìn)行反復(fù)-20℃或-80℃的凍融，而對囊泡的形態(tài)造成影響。④使用醋酸雙氧鈾時(shí)，注意避光處理，并且注意輻射危害并妥善處理染液。

雖然用負(fù)染色對外泌體進(jìn)行形態(tài)鑒別是現(xiàn)在常用的手段，但也存在不足及有待改進(jìn)。也可以用特異性抗體對外泌體進(jìn)行標(biāo)記，以區(qū)分提取過程中混入的微泡?；蛘哂美鋬鲭娮语@微鏡直接觀察外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，當(dāng)然這種方法無需化學(xué)固定劑，也就避免了化學(xué)固定中的結(jié)構(gòu)變化，故可以最大程度的保存生物活性[2]。所以，也期待著后續(xù)隨著對外泌體的研究更加的深入，以便能更加明確外泌體的機(jī)制，對臨床的應(yīng)用提供更有價(jià)值的研究思路。