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磷酸化扁藻胞外多糖的修飾及其抗腫瘤活性研究

2023-01-09 12:20易志恒翁正芬溫俊昊劉梓茂吳斌華
關(guān)鍵詞:磷酸磷酸化試劑

易志恒,翁正芬,溫俊昊,劉梓茂,羅 輝,2,3,吳斌華,2,3*

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)海洋醫(yī)藥研究院、廣東省天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室和第一臨床醫(yī)學(xué)院;2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室;3.廣東湛江海洋醫(yī)藥研究院,廣東湛江 524023)

多糖的生物活性與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān),對多糖分子結(jié)構(gòu)進行修飾,可以提高多糖的活性[1]。分子修飾方法有多種,其中主要是化學(xué)修飾?;瘜W(xué)修飾的常見方法包括硫酸化修飾、烷基化修飾、羧甲基化修飾、磷酸化修飾等[2]。本文通過參考多糖磷酸化修飾的相關(guān)文獻[2-6],選取影響扁藻多糖磷酸(PEPs)根含量和多糖產(chǎn)量的4 個因素進行研究,通過正交設(shè)計初步確定了扁藻多糖磷酸化的最佳工藝條件,并初步探討磷酸化扁藻胞外多糖(pPEPs)的抗腫瘤活性,旨在為磷酸化扁藻胞外多糖的研究和開發(fā)提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

RE-5210A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海榮生生化儀器廠)、JXN-300 冷凍離心機(美國Beckman 公司)、FD-1A-50冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)、IRTracer-100 傅立葉紅外吸收光度計(日本島津公司)、Epoch 酶標(biāo)儀(BioTek Instrument)等。PEPs(由本實驗室提取獲得),三偏磷酸鈉(分析純,上海麥克林生化科技有限公司),三聚磷酸鈉(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠),三羥甲基氨基甲烷、氯化鎂、鹽酸、維生素C、硫酸、鉬酸銨、磷酸二氫鉀、過氧化氫等試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 pPEPs 的制備 參考鄭常領(lǐng)等[3]的方法,略作修改。按比例稱取磷酸化試劑(6 g 三聚磷酸鈉+1 g 三偏磷酸鈉)共7 g,溶解在超純水中,定容至100 mL,得到總質(zhì)量濃度為70 g/L 的磷酸化試劑。定容后加入精制的PEPs 1 g,硫酸鈉5 g,調(diào)節(jié)pH 值和溫度至設(shè)定值后進行磷酸化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,用3 倍體積的95%乙醇溶液靜置沉淀24 h,5 000 r/min 離心10 min 收集沉淀,置于45 ℃的環(huán)境下2 h,以去除殘留的乙醇,再于50 ℃水浴中復(fù)溶,后裝入截留分子量為1 000 透析袋,透析2 d。得到的溶液預(yù)凍后置于冷凍干燥機中冷凍干燥,得到pPEPs。

1.2.2 磷酸根含量的測定(1)磷酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線測定:根據(jù)鉬藍比色法[4]繪制磷酸根含量標(biāo)準(zhǔn)曲線,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)pPEPs中的磷酸根測定:取0.10 g 樣品于燒杯中,加入1 mL濃硫酸和1 mL 濃硝酸,加熱至冒煙,冷卻后加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為30%的 H2O2溶液,再緩慢加熱,重復(fù)以上步驟直至燒杯內(nèi)不再冒煙,溶液呈無色透明或淡黃色,冷卻后加入1 mL 濃度為6 mol/L 鹽酸,加熱使酸徹底分解,轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中定容。取適量上述溶液,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算磷酸根含量。

1.2.3 PEPs 磷酸化反應(yīng)正交實驗 參考相關(guān)文獻[2-7],采用正交試驗設(shè)計方法,選取磷酸化實驗中磷酸化試劑比例(A)、溫度(B)、時間(C)和pH(D)為考察因素,每個因素選取3 個水平(見表1),選用L9(34)正交表進行正交實驗。

表1 正交實驗因素與水平

1.2.4 紅外光譜分析 使用傅立葉變換紅外光譜儀測定多糖的紅外光譜。PEPs 及其磷酸化產(chǎn)物分別與干燥的溴化鉀研磨均勻后壓片,在4 000~500/cm 的波長范圍內(nèi)進行測量。

1.2.5 MTT 實驗 采用MTT 法進行檢測pPEPs 對腫瘤細胞的活性,檢測方法參考相關(guān)文獻[8-10]。用胰酶消化處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的小鼠Raw264.7 巨噬細胞,然后重懸。接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi),使每孔細胞密度為1×104個,置于5% CO2、37 °C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h使其貼壁,正常細胞對照組加等量細胞和培養(yǎng)液正常培養(yǎng),空白對照組加等量培養(yǎng)基而不加細胞,給藥組給予PEPs 和pPEPs,質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、250 mg/L,每個質(zhì)量濃度設(shè)置5 個復(fù)孔,藥物與細胞作用24 h,每孔加入20 μL 的MTT 溶液(5 g/L),并繼續(xù)放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h;培養(yǎng)結(jié)束后棄去上清,每個復(fù)孔加入150 μL 的DMSO 溶液,用錫紙包裹避光,于搖床上震蕩10 min 使結(jié)晶徹底溶解。采用酶標(biāo)儀檢測570 nm 處各孔吸光度值(OD)。細胞存活率=(OD樣品-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS23.0 軟件分析,極差分析尋找各水平因素對多糖產(chǎn)率及多糖磷酸根含量的影響,極差較大的因素為對該因變量影響較大的因素。采用Graphpad Prism 8.0 軟件分析MTT 實驗結(jié)果,組間比較采用t檢驗、單因素方差分析,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)鉬藍比色法繪制的磷酸根含量標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖1 所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=19.265x+0.0214,相關(guān)系數(shù)0.9876,顯示相關(guān)性良好。

圖1 磷酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 扁藻胞外多糖磷酸化反應(yīng)正交實驗

以產(chǎn)率為指標(biāo)的結(jié)果顯示:影響因素B>A>D>C;以磷酸根含量為指標(biāo)的結(jié)果顯示:影響因素B>D>A>C。綜合兩個指標(biāo)的影響,確定當(dāng)磷酸化試劑比例為6∶1,反應(yīng)溫度為100 ℃、反應(yīng)時間為6 h、反應(yīng)pH=8 時為最佳的反應(yīng)條件,見表2。

表2 正交實驗及結(jié)果

2.3 紅外光譜

采用傅立葉變換紅外光譜儀進行紅外吸光度檢測,在3 414.0/cm 處存在吸收峰,為-OH 特征吸收峰,較未磷酸化多糖吸收峰強度弱;1 620.21/cm 處出現(xiàn)C=O 特征吸收峰,并且存在氫鍵,較未磷酸化多糖吸收峰強度弱;在999.13/cm 處的相關(guān)吸收峰為吡喃環(huán)上C-O-C 的特征吸收峰,此外,pPEPs 在1 265.30/cm處出現(xiàn)特征性的P=O 伸縮振動吸收峰,而891.11/cm處出現(xiàn)P-O-C 鍵的吸收峰。見圖2、3。

圖2 扁藻胞外多糖紅外吸收光譜

2.4 對Raw264.7 的生長抑制作用

在100~250 mg/L 的質(zhì)量濃度時,PEPs 組和pPEPs組的細胞存活率均低于對照組(P<0.05 或0.01),以pPEPs 組更為顯著(P<0.05 或0.01)。在150~250 mg/L的質(zhì)量濃度時,pPEPs 組的細胞存活率明顯低于PEPs組(P<0.05 或0.01),見圖4。

圖4 PEPs 和pPEPs 對Raw264.7 細胞的影響

3 討論

湛江毗鄰南海,屬于熱帶北緣季風(fēng)氣候,海洋資源豐富,扁藻是其豐富的海產(chǎn)之一,容易獲得,生存力強,易于培養(yǎng),且營養(yǎng)豐富,具有很高的研究價值。該文通過參考劉梓茂等[11]的方法培養(yǎng)扁藻并提取其胞外多糖進行研究。

多糖自身的結(jié)構(gòu)可以影響多糖的生物活性,其中多糖糖苷鍵的類型、主鏈的構(gòu)型、支鏈的性質(zhì)是影響多糖活性的主要因素,改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)可增強其活性以及靶向性[12]。已知多糖常用的化學(xué)修飾方法有硫酸化、羧甲基化、乙?;?、硒化、磺酰化、磷酸化、雙基團衍生化等。各種修飾方法各有優(yōu)點,硫酸化修飾多糖的方法種類較多,硫酸化多糖的突出特點為具有抗病毒(抗HIV 病毒、流感病毒、巨噬細胞病毒)活性。羧甲基化修飾具有試劑易得、成本較低、制備過程簡單及反應(yīng)所生成的物質(zhì)低毒或無毒等優(yōu)點。甲基化多糖的突出特點為能有效提高多糖的水溶性。乙?;揎椌哂蟹磻?yīng)速度快、反應(yīng)溫和、產(chǎn)物轉(zhuǎn)換率高等優(yōu)點,乙?;嗵窃龃罅硕嗵堑娜芙舛龋渚哂锌鼓[瘤、抗氧化、抗凝血及疫調(diào)節(jié)等活性。硒是人體生命活動的必需元素,因此硒化多糖兼有硒的強抗氧化性和多糖的抗腫瘤、抗病毒及抗輻射等生物活性。磷酸化多糖具有很強的抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等生物活性,且磷酸化修飾的原料三偏磷酸鈉及三聚磷酸鈉等磷酸鹽廉價易得且不易引起多糖的降解[13],所以該文選擇了磷酸化來修飾多糖。

采用傅立葉變換紅外光譜儀進行紅外吸光度檢測,可推斷該多糖為吡喃型多糖[12]。與PEPs 相比,pPEPs 仍含有PEPs 的特征性吸收峰,說明多糖的主體結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化,仍是吡喃型多糖。此外,pPEPs在1 265.30/cm 處出現(xiàn)特征性的P=O 伸縮振動吸收峰,而891.11/cm 處出現(xiàn)P-O-C 鍵的吸收峰,因此可推斷該扁藻胞外多糖成功磷酸化修飾[3,11]。三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉在480~550/cm 范圍內(nèi)有其特征性吸收峰[PO34-][13],由圖1 和圖2 的對比,磷酸化后的扁藻胞外多糖紅外光譜中,在505/cm 有明顯的吸收峰,而在未磷酸化的多糖紅外光譜中未出現(xiàn)過,說明經(jīng)磷酸化后,多糖分子結(jié)合上了磷酸基團。

影響多糖磷酸化結(jié)果的因素有反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、磷酸化試劑比例和pH 值,參考相關(guān)文獻的單因素實驗[3,5,14],多糖磷酸化的最適反應(yīng)條件區(qū)間分別為:反應(yīng)時間4~8 h,反應(yīng)溫度80~100 ℃,磷酸化試劑比例4∶3~6∶1,pH 值8~10。該文選取這些區(qū)間為反應(yīng)條件經(jīng)行正交實驗,得出扁藻胞外多糖pPEPs 的磷酸根含量的主次因素為反應(yīng)溫度>pH 值>磷酸化試劑比例>反應(yīng)時間。影響pPEPs 產(chǎn)率的主次因素為反應(yīng)溫度>磷酸化試劑比例>pH 值>反應(yīng)時間。綜合考慮反應(yīng)條件對磷酸根含量和產(chǎn)率的影響,確定制備pPEPs 的最佳工藝條件為m(三聚磷酸鈉)∶m(三偏磷酸鈉)=6∶1、反應(yīng)溫度為100 ℃、反應(yīng)時間為6 h、pH 值=8,磷酸化扁藻胞外多糖中磷酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為10.69%。通過參考文獻[2,4,15]進行比較,得出本實驗中的磷酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)處于較高的水平。猜測可能與實驗中三偏磷酸鈉占比較高,使得多糖分子能結(jié)合較多的磷酸基團有關(guān),并且本實驗中透析時間較長,能更好的濾過磷酸化試劑和未磷酸化的多糖,從而提高了產(chǎn)率。

細胞的死亡具有多種不同的發(fā)生機制,包括凋亡、壞死性凋亡、焦亡、鐵死亡、自噬等[16]。近期研究表明多糖類成分抗腫瘤作用是通過抑制腫瘤細胞生長、免疫調(diào)節(jié)及細胞凋亡等途徑實現(xiàn)[17-18]。Lyuksutova等[19]對(1-3)-β-D-葡聚糖進行磷酸化修飾,研究發(fā)現(xiàn)其免疫生物活性機制為磷酸化β-D-葡聚糖通過與膜受體細胞的相互作用而結(jié)合免疫細胞,激發(fā)機體多種自然免疫反應(yīng)。Huang 等[20]對(1-3)-α-D-葡聚糖進行磷酸化修飾,研究發(fā)現(xiàn)磷酸化多糖的增強抗腫瘤活性的機制為激活機體的免疫應(yīng)答,促進免疫細胞的增殖與分化。其體外抗S-180 腫瘤細胞IC50 可達0.01 g/L。張忠等[21]采用單磷酸鹽法對靈芝β-葡聚糖進行磷酸化修飾,發(fā)現(xiàn)所制得的磷酸化衍生物對腫瘤細胞K562 和L1210 增殖在一定程度上有抑制作用,且抑制作用與其磷酸根取代度有關(guān),取代度越大,抑制作用越強。本研究采用體外MTT 法考察了PEPs 和pPEPs 對raw 264.7 細胞增殖的抑制作用。實驗發(fā)現(xiàn),在100~250 mg/L 的質(zhì)量濃度時,PEPs 組和pPEPs 組的細胞存活率均低于對照組(P<0.05 或0.01),以pPEPs組更為顯著(P<0.05 或0.01)。在150~250 mg/L 的質(zhì)量濃度時,pPEPs 組的細胞存活率明顯低于PEPs 組(P<0.05 或0.01),說明PEPs 與pPEPs 對Raw 264.7 細胞的增殖均具有一定的抑制作用,且pPEPs 組的細胞抑制率高于PEPs 組。表明磷酸化修飾的方法能提高扁藻胞外多糖的抗腫瘤活性,磷酸化扁藻胞外多糖具有一定的抗腫瘤應(yīng)用前景,本研究可為扁藻胞外多糖相關(guān)功能食品、醫(yī)藥產(chǎn)品和化學(xué)工業(yè)品的開發(fā)提供理論參考。

正交法制備磷酸化扁藻胞外多糖的工藝簡單,原料容易獲得,在今后開發(fā)中有一定的優(yōu)勢,這為其在工業(yè)中的應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)。實驗顯示,扁藻胞外多糖經(jīng)磷酸化修飾后能增強其抑制腫瘤細胞增殖的作用,這可能是由于多糖經(jīng)過磷酸化修飾后其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了衍生,增加了藥物的活性,增強了抗腫瘤細胞增殖的作用。而且磷酸化可以提高藥物的溶解穩(wěn)定性,減少藥物的應(yīng)用濃度和劑量,但磷酸化扁藻胞外多糖具體的抗腫瘤機理目前尚不明確,仍需進行進一步探討研究。

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