劉悅越，趙榮榮，英志芳，王劍鋒，邵 銘，李長(zhǎng)貴

(中國(guó)食品藥品檢定研究院呼吸道病毒疫苗室，北京 102629；*通訊作者,E-mail:changguili@aliyun.com)

脊髓灰質(zhì)炎(以下簡(jiǎn)稱脊灰)是由脊髓灰質(zhì)炎病毒感染引起的兒童急性傳染病，嚴(yán)重者可致癱瘓[1]，俗稱小兒麻痹癥，是20世紀(jì)中葉影響全球的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。20世紀(jì)50年代研發(fā)并批準(zhǔn)的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(inactivated polio vaccine, IPV)在消滅脊灰方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[2]。尤其是它安全、不會(huì)發(fā)生病毒回復(fù)突變的特點(diǎn)使其成為全球消滅脊灰最后階段的主要工具[3,4]。

IPV是將3種血清型脊灰病毒接種于細(xì)胞，經(jīng)病毒培養(yǎng)，通過(guò)收集上清，濃縮、純化，并經(jīng)甲醛滅活后按比例混合制成[5]。為了保證疫苗質(zhì)量，對(duì)疫苗生產(chǎn)的各階段及成品均需進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè)和控制。效力試驗(yàn)是評(píng)估IPV免疫原性的關(guān)鍵項(xiàng)目，包括體內(nèi)和體外試驗(yàn)[6]。根據(jù)《歐洲實(shí)驗(yàn)用脊椎動(dòng)物保護(hù)公約》要求，在有合適的替代實(shí)驗(yàn)并經(jīng)充分驗(yàn)證的情況下，盡可能放棄體內(nèi)方法進(jìn)行分析和評(píng)估疫苗效力[7]。D抗原主要表達(dá)在脊髓灰質(zhì)炎病毒顆粒表面，是保護(hù)性免疫原，主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，因此D抗原含量被用作脊灰疫苗效力評(píng)價(jià)體外方法的檢測(cè)指標(biāo)[8]。最常用的D-Ag含量檢測(cè)是間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法，于1980年首次開(kāi)發(fā)，以其靈敏度高、省時(shí)的優(yōu)勢(shì)取代了凝膠擴(kuò)散法[9]。目前已廣泛用于評(píng)估IPV的D-Ag含量。

隨著人工智能科技的發(fā)展和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的樣本處理需求日益增長(zhǎng)，人們?cè)O(shè)計(jì)了用于液體樣品的處理、稀釋、轉(zhuǎn)移等步驟的自動(dòng)化液體處理工作站[10]。為了減少人力投入，提高實(shí)驗(yàn)的效率和精度，本研究旨在將自動(dòng)化液體處理工作站應(yīng)用于D抗原的ELISA檢測(cè)中。以吸附無(wú)細(xì)胞百白破滅活脊髓灰質(zhì)炎和b型流感嗜血桿菌(結(jié)合)聯(lián)合疫苗中的D抗原檢測(cè)項(xiàng)目為研究對(duì)象，探索由工作站代替手動(dòng)操作完成實(shí)驗(yàn)流程的可行性。

1 材料和方法

1.1 疫苗

吸附無(wú)細(xì)胞百白破滅活脊髓灰質(zhì)炎和b型流感嗜血桿菌(結(jié)合)聯(lián)合疫苗由賽諾菲巴斯德公司提供。

1.2 主要試劑及儀器

酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司(批號(hào)：01721001)，96孔稀釋板購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司(批號(hào)：J191605J)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒包被抗體和捕獲抗體由賽諾菲巴斯德公司提供，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自荷蘭Nordic MUbio公司(批號(hào)：16461)，底物ABTS購(gòu)自美國(guó)Millipore公司(批號(hào)：3593731)，終止液購(gòu)自索萊寶公司(批號(hào)：20211202)。酶標(biāo)儀(型號(hào)：Infinite M200 Pro)和全自動(dòng)移液工作站(型號(hào)：EVO200)均購(gòu)自瑞士帝肯公司。

1.3 D抗原檢測(cè)手動(dòng)操作方法

1.3.1 包被酶標(biāo)板 將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型包被抗體按一定稀釋比例稀釋后分別加入不同酶標(biāo)板中，50 μl/孔，2～8 ℃過(guò)夜。

1.3.2 樣品處理及稀釋 將疫苗樣品與等體積的解吸附液充分混合，37 ℃孵育5 h，3 578g離心5 min，取上清液作為待測(cè)樣品。用樣品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品11倍預(yù)稀釋。向96孔稀釋板中加入樣品稀釋液，250 μl/孔，第2行除外。將預(yù)稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入稀釋板第2行的第2，5，8孔，待測(cè)樣品加入稀釋板第2行的其他孔，500 μl/孔，用電動(dòng)多道移液器由第2行向第7行對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品進(jìn)行2倍倍比稀釋。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 將包被板用洗液洗滌4次后，加封閉液200 μl/孔，室溫孵育1 h。拍干后，將稀釋板中液體轉(zhuǎn)移到不同型別的包被板中，50 μl/孔，37 ℃孵育2 h。洗板4次，加入相應(yīng)型別的捕獲抗體，50 μl/孔，37 ℃孵育1 h。洗板4次，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，50 μl/孔，37 ℃孵育1 h。洗板4次，加入底物ABTS，50 μl/孔，避光室溫顯色15 min，加入終止液50 μl/孔終止反應(yīng)。將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中以405/630 nm測(cè)定吸光度值。

1.4 D抗原檢測(cè)工作站操作方法

解吸附和標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋均與手動(dòng)操作相同，在工作站中編入如下操作程序。

1.4.1 包被 分別從1，2，3號(hào)加樣槽中取包被液分裝至酶標(biāo)板中，50 μl/孔。每3塊酶標(biāo)板為1組，其中板1包被Ⅰ型脊灰抗體，板2包被Ⅱ型脊灰抗體，板3包被Ⅲ型脊灰抗體。分裝結(jié)束后，取出酶標(biāo)板放置于2～8 ℃過(guò)夜。

參數(shù)設(shè)置：分裝包被液為L(zhǎng)IHA加液模式，吸液速度150 μl/s，噴液速度600 μl/s。

1.4.2 封閉、稀釋與加樣 按順序?qū)⒚笜?biāo)板轉(zhuǎn)移至洗板機(jī)洗板，從封閉液槽中取封閉液分裝至酶標(biāo)板中，200 μl/孔，室溫孵育1 h。從稀釋液槽中取稀釋液分裝至稀釋板中，第2行除外，200 μl/孔，從樣品管中取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入稀釋板的相應(yīng)位置中，400 μl/孔。2倍倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品至第7行。吸干酶標(biāo)板中液體后，將稀釋板中各孔液體分裝至3個(gè)型別酶標(biāo)板中，50 μl/孔。

參數(shù)設(shè)置：分裝封閉液和稀釋液為L(zhǎng)IHA加液模式，吸液速度150 μl/s，封閉液的噴液速度600 μl/s，稀釋液的噴液速度400 μl/s；將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品從樣品管轉(zhuǎn)移至稀釋板為L(zhǎng)IHA加液模式，吸液速度100 μl/s，噴液速度400 μl/s；倍比稀釋為MCA混勻模式，吸液速度80 μl/s，噴液速度400 μl/s；稀釋后樣品轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板為MCA加液模式，吸液速度80 μl/s，噴液速度200 μl/s。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 將加好樣的酶標(biāo)板置于37 ℃加熱模塊孵育2 h，之后洗板，加捕獲抗體、酶標(biāo)二抗、底物和終止液步驟與手工操作相同。終止反應(yīng)后由機(jī)械臂將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中以405/620 nm測(cè)定吸光度值。

參數(shù)設(shè)置：分裝捕獲抗體、酶標(biāo)抗體、底物和終止液為L(zhǎng)IHA加液模式，吸液速度150 μl/s，噴液速度600 μl/s。

1.5 結(jié)果計(jì)算及驗(yàn)證分析

1.5.1 D抗原含量計(jì)算 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的吸光度值用平行線法計(jì)算疫苗的D抗原濃度，結(jié)果以D抗原單位/劑量(DU/劑)表示。藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中成品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分別為20～43、5～9、17～36 DU/劑。

1.5.2 相關(guān)性分析 分別用手工操作和工作站操作方法測(cè)定10批疫苗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型的D抗原含量。使用SPSS 23.0對(duì)手動(dòng)操作結(jié)果和工作站結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，由于2種方法結(jié)果的差值不成正態(tài)分布，采用非參數(shù)兩個(gè)相關(guān)樣本的Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)分析2種方法的結(jié)果，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用GraphPad Prism 8.0軟件將手動(dòng)操作結(jié)果與工作站結(jié)果繪制散點(diǎn)圖，通過(guò)Pearson相關(guān)性分析對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)r值，以P<0.05為相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5.3 精密性驗(yàn)證

1.5.3.1 試驗(yàn)內(nèi)精密性 在同一工作日重復(fù)測(cè)定6批疫苗3個(gè)型別的D抗原含量，每批疫苗重復(fù)測(cè)定6次。將測(cè)定結(jié)果以e為底取對(duì)數(shù)，計(jì)算每批結(jié)果的幾何變異系數(shù)(geometric coefficients of variation, GCV)。

1.5.3.2 試驗(yàn)間精密性 為考察不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間對(duì)精密度的影響，分別在3個(gè)工作日重復(fù)測(cè)定6批疫苗3個(gè)型別的D抗原含量。將測(cè)定結(jié)果以e為底取對(duì)數(shù)，計(jì)算每批結(jié)果的幾何變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 工作站的D抗原檢測(cè)結(jié)果

用工作站分別對(duì)10批疫苗樣品進(jìn)行單次檢測(cè)，6批疫苗樣品進(jìn)行6次試驗(yàn)內(nèi)重復(fù)檢測(cè)，另6批疫苗樣品進(jìn)行3次試驗(yàn)間重復(fù)檢測(cè)，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)(見(jiàn)圖1)，與手工操作結(jié)果一致。

圖1 工作站和手工操作的D抗原檢測(cè)結(jié)果Figure 1 The determination results of D-antigen by workstation and manual operation

2.2 工作站操作與手動(dòng)操作結(jié)果的相關(guān)性

對(duì)2種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行非參數(shù)兩個(gè)相關(guān)樣本的Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)顯示，兩種方法測(cè)定結(jié)果的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。對(duì)于3個(gè)型別的D抗原，2種方法測(cè)定結(jié)果的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.7，0.7，0.9，2種方法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2)。

圖2 工作站與手工操作結(jié)果的相關(guān)性Figure 2 Correlation between determination results by workstation and manual operation

表1 工作站與手工操作結(jié)果的差異Table 1 Differences between the results by workstation and manual operation

2.3 工作站操作的精密性

2.3.1 試驗(yàn)內(nèi)精密性 用工作站同時(shí)對(duì)疫苗樣品的3個(gè)型別D抗原進(jìn)行6次平行檢測(cè)，每批疫苗的檢測(cè)結(jié)果均在均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)，且GCV為1.48%～7.19%(見(jiàn)表2)。

表2 工作站的試驗(yàn)內(nèi)精密性結(jié)果Table 2 The results of intra-assay precision by workstation

2.3.2 試驗(yàn)間精密性 用工作站在不同時(shí)間對(duì)6批疫苗樣品的3個(gè)型別D抗原進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，每批疫苗的檢測(cè)結(jié)果均在均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)，且GCV為0.72%～8.55%(見(jiàn)表3)。

表3 工作站的試驗(yàn)間精密性結(jié)果Table 3 The results of inter-assay precision by workstation

3 討論

D抗原含量ELISA測(cè)定是一種公認(rèn)的評(píng)價(jià)含脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗效力的方法，該方法的使用貫穿疫苗生產(chǎn)從原液到成品的各個(gè)階段，是IPV配制時(shí)投料比例的主要依據(jù)，也確保在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中的一致性。目前我國(guó)已有2家企業(yè)生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗通過(guò)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)預(yù)認(rèn)證[11]，意味著我國(guó)的國(guó)產(chǎn)疫苗不僅用于國(guó)內(nèi)預(yù)防接種，還需滿足聯(lián)合國(guó)的采購(gòu)需求，大大增加了疫苗生產(chǎn)和質(zhì)量控制需要。為了減少在疫苗效力評(píng)價(jià)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)人員大量的重復(fù)性操作，并降低人為因素產(chǎn)生的誤差對(duì)后續(xù)生產(chǎn)和質(zhì)量控制的影響，本研究探索將自動(dòng)化液體處理工作站應(yīng)用于D抗原含量測(cè)定。

本研究使用的全自動(dòng)移液工作站包括LIHA和MCA兩種機(jī)械臂，其中LIHA為8通道處理液體，每個(gè)通道能夠獨(dú)立操作，機(jī)械臂從左往右移動(dòng)；MCA為96通道處理液體，工作時(shí)從里向外移動(dòng)。根據(jù)兩機(jī)械臂自身的特點(diǎn)，本研究設(shè)計(jì)LIHA主要進(jìn)行取樣、分配封閉液、稀釋液、抗體、底物等液體，MCA主要進(jìn)行樣品稀釋和整板轉(zhuǎn)移的操作。由于MCA的最大量程為200 μl，使用工作站進(jìn)行樣品稀釋時(shí)，將稀釋的體積由手工操作的250 μl調(diào)整到200 μl。后續(xù)的操作步驟為將稀釋好的樣品通過(guò)MCA機(jī)械臂整板轉(zhuǎn)移至3個(gè)型別的包被板，50 μl/孔，即在稀釋板中每孔至少需要150 μl，機(jī)械臂能夠一次性吸取樣品，分液至3塊板中，減少了反復(fù)吸液造成的液體損失，因此稀釋板中200 μl/孔的終體積能夠滿足后續(xù)的50 μl/孔分液操作。對(duì)于參考波長(zhǎng)，工作站自帶的酶標(biāo)儀缺少630 nm濾光片，在最終讀取酶標(biāo)板吸光值時(shí)由手工操作的630 nm調(diào)整為620 nm。620～690 nm測(cè)量的吸光度是非特異的，主要來(lái)自于酶標(biāo)板孔上灰塵、臟物等所致的吸收，在實(shí)驗(yàn)中引入?yún)⒖疾ㄩL(zhǎng)主要是排除這些非特異性吸收。另外，每塊檢測(cè)板中均包括系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，因此參考波長(zhǎng)的微調(diào)整對(duì)結(jié)果的影響較小。10批樣品的手工操作和工作站操作的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且具有較高的相關(guān)性，也表明以上參數(shù)的調(diào)整不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

工作站根據(jù)設(shè)計(jì)程序計(jì)算各板的進(jìn)樣順序和時(shí)間。本研究中選取D抗原含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)的整體操作時(shí)間較長(zhǎng)，在同時(shí)進(jìn)行多批檢測(cè)的情況下，使用的酶標(biāo)板較多，因此各板的孵育時(shí)間可能在允許的范圍內(nèi)不完全相同，存在細(xì)微誤差，因此本研究進(jìn)行試驗(yàn)內(nèi)和試驗(yàn)間的精密性驗(yàn)證，結(jié)果均在均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)，且GCV低于10%，滿足《中國(guó)藥典》對(duì)生物方法的精密性GCV低于20%的要求[12]。

通過(guò)本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法驗(yàn)證，表明工作站能夠完成脊髓灰質(zhì)炎疫苗中D抗原含量的測(cè)定，替代了部分人工。本研究選取了操作較為復(fù)雜，用時(shí)較長(zhǎng)的ELISA實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證自動(dòng)化液體處理工作站能夠滿足實(shí)際使用需求，說(shuō)明該工作站不僅僅適用于脊灰疫苗的D抗原檢測(cè)，還可以擴(kuò)展到其他項(xiàng)目的ELISA測(cè)定工作中。