陳范才，楊繼承，王 嬌，袁躍西

(南華大學附屬長沙中心醫(yī)院胸心外科，長沙 410000；*通訊作者,E-mail:yxdoctor@sina.com)

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示2020年肺癌患者近23萬人，死亡13.5萬人，給患者及其家屬帶來了巨大的負擔[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌病例的85%，其中肺鱗狀細胞癌和肺腺癌是非小細胞肺癌的主要亞型。而與肺腺癌相比，肺鱗癌的早期診斷和治療策略仍然有限，研究表明由于確診時較晚，肺鱗癌患者的5年總生存率僅為17.7%，預后較差[2]。因此，新的靶分子對于改善肺鱗癌的治療和預后至關(guān)重要。一些分子異常與肺鱗癌細胞的增殖、侵襲和生存不良有關(guān)，研究這些異常分子的生物學功能將大大加快新型有效治療策略的發(fā)展[3]。MEX3A是一種RNA結(jié)合蛋白(RBPs)，具有高度保守的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端環(huán)指結(jié)構(gòu)域。大量研究表明MEX3A在各種惡性腫瘤的發(fā)展中扮演著復雜多樣的角色，MEX3A在mRNA和基因表達的轉(zhuǎn)錄后過程中起著關(guān)鍵作用[4,5]。研究報道MEX3A在三陰乳腺癌和食管鱗狀細胞癌中發(fā)揮促癌基因的作用，促進腫瘤的惡性進展[6,7]。但Xu等[8]研究發(fā)現(xiàn)MEX3A通過調(diào)控AKT抑制宮頸癌細胞的增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)。這些研究表明MEX3A可能在不同類型的癌細胞中發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)功能。MEX3A在肺腺癌中被報道為癌基因[9]，但是MEX3A在肺鱗癌中的作用尚不清楚。本文通過研究MEX3A在肺鱗癌組織中的表達水平及MEX3A在肺鱗癌細胞中發(fā)揮的作用，探討其促進肺鱗癌增殖和轉(zhuǎn)移的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑來源

二甲苯和無水乙醇購自深圳中粵化學有限公司(中國深圳)；Histomouse SP Broad Spectrum DAB IHC檢測試劑盒購自Invitrogen試劑公司(美國)；牛血清白蛋白購自北京陽光生物科技有限公司(中國北京)；蘇木素購自solarbio試劑公司(中國北京)；免疫組化二抗試劑盒購自丹麥DAKO試劑公司；肺鱗癌細胞株H226購自中國科學院細胞庫(中國上海)；RPMI-1640培養(yǎng)基購自SparkJade試劑公司(中國山東)；胎牛血清和青鏈霉素雙抗購自Gibco公司(美國)；MEX3A敲減質(zhì)粒和MEX3A過表達質(zhì)粒購于上海吉瑪基因技術(shù)有限公司(中國上海)；TRIzol試劑購自Invitrogen試劑公司(美國)；RNA提取試劑盒購自睿時生物科技有限公司(中國上海)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司(日本)；MEX3A和內(nèi)參GAPDH引物由生工生物技術(shù)有限公司合成(中國上海)；CCK-8試劑購自BestBio公司(中國南京)；Transwell小室購自Corning公司產(chǎn)品(美國)；RIPA蛋白裂解液Cell Signaling試劑公司(美國)；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購自上海炎熙生物科技有限公司(中國上海)；PVDF膜購于GE試劑公司(中國上海)；MEX3A、兔源PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH和HRP偶聯(lián)的二抗購于英國Abcam公司。

1.2 生物信息學分析資料

肺鱗癌轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)來自于GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)的官方網(wǎng)址，共獲得肺鱗癌組織樣本486例，正常肺組織樣本338例，分析MEX3A在肺鱗癌和正常肺組織的表達水平。

1.3 臨床組織樣本

收集2013年1月至2015年7月期間入住我院的肺鱗癌患者的腫瘤組織及其匹配的遠離腫瘤組織3 cm的癌旁組織，并包埋切片制成石蠟切片。手術(shù)標本必須滿足以下納入標準：①組織病理學證實為肺鱗癌組織；②無其他惡性腫瘤；③術(shù)前未進行全身治療；④具備完整的臨床病理參數(shù)，包括年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存時間(生存隨訪均超過5年)；⑤具有患者知情同意書。共納入肺鱗癌和癌旁組織標本各58例。手術(shù)組織標本的使用由我院倫理委員會批準(批準文號：2012-084)，并根據(jù)世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言進行。

1.4 免疫組化檢測肺鱗癌和癌旁組織中MEX3A蛋白的表達

石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后在10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中微波進行抗原修復，并采用鏈霉親和素過氧化物酶對石蠟包埋的切片進行免疫染色。樣品用3%牛血清白蛋白在室溫下封閉15 min后，將樣品與1 ∶100稀釋的抗MEX3A一抗在4 ℃下孵育過夜。PBS洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的聚合物二抗在室溫下孵育30 min。采用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺溶液檢測免疫信號。由兩名病理學家在放大倍數(shù)為4倍和20倍的光學顯微鏡中獨立觀察染色切片的4個視野。每種蛋白質(zhì)的染色強度分為4個等級(強度評分)：0分(陰性)、1分(弱棕色)、2分(中度棕色)和3分(強棕色)。陽性細胞的百分比評分為0分(≤10%)、1分(11%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)和4分(>75%)。使用以下公式計算最終染色分數(shù)：強度分數(shù)×百分比分數(shù)。最終得分>1定義為高表達，最終得分≤1定義為低表達。

1.5 細胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染

肺鱗癌細胞株H226在RPMI-1640細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并補充有10%的胎牛血清和1%的青霉素/鏈霉素的混合物，放置在37 ℃下含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。H226細胞生長較好時，將H226細胞以每孔2×105個接種于6孔板內(nèi)，分為NC組、sh-MEX3A組和oe-MEX3A組。其中NC組細胞中加入5 μl Lip 2000和5 μg對照質(zhì)粒，sh-MEX3A組細胞中加入5 μl Lip 2000和5 μg MEX3A敲減質(zhì)粒，oe-MEX3A組細胞中加入5 μl Lip 2000和5 μg MEX3A過表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后，通過qRT-PCR和Western blot檢測干擾效率。

1.6 qRT-PCR檢測各組細胞中MEX3A mRNA表達

細胞采用TRIzol試劑裂解，RNA提取試劑盒提取細胞樣中總RNA。將總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為擴增模板按照qRT-PCR試劑盒說明書進行熒光定量PCR，PCR體系為：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μl，DNA模板2 μl，正向引物(10 μmol/L)0.5 μl，反向引物(10 μmol/L)0.5 μl，用雙蒸水補充至25 μl。將反應體系混勻后采用ABI 7500PCR儀得到每個樣品的循環(huán)閾值(threshold cvcle，Ct)，按照2-ΔΔCt公式計算細胞中MEX3A mRNA的相對表達量。MEX3A正向:5′-TGGAGAACTAGGATGTTTCGGG-3′,反向:5′-GAGGCAGAGTTGATCGAGAGC-3′。內(nèi)參GAPDH正向:5′-CGGCAGAGCGATAAGACCT-3′,反向:5′-CGGCAGAGCGATAAGACCT-3′。

1.7 CCK-8實驗檢測各組細胞增殖能力

將轉(zhuǎn)染MEX3A敲減質(zhì)粒和MEX3A過表達質(zhì)粒的H226細胞重懸并計數(shù)，以2 000個細胞接種到96孔板中，每組設(shè)置6個重復孔，并接種5 d的細胞孔，放置在37 ℃下含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)的第1，2，3，4，5天時每個細胞孔更換100 μl新鮮培養(yǎng)基，并加入10 μl CCK-8試劑，于450 nm處的檢測細胞光密度(OD值)以評估細胞活力。

1.8 Transwell實驗檢測各組細胞轉(zhuǎn)移能力

將轉(zhuǎn)染MEX3A敲減質(zhì)粒和MEX3A過表達質(zhì)粒的H226細胞重懸，無血清培養(yǎng)基洗3次，計數(shù)后將1×104個細胞接種在Transwell小室的聚碳酸酯膜上(8 μm孔徑)，并在下室中加入含有20% FBS的100 μl的培養(yǎng)基。孵育10 h后，用棉簽小心地去除膜上未遷移的細胞，而膜上的細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染料染色。在顯微鏡下隨機選擇5個不重疊的視野計算遷移細胞數(shù)目。

1.9 Western blot實驗檢測蛋白表達水平

細胞在含有蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物的蛋白緩沖液中裂解，經(jīng)高速離心去除細胞碎片后獲得蛋白裂解液。根據(jù)二辛可寧酸(BCA)測定法檢測和計算蛋白質(zhì)濃度。將20 μg等量的蛋白質(zhì)加入十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠中，并將凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)中。牛奶封閉后，將PVDF膜與MEX3A、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT一抗稀釋液(稀釋濃度均為1 ∶1 000)孵育過夜。然后，將PVDF膜與兔、鼠二抗(稀釋濃度均為1 ∶8 000)孵育。最后采用ECL試劑盒檢測蛋白條帶。

1.10 統(tǒng)計學方法

所有實驗重復3次，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示，使用Graph Pad Prism軟件作圖展示。并采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。通過Kaplan Meier法繪制患者生存曲線，Log-Rank法進行統(tǒng)計檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MEX3A在肺鱗癌組織中表達上調(diào)

GEPIA網(wǎng)站分析顯示MEX3A在肺鱗癌組織中的表達顯著高于正常肺組織中的表達(P<0.05，見圖1)。免疫組化檢測MEX3A在肺鱗癌組織中的表達顯著高于癌旁組織中的表達(55.17%vs36.21%，P<0.05，見圖2和表1)。

與正常肺組織相比，*P<0.05圖1 GEPIA網(wǎng)站分析MEX3A在肺鱗癌組織中的表達Figure 1 MEX3A expression in lung squamous tissue by GEPIA website analysis

圖2 免疫組化檢測MEX3A蛋白在癌旁組織及肺鱗癌組織中表達情況的表達 (×100)Figure 2 MEX3A protein expression in lung squamous carcinoma tissue and adjacent tissue by immunohistochemistry (×100)

表1 MEX3A蛋白在肺鱗癌組織和癌旁組織中的表達 例(%)Table 1 The expression of MEX3A protein in lung squamous carcinoma tissue and adjacent tissue cases(%)

2.2 MEX3A表達與肺鱗癌患者病理參數(shù)的關(guān)系

卡方檢驗分析MEX3A蛋白與肺鱗癌患者病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示高表達MEX3A與肺鱗癌患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)，與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05，見表2)，TNM分期晚期的肺鱗癌患者中MEX3A表達上調(diào)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺鱗癌患者中MEX3A表達上調(diào)。

表2 MEX3A蛋白在肺鱗癌組織中的表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 例(%)Table 2 Relationships between MEX3A protein expression and clinicopathological parameters in lung squamous carcinoma tissues cases(%)

2.3 MEX3A表達與肺鱗癌患者預后的關(guān)系

Log-Rank法統(tǒng)計檢驗顯示與低表達MEX3A的肺鱗癌患者相比，高表達MEX3A的肺鱗癌患者預后較差(χ2=4.029，P=0.045，見圖3)。

圖3 Log-Rank檢驗分析MEX3A蛋白在肺鱗癌組織中表達與患者預后的關(guān)系Figure 3 Relationship of MEX3A protein expression in lung squamous tissues with patients’ prognosis By Log-Rank analysis

2.4 MEX3A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺鱗癌細胞效果

qRT-PCR結(jié)果顯示MEX3A mRNA在NC組、sh-MEX3A和oe-MEX3A組H266細胞中的相對表達分別為1.24±0.21，0.16±0.05和3.89±0.44。與NC組相比，sh-MEX3A組肺鱗癌細胞中MEX3A的表達顯著降低(t=8.665，P<0.001)，oe-MEX3A組肺鱗癌細胞中MEX3A的表達顯著增加(t=9.414，P=0.003，見圖4A)。

Western blot結(jié)果顯示MEX3A蛋白在NC組、sh-MEX3A和oe-MEX3A組H266細胞中的表達分別為1.21±0.24，0.18±0.03和2.14±0.18。與NC組相比，sh-MEX3A組肺鱗癌細胞中MEX3A的表達顯著降低(t=7.376，P=0.001)，oe-MEX3A組肺鱗癌細胞中MEX3A的表達顯著增加(t=5.369，P=0.003，見圖4B)。

圖4 MEX3A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺鱗癌細胞效果Figure 4 Efficacy of MEX3A plasmid transfection in lung squamous cell carcinoma cells

2.5 MEX3A對細胞增殖能力的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示：與NC組相比，sh-MEX3A組肺鱗癌細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)，oe-MEX3A組肺鱗癌細胞增殖能力顯著增加(P<0.05，見圖5)。

與NC組相比，*P<0.05圖5 CCK-8檢測各組H266細胞增殖能力Figure 5 The proliferation ability of H266 cells in NC group, sh-MEX3A group and oe-MEX3A group by CCK-8

2.6 MEX3A對細胞轉(zhuǎn)移能力的影響

Transwell實驗檢測結(jié)果顯示NC組、sh-MEX3A和oe-MEX3A組H266細胞轉(zhuǎn)移細胞數(shù)目分別為(45.33±7.24)個，(27.67±5.36)個和(79.67±6.51)個。與NC組相比，sh-MEX3A組肺鱗癌細胞轉(zhuǎn)移能力顯著降低(t=3.396，P=0.019)，oe-MEX3A組肺鱗癌細胞轉(zhuǎn)移能力顯著增加(t=6.109，P=0.002，見圖6)。

圖6 Transwell檢測各組H266細胞轉(zhuǎn)移能力 (×100)Figure 6 The invasion ability of H266 cells in NC group, sh-MEX3A group and oe-MEX3A group by Transwell assay (×100)

2.7 PI3K/AKT信號通路檢測

western-blot檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，sh-MEX3A組肺鱗癌細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達顯著降低(P<0.05)，oe-MEX3A組肺鱗癌細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達顯著增加(P<0.05)，而PI3K和AKT蛋白均無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義(見圖7)。

與NC組相比，*P<0.05圖7 Western blot檢測各組H266細胞中PI3K/AKT信號通路蛋白表達Figure 7 Expression of PI3K/AKT signal pathway-related proteins in H266 cells in NC group, sh-MEX3A group and oe-MEX3A group by Western blot

3 討論

MEX-3蛋白參與包括胚胎發(fā)育、上皮穩(wěn)態(tài)、免疫功能和代謝等核心生物過程的調(diào)節(jié)，其異常表達與腫瘤的發(fā)生也密切相關(guān)。MEX3基因包含兩個異質(zhì)核核糖核蛋白K同源(KH)結(jié)構(gòu)域(命名為KH1和KH2)，這兩個氨基酸的保守區(qū)域通過KH結(jié)構(gòu)域結(jié)合RNA發(fā)揮作用[10]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在人類中Mex3家族有4種同源蛋白MEX3A、MEX3B、MEX3C和MEX3D，其中MEX3A是Mex3家族的重要組成部分，其最初是在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)，具有約70個氨基酸的保守區(qū)，是一種翻譯調(diào)節(jié)蛋白，抑制秀麗隱桿線蟲早期胚胎中Pal-1的翻譯[11]。其在肝癌、乳腺癌和胰腺導管腺癌等腫瘤的惡性進展中均發(fā)揮重要作用，可作為治療腫瘤的潛在分子靶點[5,6,12]。然而，其在肺鱗癌中的生物學效應和潛在調(diào)節(jié)機制仍然知之甚少。

GEPIA是一個網(wǎng)絡應用程序，分析基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的9 736個腫瘤和8 587個正常樣本中的基因表達。本文采用GEPIA分析發(fā)現(xiàn)MEX3A的轉(zhuǎn)錄水平在肺鱗癌組織中的表達顯著上調(diào)。Yang等[5]采用TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中MEX3A表達上調(diào)，并且組織學分級越高，其表達越高。MEX3A的高表達與較差的肝癌患者存活率顯著相關(guān)。為了驗證GEPIA的分析結(jié)果及分析MEX3A與肺鱗癌患者臨床參數(shù)及預后的關(guān)系，本文采用IHC檢測MEX3A蛋白在肺鱗癌組織中的表達水平，結(jié)果顯示與癌旁組織相比，肺鱗癌組織中MEX3A蛋白的表達顯著增加，與GEPIA的分析結(jié)果具有一致性，同時分析發(fā)現(xiàn)MEX3A在TNM分期晚期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達顯著高于在TNM分期早期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的表達。表明MEX3A在肺鱗癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌基因的作用。這也與先前的研究報道具有相似性，包括MEX3A的高表達與三陰乳腺癌的惡性進展和預后不良有關(guān)[6]，以及MEX3A表達升高與肺腺癌預后和轉(zhuǎn)移不良有關(guān)[9]。本文生存分析顯示與MEX3A低表達的肺鱗癌患者相比，MEX3A高表達的肺鱗癌患者預后較差。表明MEX3A可以作為肺鱗癌患者預后生物標志物。

研究顯示MEX3A在乳腺癌、胰腺導管腺癌中促進腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移[6,12]，增殖和轉(zhuǎn)移是腫瘤重要的惡性表型，組織水平提示MEX3A與肺鱗癌增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)。本文采用敲減肺鱗癌細胞H226內(nèi)源性MEX3A和過表達外源性MEX3A，CCK-8和Transwell實驗結(jié)果顯示敲減MEX3A的表達顯著抑制H266細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，而過表達MEX3A顯著促進H266細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，表明MEX3A促進肺鱗癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，促進肺鱗癌的惡性進展，與Liang等[9]結(jié)果相似，表明MEX3A在肺鱗癌和肺腺癌中均發(fā)揮促癌基因的作用。朱貝等[13]報道MEX3A在NSCLC細胞系中表達升高，干擾MEX3A抑制NSCLC增殖、侵襲及遷移能力，并誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯。但是MEX3A促進肺鱗癌增殖和轉(zhuǎn)移的機制仍需進一步探討。

MEX3A在肺腺癌中通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路促進腫瘤轉(zhuǎn)移，同時在三陰乳腺癌中MEX3A同樣通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。PI3K/AKT信號通路是腫瘤惡性生物學行為相關(guān)的重要通路之一，其激活促進細胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥等多種表型[14]。PI3K/AKT信號通路在肺鱗癌中可作用抗腫瘤活性的重要靶點[15]。那么在肺鱗癌中MEX3A是否通過激活PI3K/AKT信號通路促進細胞增殖和轉(zhuǎn)移。PI3K蛋白是PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵蛋白，其激活后磷酸化為p-PI3K蛋白，促進其下游蛋白AKT的磷酸化，p-PI3K和p-AKT蛋白的表達增加，表明PI3K/AKT信號通路的活化[16]。本文采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)sh-MEX3A顯著抑制p-PI3K和p-AKT蛋白的表達，oe-MEX3A顯著促進p-PI3K和p-AKT蛋白的表達，表明MEX3A通過活化PI3K/AKT信號通路促進肺鱗癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力，與其在三陰乳腺癌和肺腺癌中發(fā)揮的作用機制一致，但是Xu等[8]報道MEX3A通過抑制Akt信號通路和EMT參與了宮頸癌的抗腫瘤活性。表明MEX3A在不同的腫瘤中可能發(fā)揮相反的作用。 綜上所述，MEX3A在肺鱗癌組織中表達上調(diào)，其高表達與肺鱗癌惡性病理參數(shù)和預后不良相關(guān)。MEX3A促進肺鱗癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力，可能是通過激活PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用。MEX3A是肺鱗癌預后不良及抗腫瘤治療的潛在分子靶點。