朱夢(mèng)琪，張新鑫，李 靖，賈建光

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，蚌埠 233000；*通訊作者,E-mail:jiajianguang1978@126.com)

胃癌作為一種全球性的重要癌癥，其發(fā)生原因來(lái)自多個(gè)方面，包括家族史、幽門螺桿菌的慢性感染、EB病毒的感染、飲酒、吸煙、飲食等[1]?；谶@些常見危險(xiǎn)因素，據(jù)估計(jì)，2020年就有超過(guò)100萬(wàn)的新增病例、76.9萬(wàn)的死亡病例[2]。盡管近30年來(lái)，這種癌癥的發(fā)病率和死亡率呈長(zhǎng)期穩(wěn)步下降的形勢(shì)，但其目前仍位于世界上高致死率和高發(fā)病率腫瘤類型的前列[3,4]。雖然治療手段和方案不斷在改善，但胃癌的存活率仍然很低[5]。而隨著癌癥的基因分析和腫瘤標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體和小分子抑制劑形式的靶向治療已經(jīng)成為可能，并且最近已經(jīng)成為胃癌多模式治療的重要方面[6]。但此前尚未發(fā)現(xiàn)特別有效的生物標(biāo)志物作為胃癌的靶向指導(dǎo)[7]。因此，有必要尋找更多胃癌的潛在標(biāo)志物，以實(shí)現(xiàn)更好的治療效果、獲得更高的總生存率。

微小RNA(microRNA, miRNA)作為一種非編碼RNA，通常經(jīng)兩個(gè)連續(xù)的切割事件由新生的初級(jí)miRNA(pri-miRNA)轉(zhuǎn)錄本生成[8,9]。成熟的miRNA能夠匹配并結(jié)合相應(yīng)mRNA的3′UTR(untranslated region，非翻譯區(qū))，促使下游基因在特定位點(diǎn)發(fā)生降解或翻譯抑制[10]。事實(shí)上，許多miRNA可以在癌癥中發(fā)揮或促進(jìn)、或抑制的作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分化、血管生成、干細(xì)胞性、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、增殖、細(xì)胞周期等表型[11]。已有研究表明，miR-32-5p可參與乳腺癌的增殖、凋亡、侵襲等過(guò)程[12]；可參與肺腺癌的EMT、轉(zhuǎn)移等功能的調(diào)控[13]；可調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌內(nèi)放射增敏、遷移和侵襲等表型[14]。此外，還有研究顯示，miR-32-5p與卵巢癌[15]、宮頸癌[16]、食管癌[17]、肝癌[18]等發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但miR-32-5p在胃癌中的研究仍然不多。本研究意在探討miR-32-5p在胃癌中對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、Wnt信號(hào)通路的影響，并研究其與SOSTDC1之間的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料與細(xì)胞

胃癌細(xì)胞(BGC-823、MKN-45、MGC-803、SGC-7901)來(lái)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，人胃上皮細(xì)胞(GES-1)由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。miR-NC mimics、miR-32-5p mimics與miR-NC inhibitor、miR-32-5p inhibitor通過(guò)上海吉瑪基因公司所生產(chǎn)。一抗(p-GSK3β)來(lái)自美國(guó)Affinity Biosciences公司，一抗(SOSTDC1)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，二抗及其他一抗(β-catenin、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、GSK3β、Bax、GAPDH)由武漢三鷹生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。EasyScript一步法去除gDNA和cDNA合成試劑盒與PerfectStart Green qPCR試劑盒從北京全式金生物公司購(gòu)得；RPMI-1640培養(yǎng)基、opti-MEM由美國(guó)Gibco公司供給；CCK-8試劑盒、青-鏈霉素溶液、胰酶溶液來(lái)自中國(guó)Biosharp公司；凋亡試劑盒由中國(guó)貝博生物提供；BCA蛋白定量試劑盒、快速裂解液、PMSF、蛋白上樣緩沖液由中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)提供；ECL發(fā)光液于美國(guó)Abbkine公司購(gòu)買；新生牛血清由浙江天杭生物科技有限公司提供；無(wú)血清凍存液由蘇州新賽美生物科技有限公司生產(chǎn)；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 生信分析及數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析

為了確定研究目標(biāo)和方向，我們首先從公開數(shù)據(jù)庫(kù)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中，獲得了非編碼RNA系列數(shù)據(jù)集GSE118915。隨后利用R語(yǔ)言分析軟件首先篩出GSE118915數(shù)據(jù)集中胃癌組織的所有差異表達(dá)miRNA，并據(jù)此繪制胃癌組織中所有差異表達(dá)miRNA的熱圖。在前面篩選的結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)置log2FC>1，且P<0.05的條件，進(jìn)一步篩選出相比于正常胃組織，胃癌組織中差異表達(dá)2倍以上的miRNA，并通過(guò)R語(yǔ)言繪制火山圖。同時(shí)結(jié)合TargetScan(https://www.targetscan.org/vert_80/)數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)差異表達(dá)2倍以上miRNA的調(diào)控靶基因，并使用R語(yǔ)言繪制胃癌組織中差異表達(dá)2倍以上miRNA及其靶基因mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。隨后通過(guò)查閱所有差異2倍以上miRNA及其靶基因的相關(guān)現(xiàn)存文獻(xiàn)，排除在胃癌中已被研究過(guò)的miRNA，最終確定將miR-32-5p及其靶基因SOSTDC1作為研究對(duì)象。

基因表達(dá)譜交互分析網(wǎng)站(GEPIA, http://gepia.cancer-pku.cn/)用于探索SOSTDC1在多種腫瘤組織及正常組織中的表達(dá)水平，隨后通過(guò)網(wǎng)站內(nèi)匹配癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)和基因型和基因表達(dá)量關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)(genotype-tissue expression，GTEx)，分析SOSTDC1在正常組織及配對(duì)癌組織中的表達(dá)水平。此外，SOSTDC1在正常胃組織與胃癌組織中的表達(dá)水平也是通過(guò)GEPIA網(wǎng)站獲得。

miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)(TargetScan, https://www.targetscan.org/vert_80/)用于預(yù)測(cè)miR-32-5p的下游靶基因，探索miR-32-5p同SOSTDC1之間的調(diào)控關(guān)系及結(jié)合位點(diǎn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

研究中所用的所有細(xì)胞，包括用于檢測(cè)miR-32-5p表達(dá)情況的MKN-45、SGC-7901、GES-1、BGC-823、MGC-803細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)染后的MKN-45細(xì)胞(分為miR-NC mimics組、miR-32-5p mimics組、miR-NC inhibitor組、miR-32-5p inhibitor組)，皆使用的是RPMI-1640培養(yǎng)基，使用前需向其內(nèi)補(bǔ)充體積比1%的青-鏈霉素及體積比10%的新生牛血清。細(xì)胞培養(yǎng)瓶平放于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培育，維持培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃、濕潤(rùn)環(huán)境。培養(yǎng)期間視具體的細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行換液、傳代，培養(yǎng)的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的不同細(xì)胞系GES-1、MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45內(nèi)miR-32-5p的表達(dá)情況，選取MKN-45細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使后續(xù)實(shí)驗(yàn)都按1.3所述的細(xì)胞分為miR-NC mimics組、miR-32-5p mimics組、miR-NC inhibitor組、miR-32-5p inhibitor組。將選取的原始胃癌細(xì)胞MKN-45培養(yǎng)至占據(jù)6孔板單孔的50%～70%時(shí)，按說(shuō)明書分別將Lipofectamine 2000、miR-NC mimics共轉(zhuǎn)染為miR-NC mimics組；Lipofectamine 2000、miR-32-5p mimics共轉(zhuǎn)染為miR-32-5p mimics組；Lipofectamine 2000、miR-NC inhibitor共轉(zhuǎn)染為miR-NC inhibitor組；Lipofectamine 2000、miR-32-5p inhibitor共轉(zhuǎn)染為miR-32-5p inhibitor組。再分別與適量基本培養(yǎng)基(未添加血清和雙抗)混合并轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，持續(xù)轉(zhuǎn)染6～8 h后將舊液移入廢液桶，重新補(bǔ)充完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)后用于后續(xù)qRT-PCR、增殖、凋亡、Western blot等實(shí)驗(yàn)。

1.5 RNA抽提和qRT-PCR檢測(cè)miR-32-5p的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)染效率

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)miR-32-5p的表達(dá)水平以及轉(zhuǎn)染效率。其中培養(yǎng)胃癌細(xì)胞(MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45)、胃上皮細(xì)胞(GES-1)以檢測(cè)miR-32-5p的表達(dá)水平；培養(yǎng)MKN-45細(xì)胞轉(zhuǎn)染的miR-NC mimics組、miR-32-5p mimics組細(xì)胞以檢測(cè)MKN-45細(xì)胞的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染效率；培養(yǎng)miR-NC inhibitor組、miR-32-5p inhibitor組細(xì)胞以檢測(cè)MKN-45細(xì)胞的敲除轉(zhuǎn)染效率。使用TransZol Up、異丙醇、三氯甲烷、75%無(wú)RNA酶乙醇(無(wú)水乙醇 ∶DEPC水=3 ∶1)等試劑對(duì)培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行處理，以抽提總RNA。經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA，剔除不符合純度和濃度標(biāo)準(zhǔn)的RNA，符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA用于后續(xù)操作。即根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA進(jìn)行稀釋，調(diào)整其濃度后，使用EasyScript一步法去除gDNA和cDNA合成試劑盒與PerfectStart Green qPCR試劑盒，分別對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。將U6設(shè)為內(nèi)源參照，根據(jù)所獲得的Ct值使用2-ΔΔCt法計(jì)算最終值以進(jìn)行相對(duì)性分析。其中，分析miR-32-5p的表達(dá)水平時(shí)，將MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45細(xì)胞計(jì)算的最終值與GES-1細(xì)胞計(jì)算的最終值進(jìn)行比較。檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率時(shí)，將miR-NC mimics組與miR-32-5p mimics組計(jì)算的最終值進(jìn)行比較，即可判斷過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染是否有效；將miR-NC inhibitor組與miR-32-5p inhibitor組計(jì)算的最終值進(jìn)行比較，即可判斷敲除轉(zhuǎn)染是否有效。

過(guò)程中使用的引物序列如下：miR-32-5p上游引物：5′-CGCGCGTATTGCACATTACTAA-3′；miR-32-5p下游引物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；miR-32-5p反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAG GGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGCAAC-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-32-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。對(duì)上述MKN-45細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的不同分組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分別收集細(xì)胞后重新接種到96孔板內(nèi)，接種濃度為每孔5×103。隨后在適宜培養(yǎng)環(huán)境對(duì)96孔板內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)至24，48，72，96 h時(shí)分別取出96孔板，避光環(huán)境下以10 μl/孔的體積進(jìn)行CCK-8試劑的添加。隨后再次將96孔板移入適宜培養(yǎng)環(huán)境內(nèi)，維持2 h。然后使用酶標(biāo)儀對(duì)孔板進(jìn)行吸光度(OD值)測(cè)定，并將波長(zhǎng)設(shè)定為450 nm。分別比較miR-NC mimics組與miR-32-5p mimics組的吸光度值，以及miR-NC inhibitor組與miR-32-5p inhibitor組的吸光度值。

1.7 集落克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

集落克隆實(shí)驗(yàn)同樣用于檢測(cè)miR-32-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。對(duì)上述轉(zhuǎn)染后的不同組別細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng)，收集、重懸細(xì)胞后，進(jìn)行計(jì)數(shù)并按照要求進(jìn)行稀釋，然后以2×103/孔的濃度接種到6孔板內(nèi)。隨后將6孔板移入設(shè)置好培養(yǎng)條件的培養(yǎng)箱內(nèi)，對(duì)其進(jìn)行集落培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為12 d，期間可進(jìn)行換液操作。待培養(yǎng)至大部分集落內(nèi)細(xì)胞超過(guò)50個(gè)時(shí)，對(duì)其進(jìn)行后續(xù)操作。即取出6孔板，將廢液吸入廢液桶，取PBS進(jìn)行2次輕微吹洗，再取適量4%多聚甲醛浸泡細(xì)胞15 min以完成細(xì)胞固定操作。隨后再次完成2次輕微沖洗，取適量結(jié)晶紫染液浸泡細(xì)胞15 min，以完成細(xì)胞染色操作。染色后再次清洗2次，并晾干、拍照、統(tǒng)計(jì)集落數(shù)量。分別比較miR-NC mimics組與miR-32-5p mimics組的集落數(shù)量，以及miR-NC inhibitor組與miR-32-5p inhibitor組的集落數(shù)量。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)雙染實(shí)驗(yàn)用于研究細(xì)胞凋亡變化。首先培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，24 h后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行消化、收集，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2次洗滌、離心。在避光條件下分別對(duì)不同組的細(xì)胞進(jìn)行FITC、PI染色處理，經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾至流式細(xì)胞管內(nèi)，隨后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)不同分組細(xì)胞進(jìn)行凋亡測(cè)定。將檢測(cè)結(jié)果導(dǎo)入FlowJo軟件內(nèi)并對(duì)其進(jìn)行分析處理，即可知道不同分組細(xì)胞的凋亡比例。分別比較miR-NC mimics組與miR-32-5p mimics組的凋亡比例，以及miR-NC inhibitor組與miR-32-5p inhibitor組的凋亡比例。

1.9 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白、Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白和SOSTDC1蛋白表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)分別用于研究miR-32-5p與凋亡相關(guān)蛋白的關(guān)系、miR-32-5p與Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的關(guān)系、miR-32-5p與SOSTDC1蛋白表達(dá)的關(guān)系。對(duì)上述轉(zhuǎn)染后的不同分組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，用離心管收集培養(yǎng)好的各組細(xì)胞，進(jìn)行離心、沉淀，吸取多余水分。然后補(bǔ)充適量RIPA裂解液，吹散沉淀后將其吸入1.5 ml離心管，并將離心管插入冰塊持續(xù)裂解30 min，隨后存放于-20 ℃冰箱裂解過(guò)夜。次日移出并完成化凍及離心操作，取上清且保存于新的1.5 ml離心管內(nèi)，并用BCA定量法對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。根據(jù)定量結(jié)果調(diào)整不同組別的濃度、體積、上樣量。按照調(diào)整后的上樣量對(duì)配制的凝膠進(jìn)行樣品加注，隨后電泳分離蛋白質(zhì)。然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)30 min封閉后將膜浸入相應(yīng)的一抗(Bcl-2、Bax以1 ∶2 000的比例稀釋，cleaved-Caspase-3、p-GSK3β以1 ∶500的比例稀釋，β-catenin以1 ∶5 000的比例稀釋，GSK3β、SOSTDC1以1 ∶1 000的比例稀釋，GAPDH以1 ∶50 000的比例稀釋)內(nèi)，維持此狀態(tài)放入4 ℃環(huán)境內(nèi)持續(xù)一夜。次日取出并清洗3次后，浸入二抗(山羊抗兔、山羊抗鼠均以1 ∶5 000的比例稀釋)中進(jìn)行孵育，持續(xù)2 h。隨后進(jìn)行ECL曝光顯影，對(duì)最終的成像條帶進(jìn)行ImageJ灰度掃描。分別對(duì)miR-NC mimics組與miR-32-5p mimics組的條帶灰度值進(jìn)行比較，以及對(duì)miR-NC inhibitor組與miR-32-5p inhibitor組的條帶灰度值進(jìn)行比較。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad Prism 7軟件分析所有的數(shù)據(jù)，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。其中，采用t檢驗(yàn)分析兩組間的差異，采用單因素方差分析比較多組間的差異。P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-32-5p在胃癌組織中高表達(dá)

根據(jù)R語(yǔ)言生信分析的篩選及制圖，最終繪制了胃癌組織中所有差異表達(dá)miRNA的熱圖、火山圖。熱圖可見色彩變化尺，其中紅色代表高表達(dá)、正相關(guān)，綠色代表低表達(dá)、負(fù)相關(guān)；此外，類型圖標(biāo)中，藍(lán)色和N代表正常胃組織，粉色和T代表胃癌組織。熱圖中即可見相對(duì)于正常胃組織，胃癌組織中高表達(dá)和低表達(dá)的所有miRNA所代表的色塊(見圖1A)?；鹕綀D可見紅色點(diǎn)，代表相較于正常胃組織，胃癌組織中差異2倍以上且高表達(dá)的miRNA；綠色點(diǎn)代表相較于正常胃組織，差異2倍以上且低表達(dá)的miRNA；黑色點(diǎn)代表相較于正常胃組織，表達(dá)差異在2倍以內(nèi)的miRNA(見圖1B)。此外，R語(yǔ)言結(jié)合TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)還繪制了胃癌組織中表達(dá)差異2倍以上的miRNA與其靶基因mRNA間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。此圖中紅色表示相對(duì)于正常胃組織，胃癌組織中高表達(dá)的miRNA與mRNA；綠色表示相對(duì)于正常胃組織，胃癌組織中低表達(dá)的miRNA與mRNA。在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖中最終確定miR-32-5p及其靶基因SOSTDC1為研究目標(biāo)，其中顯示miR-32-5p在胃癌組織中高表達(dá)，SOSTDC1在胃癌組織中低表達(dá)(見圖1C)。

圖1 胃癌組織中差異表達(dá)miRNA及其靶基因Figure 1 Differentially expressed miRNAs and their target genes in gastric cancer

2.2 胃癌細(xì)胞內(nèi)的miR-32-5p呈高表達(dá)狀態(tài)

qRT-PCR分析結(jié)果揭示了，相較于人胃上皮細(xì)胞(GES-1)，miR-32-5p在胃癌細(xì)胞MKN-45、MGC-803、SGC-7901、BGC-823內(nèi)表達(dá)水平明顯上升(P<0.05，見圖2)。

對(duì)MKN-45細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，qRT-PCR分析表明miR-32-5p mimics組細(xì)胞中miR-32-5p的表達(dá)量較miR-NC mimics組增高(P<0.05，見圖2)；miR-32-5p inhibitor組細(xì)胞中miR-32-5p的表達(dá)量則較miR-NC inhibitor組降低(P<0.05，見圖2)?？梢妋iR-32-5p的過(guò)表達(dá)及敲除轉(zhuǎn)染有效。

圖2 miR-32-5p在胃癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平及轉(zhuǎn)染效率Figure 2 Expression level and transfection efficiency of miR-32-5p in gastric cancer cells

2.3 胃癌細(xì)胞內(nèi)miR-32-5p可促進(jìn)細(xì)胞增殖表型

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于miR-NC mimics組，miR-32-5p mimics組細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)(P<0.05)；相比于miR-NC inhibitor組，miR-32-5p inhibitor組細(xì)胞增殖能力則減弱(P<0.05，見圖3)。

圖3 miR-32-5p對(duì)MKN-45細(xì)胞增殖能力的影響Figure 3 Effect of miR-32-5p on proliferation of MKN-45 cells

同時(shí)，集落克隆實(shí)驗(yàn)也表明，miR-32-5p mimics組的集落數(shù)量較miR-NC mimics組有所增加(P<0.05)；miR-32-5p inhibitor組的集落數(shù)量則較miR-NC inhibitor組減少(P<0.05，見圖4)。

圖4 miR-32-5p對(duì)MKN-45細(xì)胞集落形成能力的影響Figure 4 Effect of miR-32-5p on colony formation ability of MKN-45 cells

綜合兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，miR-32-5p的表達(dá)上調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。

2.4 胃癌細(xì)胞內(nèi)miR-32-5p會(huì)抑制細(xì)胞凋亡

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-32-5p mimics組細(xì)胞凋亡率較miR-NC mimics組下降(P<0.05)；miR-32-5p inhibitor組細(xì)胞凋亡率則較miR-NC inhibitor組增加(P<0.05，見圖5)。

圖5 miR-32-5p對(duì)MKN-45細(xì)胞凋亡的影響Figure 5 Effect of miR-32-5p on apoptosis of MKN-45 cells

此外，Western blot分析結(jié)果表明，相比于miR-NC mimics組，miR-32-5p mimics組細(xì)胞內(nèi)Bax、cleaved-Caspase-3表達(dá)量下降，而Bcl-2表達(dá)水平增高(P<0.05，見圖6)。相比于miR-NC inhibitor組，miR-32-5p inhibitor組細(xì)胞內(nèi)Bax、cleaved-Caspase-3表達(dá)量增加，而Bcl-2表達(dá)水平下降(P<0.05，見圖6)。根據(jù)以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可證明上調(diào)miR-32-5p的表達(dá)會(huì)抑制胃癌細(xì)胞凋亡。

圖6 miR-32-5p對(duì)MKN-45細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Figure 6 Effect of miR-32-5p on apoptosis-related proteins in MKN-45 cells

2.5 miR-32-5p促進(jìn)Wnt/β-catenin通路的激活

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-32-5p mimics組細(xì)胞內(nèi)β-catenin、p-GSK3β蛋白的相對(duì)表達(dá)量較miR-NC mimics組提高(P<0.05，見圖7)。miR-32-5p inhibitor組細(xì)胞內(nèi)β-catenin、p-GSK3β蛋白的相對(duì)表達(dá)量較miR-NC inhibitor組降低(P<0.05，見圖7)。這表明上調(diào)miR-32-5p可誘導(dǎo)Wnt/β-catenin通路的激活。

圖7 MKN-45細(xì)胞內(nèi)miR-32-5p與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)系Figure 7 Relationship between miR-32-5p and Wnt/β-catenin signaling pathway in MKN-45 cells

2.6 SOSTDC1在胃癌中低表達(dá)

根據(jù)GEPIA網(wǎng)站進(jìn)行在線分析的結(jié)果，可獲得SOSTDC1的表達(dá)譜及箱型圖，紅色代表腫瘤組織，黑色代表正常組織。其中SOSTDC1在所有配對(duì)正常組織和腫瘤組織中的基因表達(dá)譜顯示，相比于正常胃組織，SOSTDC1在配對(duì)胃癌(stomach adenocarcinoma，STAD)組織中處于低表達(dá)水平(見圖8)。此外，箱型圖結(jié)果也表明，相較于正常胃組織，SOSTDC1在胃癌組織中低表達(dá)(P<0.05，見圖8)。

圖8 SOSTDC1在胃癌組織(STAD)中的表達(dá)水平Figure 8 Expression level of SOSTDC1 in gastric cancer tissue

2.7 miR-32-5p在胃癌細(xì)胞內(nèi)靶向抑制SOSTDC1

通過(guò)TargetScan網(wǎng)站的預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示SOSTDC1是miR-32-5p的下游靶基因，并顯示了二者的結(jié)合位點(diǎn)(見圖9)。此外，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)，證明了miR-32-5p mimics組細(xì)胞內(nèi)SOSTDC1蛋白表達(dá)量較miR-NC mimics組減低(P<0.05)；miR-32-5p inhibitor組細(xì)胞內(nèi)SOSTDC1蛋白水平較miR-NC inhibitor組增高(P<0.05，見圖9)。由此可見，在胃癌細(xì)胞中，miR-32-5p靶向抑制SOSTDC1。

圖9 miR-32-5p在MKN-45細(xì)胞內(nèi)與SOSTDC1的關(guān)系Figure 9 The relationship between miR-32-5p and SOSTDC1 in MKN-45 cells

3 討論

胃癌的發(fā)生已被證明與幽門螺桿菌的慢性感染具有密切聯(lián)系，這導(dǎo)致了其在全球各地區(qū)的高發(fā)生率[19]。在這之中，尤以東亞、中亞和拉丁美洲為最[20]。根治性手術(shù)仍是其首選治療對(duì)策，但大多數(shù)患者的確診時(shí)期都處于晚期[21]。雖然手術(shù)與放、化療等相結(jié)合的多模式治療對(duì)延長(zhǎng)生存期具有一定效果，但晚期胃癌的5年生存率卻仍然很低，世界上大多數(shù)國(guó)家仍處于20%～30%水平，故晚期胃癌的治療仍是一個(gè)挑戰(zhàn)[22,23]。目前靶向治療已被納入晚期胃癌常規(guī)治療的選擇之一，以提高治療效果，然而胃癌現(xiàn)有的靶向藥物有效率仍低于50%[24]。因此，有必要探尋更多、更新、更敏感的標(biāo)志物以實(shí)現(xiàn)胃癌的早期診斷和有效治療。

相關(guān)研究表明，異常表達(dá)的miRNA同癌癥的發(fā)病機(jī)制之間存在緊密聯(lián)系，且可以通過(guò)體外介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊在癌癥中發(fā)揮生物標(biāo)記作用，表明其具有成為生物標(biāo)記物的可能性[25,26]。如今關(guān)于各種miRNA與癌癥的相關(guān)性研究也與日俱增。因此，本研究首先使用R語(yǔ)言分析，篩選出胃癌中一系列與正常胃組織相比，具有2倍以上差異表達(dá)的miRNA，并預(yù)測(cè)了下游基因，在此基礎(chǔ)上選擇擬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)。

其中，miR-32-5p已被證明會(huì)影響腫瘤的生物學(xué)惡性進(jìn)展。如姚嘉等[12]報(bào)道，miR-32-5p通過(guò)抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲；Zhang等[13]證明，miR-32-5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中抑制細(xì)胞的遷移、侵襲能力；Liu等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-32-5p會(huì)導(dǎo)致HOXB8表達(dá)下降，可減弱宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。此外，miR-32-5p與消化系腫瘤惡性行為的發(fā)生也有密切聯(lián)系，并在其過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Liang等[14]報(bào)道，結(jié)直腸癌中，下調(diào)miR-32-5p可通過(guò)促進(jìn)TOB1表達(dá)增強(qiáng)放射敏感性，抑制遷移和侵襲；徐漢橋等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-32-5p在食管癌中通過(guò)調(diào)控KLF4，抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且抑制炎癥因子IL-6的產(chǎn)生；Yuan等[27]證實(shí)，mir-32-5p通過(guò)調(diào)控Tldc1而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；此外，F(xiàn)u等[18]報(bào)道，miR-32-5p通過(guò)抑制PTEN激活PI3K/Akt通路，并通過(guò)促進(jìn)血管生成和EMT通過(guò)外泌體誘導(dǎo)多藥耐藥?？梢姡琺iR-32-5p在多種腫瘤包括消化系腫瘤中起重要作用，有成為標(biāo)志物的可能性。而目前關(guān)于miR-32-5p在胃癌中的研究仍較少，有必要對(duì)其進(jìn)行相關(guān)研究，為胃癌尋找更多潛在標(biāo)志物。

SOSTDC1則是一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)拮抗劑，位于17號(hào)染色體，主要參與牙齒和腎臟發(fā)育[28]。SOSTDC1的功能是直接與配體結(jié)合，如BMP2、BMP4和BMP7，使其活性受到抑制[29]。有研究證實(shí)了SOSTDC1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定相關(guān)性。Clausen等[30]發(fā)現(xiàn)，高水平的SOSTDC1與乳腺癌患者生存率的提升密切相關(guān)，且SOSTDC1選擇性阻斷BMP7誘導(dǎo)的Smad磷酸化，而不減少BMP2或Wnt3a誘導(dǎo)的信號(hào)；Liu等[31]證明，SOSTDC1在非小細(xì)胞肺癌中，可能通過(guò)調(diào)節(jié)p21Cip和p27Kip抑制細(xì)胞增殖，進(jìn)而影響Rb-E2F信號(hào)傳導(dǎo)；Bartolomé等[32]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中，SOSTDC1通過(guò)克服BMP4特異性抗轉(zhuǎn)移信號(hào)，并誘導(dǎo)ALCAM介導(dǎo)的Src和PI3K/AKT激活，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和肝轉(zhuǎn)移。同時(shí)，SOSTDC1在胃癌中也進(jìn)行了相關(guān)研究，Cui等[33]報(bào)道，SOSTDC1通過(guò)使c-Jun信號(hào)失活，而抑制胃癌生長(zhǎng)及肺轉(zhuǎn)移的形成；Gopal等[34]也證明，SOSTDC1可提高胃癌患者總體生存率，過(guò)表達(dá)SOSTDC1可抑制胃癌的致瘤性。可見SOSTDC1在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有必要對(duì)其進(jìn)行更加廣泛、深入的研究。而miR-32-5p與SOSTDC1二者之間的相互關(guān)系尚未被報(bào)道過(guò)，此二者在胃癌中的內(nèi)在聯(lián)系和機(jī)制也尚未被研究過(guò)，因此最終選定miR-32-5p與SOSTDC1作為研究目標(biāo)，為胃癌提供新的研究思路和潛在靶點(diǎn)。

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胃癌細(xì)胞內(nèi)的miR-32-5p相比于胃上皮細(xì)胞呈高水平狀態(tài)。根據(jù)表達(dá)情況，在高表達(dá)的胃癌細(xì)胞中選取MKN-45，對(duì)其進(jìn)行過(guò)表達(dá)及敲除。qRT-PCR結(jié)果表明，在MKN-45細(xì)胞中所進(jìn)行的miR-32-5p過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染及敲除轉(zhuǎn)染皆有效，由此進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)進(jìn)一步研究證明，在胃癌細(xì)胞MKN-45中，上調(diào)miR-32-5p的表達(dá)時(shí)細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡受到抑制；而抑制miR-32-5p的表達(dá)時(shí)細(xì)胞增殖能力減弱、細(xì)胞凋亡受到促進(jìn)。綜合以上結(jié)果可知，miR-32-5p可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。

同時(shí)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，其結(jié)果顯示SOSTDC1在胃癌組織中處于低水平狀態(tài)。Cui等[33]和Gopal等[34]也通過(guò)研究證實(shí)SOSTDC1在胃癌中低表達(dá)。而根據(jù)前面研究結(jié)果顯示的miR-32-5p在胃癌中呈高水平狀態(tài)，可初步判斷miR-32-5p與SOSTDC1可能呈負(fù)相關(guān)。隨后通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)miR-32-5p靶向結(jié)合SOSTDC1，也可間接印證miR-32-5p與SOSTDC1呈負(fù)相關(guān)的判斷。此外，Western blot實(shí)驗(yàn)揭示了，miR-32-5p在胃癌細(xì)胞內(nèi)抑制SOSTDC1的表達(dá)，可再次驗(yàn)證上述判斷。綜合以上結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)miR-32-5p在胃癌細(xì)胞內(nèi)可靶向結(jié)合SOSTDC1并抑制其表達(dá)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路作為癌癥進(jìn)展中的一條基本調(diào)控途徑，已被證明與癌癥的轉(zhuǎn)移、血管新生、增殖、凋亡、糖酵解等惡性行為密切相關(guān)[35,36]。在該信號(hào)通路中，當(dāng)Wnt被激活時(shí)，可導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生積累，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。本研究通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，過(guò)表達(dá)miR-32-5p時(shí)胃癌細(xì)胞內(nèi)β-catenin、p-GSK3β蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高；而敲低miR-32-5p時(shí)細(xì)胞內(nèi)β-catenin、p-GSK3β蛋白的相對(duì)表達(dá)量下降?？梢妋iR-32-5p在胃癌細(xì)胞中促進(jìn)Wnt/β-catenin通路的異常激活，且可能是通過(guò)此種異常激活進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。此外，SOSTDC1也被報(bào)道顯示出抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路及增殖的特性[33,34,37]。由此可知，在胃癌中miR-32-5p可能是通過(guò)靶向抑制SOSTDC1而誘導(dǎo)Wnt/β-catenin通路的激活，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。但胃癌中miR-32-5p對(duì)SOSTDC1的靶向調(diào)控缺乏直接性的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，此外miR-32-5p是如何通過(guò)SOSTDC1調(diào)控胃癌的增殖、凋亡表型，仍需更直接的證據(jù)以及更深入的研究探討，這也是后續(xù)的研究重點(diǎn)。

綜上所述，胃癌細(xì)胞中的miR-32-5p處于高表達(dá)狀態(tài)。且miR-32-5p通過(guò)負(fù)向調(diào)控SOSTDC1的表達(dá)促進(jìn)Wnt/β-catenin通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。miR-32-5p/SOSTDC1軸有可能為胃癌的靶向治療研究提供新的依據(jù)，但miR-32-5p對(duì)SOSTDC1的靶向調(diào)控及具體作用機(jī)制仍需進(jìn)行深入驗(yàn)證。