王 麗，陸 軍，劉金鵬，萬(wàn) 偉，秦少磊，張雅敏*

(1西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院腫瘤五病區(qū)，西安 710100；2西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院腫瘤三病區(qū)；*通訊作者,E-mail:m17782639858@163.com)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率正在迅速上升[1]。盡管EC的常規(guī)治療方法在不斷優(yōu)化，然而EC患者的預(yù)后仍然很差[2]。因此，了解EC發(fā)生的分子機(jī)制對(duì)提高診斷和治療水平具有重要意義。三結(jié)構(gòu)域蛋白44(tripartite motif-containing protein 44, TRIM44)屬于三結(jié)構(gòu)域蛋白(tripartite motif, TRIMs)家族的成員，是一種含有鋅指泛素蛋白酶結(jié)構(gòu)域的脫泛素酶[3,4]。TRIMs家族蛋白參與多種生物學(xué)功能，包括病毒介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及抑制或促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[3,4]。TRIM44在多種癌癥中上調(diào)，包括結(jié)直腸癌、卵巢癌、甲狀腺乳頭狀癌等，并且具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的功能[5-7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，TRIM44的高表達(dá)可增強(qiáng)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的放射抗性，抑制細(xì)胞凋亡[8]。最近，Li等[9]報(bào)道，TRIM44在EC組織中高表達(dá)，TRIM44的表達(dá)與國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)分期、組織學(xué)分級(jí)、肌層侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、總生存期和無(wú)瘤生存期有關(guān)?；谀壳暗难芯浚菊n題組推測(cè)TRIM44可能在EC進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可能調(diào)節(jié)EC細(xì)胞的放療敏感性。因此，本研究通過(guò)觀察TRIM44在EC癌組織中的表達(dá)模式以及TRIM44對(duì)照射處理的人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(HEC-1A)增殖、凋亡、遷移、侵襲、P62蛋白表達(dá)及核轉(zhuǎn)位、細(xì)胞核FLNA和RAD51蛋白表達(dá)的影響，旨在探討TRIM44基因?qū)C細(xì)胞生長(zhǎng)及放療敏感性的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(HEC-1A)和正常人宮頸上皮細(xì)胞(HcerEpic)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。靶向TRIM44的siRNA(siRNA-TRIM44)、陰性對(duì)照siRNA(siRNA-NC)、TRIM44過(guò)表達(dá)慢病毒(LV-TRIM44)和陰性對(duì)照慢病毒(LV-NC)均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。胎牛血清(FBS)、鏈霉素、青霉素購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。Lipofectamine 2000試劑、TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Transwell板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。PrimeScript RT試劑盒、SYBR Premix ExTaq Ⅱ Kit購(gòu)自日本Takara公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、Annexin Ⅴ-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、RIPA裂解液、增強(qiáng)型ECL試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.1.2 組織標(biāo)本收集 收集西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院30例確診的EC患者的癌組織和臨近癌旁組織，所有患者在手術(shù)前均未接受化療或放射治療?；颊吣挲g31～81歲，平均(48.45±14.35)歲。統(tǒng)計(jì)患者的FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等資料。其中，F(xiàn)IGO分期為Ⅰ+Ⅱ期14例，Ⅲ+Ⅳ期16例；組織學(xué)分級(jí)為G1級(jí)7例，G2+G3級(jí)23例；淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移16例，轉(zhuǎn)移14例。通過(guò)免疫組化法檢測(cè)癌旁組織以及EC組織中TRIM44的表達(dá)。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)癌旁組織以及不同F(xiàn)IGO分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移/未轉(zhuǎn)移的EC患者的癌組織中TRIM44 mRNA水平。本研究已獲得西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(審批號(hào)：2019GJYXZX015)，所有參與研究的患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法檢測(cè)組織標(biāo)本中TRIM44的表達(dá) 組織標(biāo)本用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片。切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇溶液中復(fù)水，然后在3%的過(guò)氧化氫中孵育10 min。在檸檬酸鹽緩沖液中煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)2 min，然后用10%的山羊血清封閉20 min。將切片在4 ℃下與TRIM44一抗(1 ∶200)孵育過(guò)夜，然后在37 ℃與山羊抗兔IgG H&L(ab207995)孵育30 min，所有切片均進(jìn)行DAB染色。在200倍放大倍數(shù)下拍攝具有代表性的照片。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 HEC-1A和HcerEpic細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中在37 ℃和5%的CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(FBS)、鏈霉素(100 μg/ml)和青霉素(100 U/ml)。

通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)HcerEpic細(xì)胞和HEC-1A細(xì)胞中TRIM44的mRNA和蛋白表達(dá)水平。

將HEC-1A細(xì)胞分為對(duì)照組、siRNA-NC組、siRNA-TRIM44組、LV-NC組和LV-TRIM44組。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用Lipofectamine 2000試劑將siRNA-NC、siRNA-TRIM44、LV-NC或LV-TRIM44轉(zhuǎn)染到對(duì)應(yīng)分組的HEC-1A細(xì)胞中。對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，通過(guò)qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證各組細(xì)胞中TRIM44的mRNA和蛋白表達(dá)水平。

根據(jù)是否進(jìn)行照射，將HEC-1A細(xì)胞分為siRNA-NC組、siRNA-TRIM44組、LV-NC組、LV-TRIM44組、8 Gy+siRNA-NC組、8 Gy+siRNA-TRIM44組、8 Gy+LV-NC組、8 Gy+LV-TRIM44組。使用Lipofectamine 2000試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，siRNA-NC組、siRNA-TRIM44組、LV-NC組和LV-TRIM44組細(xì)胞正常培養(yǎng)，8 Gy+siRNA-NC組、8 Gy+siRNA-TRIM44組、8 Gy+LV-NC組和8 Gy+LV-TRIM44組細(xì)胞進(jìn)行照射處理。照射處理方法如下：將HEC-1A細(xì)胞接種到60 mm培養(yǎng)皿中(3×104細(xì)胞/培養(yǎng)皿)。采用美國(guó)瓦里安直線加速器6-MV X射線照射細(xì)胞，源靶距：100 cm，劑量率：240 cGy/min，總劑量：8 Gy。細(xì)胞轉(zhuǎn)染及照射后，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，Annexin Ⅴ-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中TRIM44的mRNA水平。通過(guò)Western blot檢測(cè)細(xì)胞中TRIM44、p62、細(xì)絲蛋白A(FLNA)和RAD51蛋白表達(dá)水平。

1.2.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖 通過(guò)CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖。將100 μl細(xì)胞懸液接種在96孔板中(1×104個(gè)/孔)，然后培養(yǎng)48 h。加入10 μl的CCK-8并在37 ℃、5% CO2條件下避光孵育3 h。使用分光光度計(jì)在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡 使用Annexin Ⅴ-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。將106個(gè)/ml的細(xì)胞用PBS洗滌，1 500 r/min離心5 min，棄上清，重懸于195 μl的結(jié)合緩沖液中。然后，用5 μl的Annexin Ⅴ-FITC和5 μl的PI在25 ℃避光孵育15 min，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 Transwell測(cè)定細(xì)胞遷移和侵襲 使用24孔Transwell板進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲測(cè)定。用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按2×105/ml密度接種于Transwell小室上部，下部加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，在37 ℃和5% CO2條件下孵育48 h后，將遷移到下室的細(xì)胞用甲醇固定30 min，然后用結(jié)晶紫染色15 min。使用光學(xué)顯微鏡在400倍放大倍數(shù)下測(cè)量遷移細(xì)胞數(shù)量。

將上室預(yù)先用Matrigel涂覆，其他步驟相同，用于評(píng)價(jià)細(xì)胞的侵襲。

1.2.6 qRT-PCR測(cè)定TRIM44基因表達(dá)水平 使用TRIzol試劑提取組織和細(xì)胞總RNA，使用PrimeScript RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix ExTaq Ⅱ Kit在美國(guó)Applied Biosystems 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上PCR。PCR反應(yīng)程序如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。TRIM44和GAPDH(內(nèi)部對(duì)照)的引物如下：TRIM44正向5′-CCATCTGGCCGAAT-ACGTCC-3′，反向5′-TGCCTCGCTTTCTATCTCCCT-3′。GAPDH正向5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，反向5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算TRIM44的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7 Western blot測(cè)定TRIM44、p62、FLNA和RAD51蛋白表達(dá)水平 通過(guò)Western blot測(cè)定對(duì)照組、siRNA-NC組、siRNA-TRIM44組、LV-NC組和LV-TRIM44組的TRIM44蛋白表達(dá)水平。通過(guò)Western blot測(cè)定siRNA-NC組、siRNA-TRIM44組、LV-NC組、LV-TRIM44組、8 Gy+siRNA-NC組、8 Gy+siRNA-TRIM44組、8 Gy+LV-NC組和8 Gy+LV-TRIM44組的TRIM44、p62、FLNA和RAD51蛋白表達(dá)水平。收集各組細(xì)胞并采用RIPA裂解液將細(xì)胞裂解，通過(guò)Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。等量的蛋白質(zhì)在10%SDS-PAGE上進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF。將膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后與TRIM44、p62、FLNA、RAD51、Lamin B1和GAPDH一抗(均為1 ∶2 000)于4 ℃孵育過(guò)夜。第2天，將膜與山羊抗兔IgG H&L(HRP)二抗(1 ∶2 000)在室溫下孵育2 h。通過(guò)增強(qiáng)型ECL試劑盒顯影。Lamin B1和GAPDH分別作為細(xì)胞核蛋白內(nèi)參和總蛋白內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)6次。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 21.0和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析及LSD事后檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM44在EC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，TRIM44在EC癌組織或癌旁組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，細(xì)胞核中表達(dá)很少(見(jiàn)圖1A)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，癌組織中TRIM44的mRNA表達(dá)水平顯著升高(t=8.906，P<0.001，見(jiàn)圖1B)。與FIGO分期Ⅰ+Ⅱ期相比，Ⅲ+Ⅳ期癌組織中TRIM44的mRNA表達(dá)水平顯著升高(t=3.943，P<0.001，見(jiàn)圖1B)。與組織學(xué)分級(jí)G1級(jí)相比，G2+G3級(jí)癌組織中TRIM44的mRNA表達(dá)水平顯著升高(t=4.046，P<0.001，見(jiàn)圖1B)。與未轉(zhuǎn)移的患者相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中TRIM44 mRNA表達(dá)水平顯著升高(t=4.576，P<0.001，見(jiàn)圖1B)。與HcerEpic細(xì)胞相比，HEC-1A細(xì)胞中TRIM44的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.001，見(jiàn)圖2)。

與相應(yīng)對(duì)照組比較，***P<0.001圖1 TRIM44在EC組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of TRIM44 in EC tissues

與HcerEpic細(xì)胞相比，***P<0.001圖2 HEC-1A和HcerEpic細(xì)胞中TRIM44的表達(dá)Figure 2 Expression of TRIM44 in HEC-1A and HcerEpic cells

2.2 TRIM44對(duì)HEC-1A細(xì)胞增殖和凋亡的影響

轉(zhuǎn)染siRNA和慢病毒后，與對(duì)照組相比，siRNA-TRIM44組TRIM44的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)，LV-TRIM44組TRIM44的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

與對(duì)照組相比，*P<0.05圖3 HEC-1A細(xì)胞的siRNA和慢病毒轉(zhuǎn)染效率Figure 3 Transfection efficiency of siRNA and lentivirus in HEC-1A cells

CCK-8測(cè)定結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-TRIM44組和8 Gy+siRNA-NC組相對(duì)細(xì)胞活力均降低(P<0.05)。與LV-NC組相比，LV-TRIM44組相對(duì)細(xì)胞活力升高，而8 Gy+LV-NC組降低(P<0.05)。與8 Gy+siRNA-NC組相比，8 Gy+siRNA-TRIM44組相對(duì)細(xì)胞活力降低(P<0.05)。與8 Gy+LV-NC組相比，8 Gy+LV-TRIM44組相對(duì)細(xì)胞活力升高(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

與siRNA-NC組相比，*P<0.05；與LV-NC組相比，#P<0.05；與8 Gy+siRNA-NC組相比，&P<0.05；與8 Gy+LV-NC組相比，△P<0.05圖4 CCK-8測(cè)定的各組HEC-1A細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活力Figure 4 Relative cell viability of HEC-1A cells in each group determined by CCK-8

Annexin Ⅴ-FITC測(cè)定結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-TRIM44組和8 Gy+siRNA-NC組的凋亡率均升高(P<0.05)。與LV-NC組相比，8 Gy+LV-NC組的凋亡率升高(P<0.05)。與8 Gy+siRNA-NC組相比，8 Gy+siRNA-TRIM44組的凋亡率升高(P<0.05)。與8 Gy+LV-NC組相比，8 Gy+LV-TRIM44組的凋亡率降低(P<0.05，見(jiàn)圖5)。

與siRNA-NC組相比，*P<0.05；與LV-NC組相比,#P<0.05；與8 Gy+siRNA-NC組相比，&P<0.05；與8 Gy+LV-NC組相比，△P<0.05圖5 Annexin Ⅴ-FITC測(cè)定的各組HEC-1A細(xì)胞的凋亡率Figure 5 Apoptosis rate of HEC-1A cells in each group by Annexin Ⅴ-FITC

2.3 TRIM44對(duì)HEC-1A細(xì)胞遷移和侵襲的影響

Transwell測(cè)定結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-TRIM44組和8 Gy+siRNA-NC組遷移細(xì)胞數(shù)量均降低(P<0.05)。與LV-NC組相比，LV-TRIM44組遷移細(xì)胞數(shù)量升高，而8 Gy+LV-NC組降低(P<0.05)。與8 Gy+siRNA-NC組相比，8 Gy+siRNA-TRIM44組遷移細(xì)胞數(shù)量降低(P<0.05)。與8 Gy+LV-NC組相比，8 Gy+LV-TRIM44組遷移細(xì)胞數(shù)量升高(P<0.05，見(jiàn)圖6)。

與siRNA-NC組相比，*P<0.05；與LV-NC組相比,#P<0.05；與8 Gy+siRNA-NC組相比，&P<0.05；與8 Gy+LV-NC組相比，△P<0.05圖6 Transwell測(cè)定各組HEC-1A細(xì)胞的遷移 (×400)Figure 6 Migration of HEC-1A cells in each group by Transwell assay (×400)

Transwell測(cè)定結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-TRIM44組和8 Gy+siRNA-NC組侵襲細(xì)胞數(shù)量均降低(P<0.05)。與LV-NC組相比，LV-TRIM44組侵襲細(xì)胞數(shù)量升高，而8 Gy+LV-NC組降低(P<0.05)。與8 Gy+siRNA-NC組相比，8 Gy+siRNA-TRIM44組侵襲細(xì)胞數(shù)量降低(P<0.05)。與8 Gy+LV-NC組相比，8 Gy+LV-TRIM44組侵襲細(xì)胞數(shù)量升高(P<0.05，見(jiàn)圖7)。

與siRNA-NC組相比，*P<0.05；與LV-NC組相比，#P<0.05；與8 Gy+siRNA-NC組相比，&P<0.05；與8 Gy+LV-NC組相比，△P<0.05圖7 Transwell測(cè)定各組HEC-1A細(xì)胞的侵襲 (×400)Figure 7 Invasion of HEC-1A cells in each group by Transwell assay (×400)

2.4 TRIM44對(duì)HEC-1A細(xì)胞中P62蛋白表達(dá)及核轉(zhuǎn)位的影響

各組HEC-1A細(xì)胞中TRIM44蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-TRIM44組和8 Gy+siRNA-NC組TRIM44蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P<0.05)。與LV-NC組相比，LV-TRIM44組TRIM44蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，而8 Gy+LV-NC組降低(P<0.05)。與8 Gy+siRNA-NC組相比，8 Gy+siRNA-TRIM44組TRIM44蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。與8 Gy+LV-NC組相比，8 Gy+LV-TRIM44組TRIM44蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05，見(jiàn)圖8)。

各組HEC-1A細(xì)胞的總P62蛋白和細(xì)胞核中P62蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，各組HEC-1A細(xì)胞的總P62蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖8)。與siRNA-NC組相比，siRNA-TRIM44組和8 Gy+siRNA-NC組細(xì)胞核P62蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05)。與LV-NC組相比，LV-TRIM44組的細(xì)胞核P62蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，而8 Gy+LV-NC組升高(P<0.05)。與8 Gy+siRNA-NC組相比，8 Gy+siRNA-TRIM44組細(xì)胞核P62蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)。與8 Gy+LV-NC組相比，8 Gy+LV-TRIM44組的細(xì)胞核P62蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05，見(jiàn)圖8)。

與siRNA-NC組相比，*P<0.05；與LV-NC組相比，#P<0.05；與8 Gy+siRNA-NC組相比，&P<0.05；與8 Gy+LV-NC組相比，△P<0.05圖8 各組HEC-1A細(xì)胞中的TRIM44和P62蛋白表達(dá)Figure 8 TRIM44 and p62 protein expression in HEC-1A cells in each group

2.5 TRIM44對(duì)HEC-1A細(xì)胞核FLNA和RAD51蛋白表達(dá)的影響

各組HEC-1A細(xì)胞的細(xì)胞核FLNA和RAD51蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-TRIM44組和8 Gy+siRNA-NC組的細(xì)胞核FLNA和RAD51蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P<0.05)。與LV-NC組相比，LV-TRIM44組的細(xì)胞核FLNA和RAD51蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，而8 Gy+LV-NC組降低(P<0.05)。與8 Gy+siRNA-NC組相比，8 Gy+siRNA-TRIM44組的細(xì)胞核FLNA和RAD51蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。與8 Gy+LV-NC組相比，8 Gy+LV-TRIM44組的細(xì)胞核FLNA和RAD51蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05，見(jiàn)圖9)。

與siRNA-NC組相比，*P<0.05；與LV-NC組相比,#P<0.05；與8 Gy+siRNA-NC組相比，&P<0.05；與8 Gy+LV-NC組相比，△P<0.05圖9 各組HEC-1A細(xì)胞中的細(xì)胞核FLNA和RAD51蛋白表達(dá)Figure 9 Nuclear FLNA and RAD51 protein expression in HEC-1A cells in each group by Western blot

3 討論

TRIMs家族成員具有E3泛素連接酶的作用，參與多種腫瘤發(fā)生[10]。作為TRIMs蛋白家族的一員，TRIM44也屬于一種泛素水解酶[11]，并且在多種癌癥中屬于致癌基因，如TRIM44在前列腺癌[12]和卵巢癌[6]中高表達(dá)。Li等[13]研究表明，TRIM44在結(jié)直腸癌中上調(diào)，并且其高表達(dá)是患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。Kawabata等[10]研究表明，TRIM44的高表達(dá)與乳腺癌的無(wú)瘤生存期和總生存期相關(guān)。Xiong等[14]研究表明，TRIM44高表達(dá)的食道癌患者的癌細(xì)胞分化差、TNM分期高并且預(yù)后不良。本研究結(jié)果也顯示，TRIM44在EC組織中高表達(dá)，并且與FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。該結(jié)果與Li等[9]報(bào)道的結(jié)果一致，然而，TRIM44在EC中的具體功能尚不明確。

本研究結(jié)果表明，TRIM44的下調(diào)抑制了EC細(xì)胞系HEC-1A細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。然而，TRIM44的上調(diào)則促進(jìn)了HEC-1A細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，但未影響細(xì)胞凋亡，其原因可能是正常情況下HEC-1A細(xì)胞的凋亡較少，TRIM44的上調(diào)對(duì)凋亡的影響微乎其微。本研究中TRIM44對(duì)EC細(xì)胞的影響基本與其他癌細(xì)胞一致，主要發(fā)揮致癌作用。最近，有文獻(xiàn)報(bào)道TRIMs家族成員參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的放化療敏感性[15-17]。本研究進(jìn)一步考察了TRIM44對(duì)EC細(xì)胞放療敏感性的影響，結(jié)果顯示，HEC-1A細(xì)胞經(jīng)照射后，TRIM44的表達(dá)水平降低。TRIM44的下調(diào)增強(qiáng)了HEC-1A細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，表現(xiàn)為增殖、遷移和侵襲水平降低，而細(xì)胞凋亡水平升高。然而，TRIM44的上調(diào)則起到了相反的作用。因此，本研究揭示了TRIM44參與調(diào)節(jié)EC細(xì)胞的放療敏感性。

自噬是一種保守的細(xì)胞內(nèi)自我降解過(guò)程，細(xì)胞蛋白或細(xì)胞器被雙膜自噬小體包裹，最終與溶酶體融合[18]。在EC的發(fā)病機(jī)制中，自噬具有雙重作用，自噬在早期抑制腫瘤的形成，然后在隨后的發(fā)展階段促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[19]。另外，自噬參與癌細(xì)胞的放療抵抗，通過(guò)不同途徑來(lái)抑制自噬、增加自噬和改變自噬可增加癌細(xì)胞的放療敏感性[20-22]。p62是一種參與形成細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白質(zhì)聚集體的自噬相關(guān)蛋白，又稱為SQSTM1[23]，p62參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝等多種復(fù)雜生理活動(dòng)[24]。由于TRIM44屬于一種泛素水解酶，本研究推測(cè)TRIM44可能通過(guò)調(diào)節(jié)p62來(lái)影響自噬，從而調(diào)節(jié)EC細(xì)胞的放療敏感性。本研究表明，HEC-1A細(xì)胞經(jīng)照射后，細(xì)胞核P62蛋白的表達(dá)水平升高。TRIM44的上調(diào)或下調(diào)未影響P62總蛋白的表達(dá)水平，然而，TRIM44的上調(diào)抑制了p62的核轉(zhuǎn)位，而TRIM44的下調(diào)則促進(jìn)了p62的核轉(zhuǎn)位。Lyu等[8]研究表明，TRIM44可與p62結(jié)合，并通過(guò)其去泛素化作用促進(jìn)了p62寡聚化，阻止p62響應(yīng)照射易位到細(xì)胞核。這些結(jié)果說(shuō)明TRIM44可能通過(guò)抑制p62的核轉(zhuǎn)位來(lái)調(diào)節(jié)EC細(xì)胞的放療敏感性。

DNA損傷修復(fù)是一個(gè)感知DNA損傷并招募修復(fù)因子的系統(tǒng)，控制基因組的完整性[25]。因此，靶向DNA損傷修復(fù)可能會(huì)改善癌癥治療結(jié)局。細(xì)絲蛋白A(filamin A，F(xiàn)LNA)是一種DNA損傷修復(fù)蛋白[26]，RAD51是一種DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白[27]。Hewitt等[28]研究表明，在誘導(dǎo)DNA損傷時(shí)，p62與FLNA相互作用，后者招募RAD51，p62促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)FLNA和RAD51的蛋白酶體降解，導(dǎo)致核RAD51水平降低和DNA修復(fù)減慢。本研究表明，TRIM44的上調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞核FLNA和RAD51的蛋白表達(dá)，而TRIM44的下調(diào)則抑制了細(xì)胞核FLNA和RAD51的蛋白表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明TRIM44阻止了p62易位到EC細(xì)胞核，導(dǎo)致FLNA和RAD51在細(xì)胞核內(nèi)不會(huì)降解，從而促進(jìn)了DNA損傷修復(fù)并增加了癌細(xì)胞活性。Lyu等[8]研究表明，TRIM44高表達(dá)增強(qiáng)了多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)，與本文研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究表明TRIM44的高表達(dá)促進(jìn)了EC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，TRIM44的高表達(dá)抑制了p62的核轉(zhuǎn)位，從而無(wú)法降解細(xì)胞核內(nèi)FLNA和RAD51，導(dǎo)致DNA修復(fù)增加、癌細(xì)胞活性和放療抗性升高。因此，TRIM44可能是EC治療和改善放療敏感性的潛在靶標(biāo)。