常 盼，于 軍，王建榜，張 靜，陳偉國(guó)，劉建榮*

(1西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，西安 710038；2陜西省心血管內(nèi)科疾病臨床醫(yī)學(xué)研究分中心；*通訊作者,E-mail:49532697@qq.com)

衰老是重要的健康風(fēng)險(xiǎn)因素之一，也是大多數(shù)疾病，尤其是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。衰老可使多種代謝性疾病和心血管疾病的發(fā)生率增高，如冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓、肥胖、胰島素抵抗(代謝綜合征)、充血性心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化和中風(fēng)等，進(jìn)而導(dǎo)致老齡人的患病率和死亡率提高[1-3]。研究表明，一定強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)老齡人群健康具有明顯的益處[4]。運(yùn)動(dòng)可降低老年相關(guān)心血管疾病的發(fā)生率，其潛在機(jī)制不僅僅是減少心血管危險(xiǎn)因素，還包括改善血管內(nèi)皮功能、抗氧化能力、抗炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等[5-7]。鈉尿肽是機(jī)體調(diào)節(jié)心血管生理功能重要的內(nèi)源性肽類物質(zhì)，具有舒張血管、降低血壓等效應(yīng)[8,9]。然而，衰老和運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌鈉尿肽有何影響至今少有報(bào)道。本研究選取20月齡的老齡鼠作為研究對(duì)象，從鈉尿肽信號(hào)角度入手，研究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡小鼠心肌功能及鈉尿肽信號(hào)的作用及可能的機(jī)制，探討衰老和運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌鈉尿肽信號(hào)的影響，以及鈉尿肽信號(hào)在運(yùn)動(dòng)改善老齡小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能中的作用，以期為運(yùn)動(dòng)在預(yù)防衰老心肌損傷的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用4月齡雄性C57BL/6J小鼠作為青年組，20月齡雄性C57BL/6J小鼠作為老齡組進(jìn)行研究。雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院臨床試驗(yàn)中心，室內(nèi)溫度23～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，小鼠自由飲水和攝食。隨機(jī)將老齡組小鼠分為老齡組和老齡運(yùn)動(dòng)組。本研究動(dòng)物可分為3組：青年組、老齡組和老齡運(yùn)動(dòng)組(aged+exercise，aged+E)，每組15只。

1.2 有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練采取游泳運(yùn)動(dòng)，首先為期1周的適應(yīng)性游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，即小鼠在第1天游泳15 min適應(yīng)性訓(xùn)練后，游泳時(shí)間逐漸增加，在1周內(nèi)累積增至60 min/d。然后進(jìn)行8周的游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，小鼠在32～35 ℃的水中進(jìn)行無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)，每天游泳60 min，5 d/周，持續(xù)運(yùn)動(dòng)8周。所有運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練均在上午8∶00～11∶00進(jìn)行，此過(guò)程參考課題組已經(jīng)發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)[10]。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠心臟功能

采用連續(xù)超聲Vevo 2100系統(tǒng)非侵入性的方法檢測(cè)小鼠心功能。使用3%異氟烷麻醉小鼠，1%異氟烷維持小鼠麻醉狀態(tài)，通過(guò)調(diào)整探頭方向，使清晰顯示出小鼠心臟的心尖部位、三腔部位、四腔部位、五腔切面及左室長(zhǎng)軸等切面。通過(guò)手持操縱超聲換能器獲得2D和2D引導(dǎo)M模式的超聲心動(dòng)圖，分別測(cè)量左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)、左心室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左心室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)。

1.4 心肌組織中Caspase-3、MDA、SOD及ROS檢測(cè)

取小鼠左室相同部位的心肌組織，進(jìn)行裂解提取蛋白，按照購(gòu)自南京建成生物公司的Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，取適量的反應(yīng)液后混勻，避光37 ℃孵育4 h后，使用多功能酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算Caspase-3活化程度。

心肌組織MDA的測(cè)定按照購(gòu)自南京建成生物公司的MDA測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，樣品加入檢測(cè)試劑后混勻，95 ℃水浴加熱40 min后冷卻，3 500 r/min離心10 min，取上清，使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算MDA含量。

心肌組織的蛋白提取后測(cè)定蛋白濃度，稀釋蛋白后按照購(gòu)自南京建成生物公司的SOD測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，按照說(shuō)明書的反應(yīng)體系進(jìn)行配制，37 ℃孵育20 min后，使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算SOD含量。

心肌組織ROS的含量，按照購(gòu)自南京建成生物公司的ROS測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，使用酶消化法制備心肌組織懸液，加入熒光探針后37 ℃孵育30 min離心，棄上清，使用PBS洗滌2次，離心加入PBS重懸，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，激發(fā)波長(zhǎng)為500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，計(jì)算ROS水平。

1.5 血漿中ANP和BNP含量

將小鼠麻醉后，采用眼眶取血的方法進(jìn)行采血，將血收集到1.5 ml離心管中，室溫靜置2 h或在4 ℃冰箱靜置過(guò)夜后，4 ℃，1 000 r/min離心15 min，取上清，分別采用武漢優(yōu)爾生生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的ANP和BNP檢測(cè)試劑盒，采用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)血清中ANP、BNP的含量。

1.6 Western blot檢測(cè)ANP和BNP蛋白含量

提取小鼠心肌組織蛋白，按照碧云天BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，在恒流250 mA，120 min的條件下，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，采用5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，使用abcam公司的蛋白一抗ANP、BNP及β-actin(1 ∶1 000)在4 ℃孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔的二抗(1 ∶3 000)室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)免疫印跡。

1.7 心肌組織PKG及cGMP的活性檢測(cè)

取各組小鼠左室相同部位的心肌組織，進(jìn)行蛋白裂解，按照上海生工生物工程有限公司的cGMP的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，依次加入工作液和反應(yīng)終止液，采用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)心肌組織中cGMP的含量。采用普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司的PKG活性檢測(cè)試劑盒，加入反應(yīng)液，室溫反應(yīng)后按照說(shuō)明書操作檢測(cè)PKG活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡小鼠心臟功能的影響

采用小動(dòng)物超聲儀檢測(cè)小鼠左心功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與青年組相比，老齡組小鼠心臟的LVEF和LVFS顯著降低(P<0.01)，LVESD顯著增加(P<0.01)；與老齡組相比，老齡運(yùn)動(dòng)組心肌的LVEF和LVFS提高(P<0.05)，LVESD降低(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

與青年組相比，**P<0.01；與老齡組相比，#P<0.05圖1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡小鼠心肌功能的影響Figure 1 Effects of aerobic exercise on myocardial function in aged mice

2.2 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡小鼠心肌組織凋亡及氧化應(yīng)激的影響

通過(guò)檢測(cè)心肌凋亡Caspase-3和氧化應(yīng)激MDA、SOD及ROS的相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與青年組相比，老齡組小鼠心肌組織Caspase-3活性顯著升高(P<0.01)，氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA和ROS的活性顯著增加(P<0.01)，而SOD活性顯著降低(P<0.01)；與老齡組相比，老齡運(yùn)動(dòng)組小鼠心肌組織Caspase-3、MDA和ROS的活性降低(P<0.01或P<0.05)，SOD活性提高(P<0.01，見(jiàn)圖2)。

與青年組相比，**P<0.01；與老齡組相比，#P<0.05，##P<0.01圖2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡小鼠心肌凋亡和氧化應(yīng)激的影響Figure 2 Effects of aerobic exercise on myocardial apoptosis and oxidative stress in aged mice

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡小鼠鈉尿肽含量的影響

通過(guò)檢查小鼠血漿ANP和BNP含量，結(jié)果顯示，與青年組相比，老齡組小鼠血漿ANP和BNP含量增加(P<0.05)；與老齡組相比，老齡運(yùn)動(dòng)組小鼠血漿BNP含量降低(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

與青年組相比，*P<0.05；與老齡組相比，#P<0.05圖3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡小鼠血漿鈉尿肽的影響Figure 3 Effects of aerobic exercise on plasma natriuretic peptide in aged mice

進(jìn)一步檢測(cè)了小鼠心肌組織ANP和BNP蛋白表達(dá)含量，結(jié)果顯示，與青年組相比，老齡組小鼠心肌ANP和BNP的表達(dá)含量增加(P<0.05)；與老齡組相比，老齡運(yùn)動(dòng)組小鼠心肌BNP表達(dá)含量降低(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

與青年組相比，*P<0.05；與老齡組相比，#P<0.05圖4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡小鼠心肌鈉尿肽含量的影響Figure 4 Effects of aerobic exercise on natriuretic peptide in aged mice

2.4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)cGMP-PKG信號(hào)通路的影響

與青年組小鼠相比，老齡組小鼠心肌組織cGMP和PKG的活性顯著降低(P<0.01)；與老齡組小鼠相比，老齡運(yùn)動(dòng)組小鼠心肌組織cGMP和PKG的活性顯著提高(P<0.01或P<0.05，見(jiàn)圖5)。

與青年組相比，**P<0.01；與老齡組相比，#P<0.05，##P<0.01圖5 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡小鼠心肌鈉尿肽信號(hào)的影響Figure 5 Effects of aerobic exercise on natriuretic peptide signaling pathway in aged mice

3 討論

人口老齡化是當(dāng)今世界各國(guó)亟待解決的主要問(wèn)題之一，尤其是我國(guó)尚處于發(fā)展中國(guó)家，人口基數(shù)大，人口老齡化問(wèn)題對(duì)社會(huì)發(fā)展的影響尤為嚴(yán)重[11]。2019年我國(guó)60歲以上人口約為2.54億，占總?cè)丝诘?7.9%，預(yù)計(jì)到2050年我國(guó)60歲以上人口將超過(guò)4億[12]。衰老作為老齡相關(guān)性疾病發(fā)生和發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，因此衰老及其相關(guān)疾病的預(yù)防和治療已成為亟待解決的社會(huì)現(xiàn)實(shí)問(wèn)題[13]。與衰老相關(guān)的疾病如心血管疾病、阿爾茲海默病、肌肉減少癥以及骨質(zhì)疏松等威脅著老齡人群的健康，使老齡人的生活質(zhì)量大幅度降低，甚至對(duì)家庭以及對(duì)整個(gè)國(guó)家都造成很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。已有文獻(xiàn)表明，心血管疾病的危險(xiǎn)因素(如糖尿病、高血壓等)的患病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，這些將導(dǎo)致老齡人心血管疾病的發(fā)病率不斷增高[14,15]。由于衰老會(huì)增加心臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)并降低器官功能，制定對(duì)抗心臟衰老和闡明相關(guān)機(jī)制的研究具有重要的臨床意義。

ANP、BNP和CNP是目前研究較為清楚的鈉尿肽成員。ANP主要由心房分泌，BNP在心房和心室均表達(dá)，但主要是由心室產(chǎn)生和釋放[16,17]。CNP主要在內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生，參與血管重塑[18]。鈉尿肽主要通過(guò)與他們的細(xì)胞表面膜受體結(jié)合后激活cGMP含量。cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要介質(zhì)是PKG，可進(jìn)一步磷酸化心血管系統(tǒng)中的多種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)[19]。進(jìn)一步發(fā)揮主要包括利尿、血管舒張、抑制醛固酮合成和腎素分泌等功能[20,21]。有報(bào)道稱，長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)大鼠心肌的抗氧化能力[22]，但具體機(jī)制仍不清楚。在本次研究中，結(jié)果顯示老齡小鼠心臟功能顯著增加，同時(shí)心肌凋亡和氧化應(yīng)激增加，ANP和BNP的表達(dá)上調(diào)，cGMP-PKG的信號(hào)通路下調(diào)，提示老齡小鼠心肌損傷和心肌鈉尿肽信號(hào)通路受損，可能由于衰老導(dǎo)致心肌鈉尿肽敏感性降低，鈉尿肽出現(xiàn)代償性增高的表現(xiàn)。有氧運(yùn)動(dòng)可改善心肌功能，降低心肌組織凋亡和氧化應(yīng)激，降低BNP含量，激活cGMP-PKG通路，表明有氧運(yùn)動(dòng)可減輕老齡小鼠心臟功能損傷，恢復(fù)鈉尿肽信號(hào)通路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)老齡小鼠心肌凋亡和氧化應(yīng)激增加，心肌鈉尿肽信號(hào)通路受損，心臟功能受損，有氧運(yùn)動(dòng)可降低心肌凋亡和氧化應(yīng)激，激活鈉尿肽信號(hào)通路，改善老齡小鼠心臟功能。該研究從鈉尿肽信號(hào)通路的角度提供了有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡心肌有益效應(yīng)的科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。