李 茸，王 娟

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科，西安 710061；*通訊作者,E-mail:wangjuan3890@163.com)

缺氧是實(shí)體瘤特異性的生理性異常。由于腫瘤的快速生長(zhǎng)，實(shí)體瘤的體積不斷增大，其組織內(nèi)部無(wú)法獲得足夠的血液供應(yīng)，出現(xiàn)氧的供求失調(diào)。正常組織中平均氧分壓在40～60 mmHg，而將近50%的實(shí)體瘤中平均氧分壓不足10 mmHg[1]。缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)腫瘤生物學(xué)行為的適應(yīng)和改變，這一影響主要表現(xiàn)在缺氧可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的基因組發(fā)生突變，并編碼產(chǎn)生變異型蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)，主動(dòng)逃避對(duì)其不利的環(huán)境，并增強(qiáng)其增殖能力，加速對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移[2]。隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤組織VEGF的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，促進(jìn)了新生血管的發(fā)生。新生的滋養(yǎng)血管既為腫瘤組織帶來(lái)了細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖所必需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)緩解因腫瘤組織快速生長(zhǎng)而導(dǎo)致內(nèi)部的缺氧狀態(tài)，又為腫瘤細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移提供了快捷通道。如果腫瘤的血管化程度越高，則患者預(yù)后越差，越容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。VEGF及其受體通過(guò)介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，并且增強(qiáng)了血管的通透性，有利于腫瘤新生血管的生成[4]。如何高效地靶向抑制腫瘤細(xì)胞中VEGF基因的表達(dá)，進(jìn)而阻斷腫瘤血管生成信號(hào)或者直接作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡，這有可能作為腫瘤治療新的作用靶點(diǎn)。因此在本文的研究中，利用VEGF-shRNA慢病毒載體，探索慢病毒感染宮頸癌細(xì)胞C33A的適宜條件，同時(shí)觀察病毒轉(zhuǎn)染后VEGF基因沉默對(duì)宮頸癌細(xì)胞C33A凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

宮頸癌細(xì)胞系C33A，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室凍存，復(fù)蘇后使用。促感染藥物聚凝胺(Polybrene)和慢病毒載體系統(tǒng)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司。1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO和Trizol購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))。0.25%胰酶，RIPA裂解液和Annexin Ⅴ-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技研究所。

1.2 細(xì)胞感染復(fù)數(shù)的測(cè)定

分別接種3×103～5×103個(gè)C33A細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板各孔中，所加培養(yǎng)基體積為100 μl，細(xì)胞融合度為30%～50%時(shí)，進(jìn)行病毒感染。干擾預(yù)試驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組均設(shè)置相同的梯度細(xì)胞感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)值。對(duì)照組為正常情況下感染，即在完全培養(yǎng)基中直接加入病毒；實(shí)驗(yàn)組為感染時(shí)添加5 μg/ml的Polybrene，再加入病毒。感染前為細(xì)胞換液，吸去細(xì)胞上清，按不同分組情況加入所需的培養(yǎng)基90 μl，每組4個(gè)復(fù)孔。準(zhǔn)備2個(gè)無(wú)菌的EP管，吸取10 μl×108TU/ml的病毒加入到第一個(gè)管子中，輕柔混勻。同樣從第一管中吸取10 μl的病毒到第二管中，混勻。這樣就得到了3個(gè)不同梯度的病毒：原液、10倍稀釋、100倍稀釋。同理稀釋病毒液得到50倍稀釋濃度。將上述4個(gè)不同梯度的病毒液，各取10 μl加到每組的4個(gè)孔中，則此時(shí)4孔的MOI分別為100，50，10，1。把細(xì)胞放回培養(yǎng)箱孵育。病毒感染12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，病毒感染24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。病毒感染72 h后，觀察熒光表達(dá)情況。本小節(jié)的實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用不同的病毒濃度，是否添加Polybrene，摸索慢病毒對(duì)C33A細(xì)胞的最佳感染條件。

1.3 病毒感染效率的檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C33A細(xì)胞胰蛋白酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用完全DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)將細(xì)胞濃度稀釋至3×105/ml，移入無(wú)菌6孔板中，每孔2 ml；37 ℃，5% CO2飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，更換培養(yǎng)液為含8 μg/ml聚凝胺的完全DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS)，2 ml/孔，根據(jù)前述實(shí)驗(yàn)得到的MOI值，加入適量病毒液至6孔板內(nèi)；37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取20個(gè)視野，分別在熒光以及可見(jiàn)光下計(jì)數(shù)表達(dá)綠色熒光細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算感染效率。

1.4 C33A細(xì)胞的感染

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的C33A細(xì)胞，常規(guī)消化制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×105/孔的濃度接種于6孔板中，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照“1.2細(xì)胞感染復(fù)數(shù)的測(cè)定”摸索出的最佳感染條件，感染C33A細(xì)胞。病毒感染12 h以后觀察細(xì)胞狀態(tài)，病毒感染24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。病毒感染72 h后，觀察熒光表達(dá)情況。

1.5 慢病毒干擾對(duì)C33A細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響

大量培養(yǎng)C33A細(xì)胞，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C33A細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組(實(shí)驗(yàn)中使用普通培養(yǎng)基，不添加病毒干擾)、陰性對(duì)照組(使用含有無(wú)意義鏈shRNA-scr的慢病毒載體)、實(shí)驗(yàn)組(使用含有VEGF-shRNA的慢病毒載體)。按照前述實(shí)驗(yàn)(1.2細(xì)胞感染復(fù)數(shù)的測(cè)定)摸索出的最佳感染條件，按上述分組分別感染C33A細(xì)胞。病毒感染12 h以后觀察細(xì)胞狀態(tài)，病毒感染24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。病毒感染72 h后，觀察熒光表達(dá)情況。再次更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)。

使用Western blotting檢測(cè)C33A細(xì)胞的VEGF蛋白表達(dá)。每瓶細(xì)胞加入400 μl RIPA(混合裂解液)，裂解完后離心并提取細(xì)胞中的總蛋白。使用二辛可酸(bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)定蛋白含量，分別配制工作液和稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，每管中加入200 μl BCA工作液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)562 nm的OD值，根據(jù)得到的OD值編制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本的蛋白濃度。將已定量的蛋白樣品5份加1份6×loading buffer(上樣緩沖液)使其溶解充分，樣品在沸水中加熱讓蛋白變性，計(jì)算出每個(gè)樣本所需上樣的體積。制備聚丙烯酰胺凝膠電泳并上樣、轉(zhuǎn)膜，放置5%脫脂牛奶中孵育。將VEGF兔抗人多克隆單抗(一抗)、兔抗人β-actin單克隆單抗分別稀釋至1 ∶1 000～1 ∶2 000，將抗體溶液加到封口膜上，次日取出室溫下用PBST(磷酸緩沖鹽溶液)脫色搖床上洗滌。按上述方法稀釋制備鼠抗兔二抗(1 ∶3 000)，與膜接觸后用PBST液洗滌后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。對(duì)膠片拍照或掃描，通過(guò)凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶的分子量以及凈光密度值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干擾后C33A細(xì)胞的凋亡

實(shí)驗(yàn)分組和細(xì)胞感染方法同前，其中每組各設(shè)3個(gè)重復(fù)，獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。從病毒感染后72 h開(kāi)始重新計(jì)時(shí)，分3個(gè)時(shí)間點(diǎn)即24，48，72 h時(shí)分別終止培養(yǎng)細(xì)胞，按Annexin Ⅴ/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 C33A細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)

根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)分組，在熒光顯微鏡下觀測(cè)病毒感染后C33A細(xì)胞的熒光表達(dá)情況。當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOI)為100，呈現(xiàn)較明顯的細(xì)胞毒性，C33A細(xì)胞部分凋亡，失去貼壁能力而漂浮于培養(yǎng)液中；當(dāng)MOI為10和1時(shí)，病毒數(shù)量不足以感染多數(shù)C33A細(xì)胞，熒光鏡下綠色熒光細(xì)胞數(shù)量不足30%；當(dāng)MOI為50時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)良好，未見(jiàn)明顯凋亡，熒光細(xì)胞數(shù)量超過(guò)50%(見(jiàn)圖1)。使用促感染劑Polybrene能夠明顯提高病毒的感染效率，當(dāng)MOI=50且使用5 μg/ml的Polybrene時(shí)，慢病毒感染對(duì)C33A細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性并達(dá)到最佳感染效果，熒光細(xì)胞數(shù)量超過(guò)80%，此時(shí)為C33A細(xì)胞的最佳感染條件。

A.5 μg/ml Polybrene+MOI 50 B.MOI=50C.MOI=10D.MOI=1圖1 不同條件下慢病毒對(duì)C33A細(xì)胞的感染差異 (×100)Figure 1 Infection efficacy of lentivirus to C33A cells under different conditions (×100)

2.2 病毒的感染效率

按表1條件換算不同培養(yǎng)體系下的病毒用量。

表1 病毒感染細(xì)胞所用培養(yǎng)基體積和病毒量參考Table 1 Volume of medium and amount of virus for virus infection

通過(guò)計(jì)算GFP報(bào)告基因的表達(dá)情況可估算出慢病毒的感染效率，結(jié)果顯示當(dāng)MOI=50且使用5 μg/ml的Polybrene時(shí)，LV-VEGF-shRNA慢病毒載體的感染效率約為83%(見(jiàn)圖2)。此時(shí)慢病毒對(duì)C33A細(xì)胞達(dá)到最佳的感染率，同時(shí)對(duì)細(xì)胞毒性最小，腫瘤細(xì)胞存活率最高。

2.3 慢病毒干擾下調(diào)C33A細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)

提取各組C33A細(xì)胞的總蛋白，Western blotting檢測(cè)C33A細(xì)胞中VEGF蛋白的表達(dá)情況如下：各組細(xì)胞均有VEGF蛋白表達(dá)，將空白對(duì)照組的VEGF蛋白表達(dá)量設(shè)置為“1”，實(shí)驗(yàn)組VEGF蛋白表達(dá)量與陰性對(duì)照組相比明顯降低(23.3%±1.2%vs96.7%±1.8%，P<0.05，見(jiàn)圖3)。上述結(jié)果提示C33A細(xì)胞在慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA干擾下，VEGF蛋白的表達(dá)量明顯降低。

與陰性對(duì)照組相比，*P<0.05圖3 Western blotting檢測(cè)病毒感染后C33A細(xì)胞的VEGF蛋白表達(dá)情況Figure 3 Expression of VEGF protein in C33A cells after virus infection by Western blotting

2.4 干擾后C33A細(xì)胞的凋亡情況

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：在24 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率高于陰性對(duì)照組，以早期凋亡為主(見(jiàn)表2，圖4)。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡進(jìn)一步加劇，在72 h時(shí)細(xì)胞的總凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡之和)達(dá)到46%，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞均可見(jiàn)，凋亡率與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。陰性對(duì)照組在72 h時(shí)，亦有部分細(xì)胞凋亡出現(xiàn)，以早期凋亡為主。

圖4 病毒感染不同時(shí)間后C33A細(xì)胞的凋亡Figure 4 Apoptosis of C33A cells at different time points after virus infection

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干擾后C33A細(xì)胞的總凋亡率 (%)Table 2 Apoptosis rate of C33A cells after interference by flow cytometry (%)

3 討論

在正常情況下，血管生成是高度有序的過(guò)程，是在嚴(yán)格監(jiān)管下同時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)血管生成和抑制血管生成的協(xié)同過(guò)程。這些影響因素包括從細(xì)胞中分泌的可溶性生長(zhǎng)因子[5]，如VEGF，血管緊張素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)和膜蛋白結(jié)合分子(如整合素、鈣黏素和ephrins等)。其他輔助細(xì)胞如毛細(xì)血管周皮細(xì)胞則起到血管支撐作用，并促進(jìn)新生脈管系統(tǒng)的進(jìn)一步發(fā)育成熟[6]。腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成的過(guò)程，模仿部分正常的血管生成過(guò)程，但腫瘤組織中VEGF的高水平表達(dá)賦予腫瘤血管其獨(dú)特的性能[7]。VEGF及其受體的作用通過(guò)介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，并且增強(qiáng)了血管的通透性[8]。Olusola等[9]研究證明在原發(fā)性腫瘤中血管發(fā)生越多，腫瘤的預(yù)后就越差，這表明血管發(fā)生與腫瘤的轉(zhuǎn)移有著直接的關(guān)系。因此，通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)實(shí)現(xiàn)腫瘤的抗血管生成，能夠抑制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

本研究成功構(gòu)建了針對(duì)VEGF-shRNA慢病毒干擾載體，首先檢測(cè)了C33A細(xì)胞的慢病毒感染復(fù)數(shù)MOI，本文中病毒MOI的測(cè)定是在96孔板中進(jìn)行，下一步的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系將擴(kuò)增。擴(kuò)增的方法是保持細(xì)胞的密度，將培養(yǎng)基的體積按實(shí)際細(xì)胞數(shù)與預(yù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)的比例放大，這樣操作的結(jié)果可以保持病毒濃度不變[10]。當(dāng)實(shí)驗(yàn)操作保持細(xì)胞密度不變時(shí)，就可以通過(guò)計(jì)算培養(yǎng)板中培養(yǎng)基的體積，而計(jì)算出細(xì)胞的總數(shù)。理論上加入相同濃度的病毒越多，被感染的細(xì)胞也會(huì)越多，但在實(shí)際操作中效果并不明顯，因?yàn)槁《据d體是一個(gè)接近100 nm大小的顆粒，在溶液上層中的病毒顆粒很少有機(jī)會(huì)接近細(xì)胞。感染時(shí)，減少培養(yǎng)基的體積反而能提高病毒的利用效率，相同的病毒在小體積中的感染效果要好于大體積中的。本文中最終驗(yàn)證在MOI為50的情況下且使用5 μg/ml的Polybrene時(shí)，慢病毒感染對(duì)C33A細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性并達(dá)到最佳感染效果，感染效果超過(guò)80%。成功感染慢病毒后，C33A細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)量明顯降低，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示感染后的C33A細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對(duì)照組，并隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的凋亡進(jìn)一步加劇，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性，因此通過(guò)RNAi沉默VEGF基因表達(dá)導(dǎo)致C33A宮頸癌細(xì)胞的凋亡。

同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)攜帶有無(wú)意義shRNA的陰性對(duì)照組中，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)同樣受到了輕度的抑制，這可能和病毒對(duì)宮頸癌細(xì)胞的毒性有關(guān)，在使用大劑量病毒后，可能導(dǎo)致部分腫瘤細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞分泌的減少導(dǎo)致了VEGF的表達(dá)下降[11]。這樣的結(jié)果提示：相對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(retrovirus，RV)、腺病毒載體(adenovirus，Ad)和腺相關(guān)病毒載體，慢病毒干擾載體因其較小的免疫原性和較高的病毒滴度，適合進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，而且慢病毒能夠高效轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞和終末分化細(xì)胞，故尤其適用于其他方法難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞、原代細(xì)胞和懸浮細(xì)胞)[12]。但在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)大劑量使用慢病毒載體時(shí)，仍然導(dǎo)致了部分腫瘤細(xì)胞的非預(yù)期凋亡，如何減輕慢病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用，提高慢病毒針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性，是下一步深入研究的方向。