蔣涵超 宋良

隨著人們生活水平不斷提升，人們外出就餐的機(jī)會(huì)越來(lái)越多，在外出就餐過(guò)程中，通常不能完全保證食品安全問(wèn)題。根據(jù)臨床大量研究表明[1]，全球范圍內(nèi)食物中毒事件以沙門菌感染為主。沙門菌主要存在于人體腸道當(dāng)中，一旦出現(xiàn)沙門菌感染就會(huì)引起患者嘔吐、惡心等癥狀，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)休克等癥狀，對(duì)患者的生命安全帶來(lái)一定威脅。腸熱癥是因沙門菌感染導(dǎo)致的疾病，發(fā)病率較高，臨床上主要通過(guò)全面生化反應(yīng)、血清學(xué)檢驗(yàn)等檢查方式進(jìn)行干預(yù)，有助于及時(shí)對(duì)疾病進(jìn)行診斷，并為患者提供臨床治療依據(jù)[2]。本文主要以張家港市第五人民醫(yī)院收治的40 例腸熱癥患者作為研究樣本，對(duì)患者實(shí)施全面生化反應(yīng)與血清學(xué)檢驗(yàn)方法，分析其檢驗(yàn)準(zhǔn)確率，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取張家港市第五人民醫(yī)院2020年1月至2021年7月期間接受治療的疑似腸熱癥患者40 例作為研究對(duì)象，主要判斷依據(jù)：急性起病，有發(fā)熱、畏寒癥狀，常伴有惡心嘔吐、咳嗽、腹痛、腹瀉，糞便多為黃色或綠色稀水便，帶有黏液或血等[3]；經(jīng)病原菌的分離與培養(yǎng)、藥物敏感分析確診以上40例均為沙門菌感染。男性22 例，女性18 例；年齡20～49 歲，平均（33.46±3.04）歲。本研究得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)過(guò)病原菌分離、培養(yǎng)，藥物敏感分析確認(rèn)為沙門菌感染患者；（2）患者知情研究?jī)?nèi)容，且已經(jīng)與醫(yī)院簽署相關(guān)協(xié)議書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者存在其他嚴(yán)重感染性疾??；（2）伴隨著重要臟器疾病或功能障礙；（3）合并認(rèn)知障礙、精神疾病等。

1.2 方法

（1）樣本采集：根據(jù)患者不同的疾病情況選擇不同的樣本采集方法：①在患者發(fā)病1 周之后采集患者的空腹靜脈血液；②患者發(fā)病3 周后采集患者的骨髓液；③對(duì)于需要采集糞便、尿液患者來(lái)說(shuō)，標(biāo)本采集時(shí)間為發(fā)病15 d 左右，如患者的臨床癥狀表現(xiàn)為急性期，則患者入院早期就要根據(jù)患者病情及時(shí)采集糞便，采集時(shí)間為晨起用藥之前；④發(fā)病2 周之后對(duì)患者的尿液標(biāo)本進(jìn)行采集，尿液標(biāo)本采集之后予以離心沉淀處理后待用；⑤如患者屬于沙門菌類食物中毒疑似病例，除了尿液、糞便、血液等標(biāo)本之外，還要對(duì)患者的嘔吐物標(biāo)本進(jìn)行采集。以上樣本分別接受常規(guī)檢驗(yàn)、全面生化反應(yīng)檢驗(yàn)及血清學(xué)檢驗(yàn)，其中常規(guī)檢驗(yàn)設(shè)為參照組，全面生化反應(yīng)檢驗(yàn)及血清學(xué)檢驗(yàn)作為試驗(yàn)組，同一患者采用同一樣本進(jìn)行檢測(cè)。

（2）設(shè)備材料：檢驗(yàn)中應(yīng)用到的設(shè)備包括接種棒、顯微鏡、滅菌平皿、均質(zhì)器、滅菌吸管、毛細(xì)管、鎳絡(luò)絲、玻璃棒、溫箱、酒精燈、小試管等。配置試劑以及培養(yǎng)基過(guò)程中，應(yīng)用氯化鎂孔雀綠增菌液以及四硫磺酸鈉煌綠增菌液；瓊脂方面應(yīng)用亞硫酸鉍瓊脂、HE 瓊脂以及沙門氏菌瓊脂等。

（3）檢測(cè)方法：①常規(guī)檢驗(yàn)方法：通過(guò)沙門菌的培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特征來(lái)判定沙門菌；②生化反應(yīng)試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)：該方法主要通過(guò)采集患者的樣本，先進(jìn)行菌落培養(yǎng)初步判斷，再通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)對(duì)生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。具體方法是先將可疑的菌落接種在1%的TSI 瓊脂中，進(jìn)行初步排除；凝集之后方能進(jìn)行血清學(xué)檢驗(yàn)，大部分沙門菌都處于A～F 群當(dāng)中，在凝集這一環(huán)節(jié)期間，通常是以O(shè) 多價(jià)血清A～F 作為主要模式；采用血清因子定群措施，指標(biāo)為6 個(gè)O 群因子，而后以H 單個(gè)因子血清采用凝集措施，促使第一相與第二相凝集，得到最終結(jié)果就能判定患者的具體血清型。在全面生化反應(yīng)檢驗(yàn)之前需要及時(shí)挑選出可疑菌落，將其與三糖鐵瓊脂進(jìn)行接種，觀察其反應(yīng)；如只有斜面產(chǎn)酸，且有陰性硫化氫菌株，即可排除。在三糖鐵瓊脂接種期間，主要接種方案在于蛋白胨水，能在靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)中直接應(yīng)用，同時(shí)還要接種尿素瓊脂、氰化鉀培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基以及對(duì)照培養(yǎng)基等，培養(yǎng)時(shí)間為24 d，培養(yǎng)環(huán)境為35～37℃，如有必要可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到48 h。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組患者的沙門菌檢出率。常規(guī)檢驗(yàn)方法通過(guò)采集患者樣本放于滅菌生理鹽水試管中，然后進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基上細(xì)菌的生長(zhǎng)特征，即培養(yǎng)24 h 形成中等大小、圓形、表面光滑、無(wú)色半透明、邊緣整齊的菌落，同時(shí)通過(guò)TSI 瓊脂斜面判定是否斜面為紅色，底部變黑并產(chǎn)氣，如有以上特征，判定為有沙門菌陽(yáng)性。全面生化反應(yīng)試驗(yàn)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：液面試劑表現(xiàn)為紅色，證明結(jié)果為陽(yáng)性，如液面試劑表現(xiàn)為黃色，則表明結(jié)果為陰性[4]。血清學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：副傷寒沙門菌的H 凝集效價(jià)在1 ∶80 及以上，O 凝集效價(jià)在1 ∶80 及以上，H 凝集效價(jià)在1 ∶160 級(jí)以上，則說(shuō)明沙門菌抗血清呈陽(yáng)性[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均輸入SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，沙門菌檢出率納入到計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)中，以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

試驗(yàn)組患者的沙門菌檢出率明顯高于參照組，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者的沙門菌檢出率對(duì)比

3 討論

沙門氏菌是近百年來(lái)在全世界范圍內(nèi)引起食物中毒最常見的誘因，是一種革蘭陰性菌，分為6 個(gè)亞屬，目前被鑒定的血清型已經(jīng)超過(guò)2 500 種，是比較重要的人畜共患病病原體[6]。人體感染沙門氏菌之后，細(xì)菌會(huì)損傷人體的免疫系統(tǒng)，從而引起多種疾病，大多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)腸胃炎，少數(shù)血清型會(huì)引起腸熱，屬于一種比較嚴(yán)重的疾病，如副傷寒沙門氏菌A、傷寒沙門氏菌等，與人類疾病相關(guān)的最常見的血清型還包括腸炎沙門氏菌等。臨床相關(guān)研究表明[7]，美國(guó)每年都有140 萬(wàn)人以上向疾控中心報(bào)告感染沙門氏菌；歐洲每年感染沙門氏菌的患者有16 萬(wàn)人次以上，發(fā)生率為0.035%；從我國(guó)沙門氏菌發(fā)病率上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，我國(guó)出現(xiàn)多起因沙門菌引起的食物中毒事件，給人們的身體健康帶來(lái)較大的影響。細(xì)菌性食物中毒大部分都是因感染沙門氏菌引起，對(duì)我國(guó)人民群眾的身體健康以及生命安全均有嚴(yán)重危害，已經(jīng)逐漸成為目前比較關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

目前針對(duì)沙門氏菌的檢驗(yàn)以及鑒定方法多種多樣，傳統(tǒng)沙門氏菌分離主要是采用選擇性預(yù)富集對(duì)制訂的體積樣品或質(zhì)量進(jìn)行干預(yù)，而后予以選擇性富集步驟，鋪在選擇性瓊脂上，確認(rèn)其可疑菌落的血清學(xué)以及生化檢驗(yàn)結(jié)果。傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法結(jié)果可靠，靈敏性以及特異性均比較高，但是傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法耗費(fèi)的時(shí)間比較長(zhǎng)，如患者屬于食物中毒感染，則不能及時(shí)回應(yīng)，對(duì)患者的治療產(chǎn)生一定影響。血清學(xué)鑒定方法就是充分應(yīng)用抗原抗體的特異性反應(yīng)，從而觀察到明顯的凝集現(xiàn)象。

從目前沙門氏菌檢驗(yàn)步驟上分析，基本可將其歸納為預(yù)增菌、選擇增菌、選擇平板分離、生化試驗(yàn)以及血清學(xué)分型鑒定這些步驟。這些步驟涉及面比較廣泛。

（1）從預(yù)增菌上分析：盡管沙門氏菌在自然界中分布相對(duì)廣泛，但是偶爾會(huì)受到不同因素影響，不同類別樣品中的額沙門氏菌會(huì)受到不同程度損傷致殘，處于瀕死狀態(tài)，因此不容易檢出。采用無(wú)選擇性增菌培養(yǎng)液，能促使致殘細(xì)菌得以修復(fù)、繁殖，而后選擇性增菌培養(yǎng)就能進(jìn)一步提升陽(yáng)性檢出率，且應(yīng)用預(yù)增菌之后，避免樣品對(duì)增菌液中抑制劑干擾，充分發(fā)揮選擇增菌液作用，進(jìn)一步提升陽(yáng)性檢出率。預(yù)增菌這一方法國(guó)內(nèi)應(yīng)用相對(duì)較晚，1985年衛(wèi)生部在食品微生物檢驗(yàn)方法當(dāng)中提出使用緩沖蛋白胨水操作規(guī)程、注意事項(xiàng)、附加規(guī)范以及處理方法進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示其陽(yáng)性檢出率有明顯上升，能提升其檢出率。預(yù)增菌的缺點(diǎn)在于不能鑒別增殖的沙門氏菌；分離結(jié)果比較依賴于采樣者的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)以及實(shí)驗(yàn)室操作水平；標(biāo)本接種量以及培養(yǎng)液之間的比例從理論上并沒(méi)有找到依據(jù)。

（2）從選擇增菌這一步驟上分析：選擇增菌的目的在于抑制樣品中其他雜菌生長(zhǎng)，有助于促進(jìn)沙門氏菌增殖，進(jìn)一步提升陽(yáng)性檢出率。不同沙門氏菌對(duì)抑制劑的耐受力不同，部分抑制劑可能會(huì)導(dǎo)致增殖的沙門氏菌本身破壞以及死亡，目前標(biāo)準(zhǔn)方法是應(yīng)用四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（linearguide training box，TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（selenite cystine，SC）同時(shí)進(jìn)行增菌。但是TTB 對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌有一定抑制作用，對(duì)傷寒沙門氏菌增菌效果也并不理想。本研究應(yīng)用氯化鎂孔雀綠增菌液以及四硫磺酸鈉煌綠增菌液作為增菌液，具有良好的增菌效果。導(dǎo)致選擇增菌產(chǎn)生誤差的主要原因在于標(biāo)本接種量，不同接種量有比較明顯的差別，但是接種量比例目前存在一定爭(zhēng)議，增菌液品種不同的接種量也有一定差異。

（3）從選擇平板分離這一步驟上進(jìn)行分析：比較常見的分離培養(yǎng)基可根據(jù)選擇性強(qiáng)弱分為不同類別，其中亞硒酸鉍瓊脂屬于強(qiáng)選擇性；酚紅煌綠瓊脂為中選擇性；麥康凱瓊脂為弱選擇性[8]。平板分離培養(yǎng)基盡管不能將不同菌型進(jìn)行有效鑒別，但是在選擇性檢出率、促進(jìn)沙門氏菌生長(zhǎng)、減少物質(zhì)消耗等方面有一定作用。近年來(lái)通過(guò)對(duì)沙門氏菌的營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行相關(guān)研究，結(jié)果顯示大部分沙門氏菌均需要谷氨酸，絕大部分沙門氏菌利用對(duì)氨基苯甲酸等作為生長(zhǎng)因子，將克式雙糖鐵成分與靛基質(zhì)、賴氨酸、尿素等綜合在一支試管當(dāng)中，經(jīng)24 h 后可觀察到8種生化反應(yīng)，能達(dá)到沙門氏菌檢驗(yàn)項(xiàng)目相關(guān)要求。

（4）從生化試驗(yàn)方面分析：全面生化反應(yīng)試驗(yàn)?zāi)軐?duì)可疑記錄進(jìn)行收集，并有效培養(yǎng)，進(jìn)而判定沙門菌，應(yīng)用范圍比較廣泛[9]。

（5）從血清檢驗(yàn)方面分析：在生化試驗(yàn)檢驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)沙門氏菌血清型進(jìn)行研究，相關(guān)報(bào)道并不多，主要集中于以下方面：①雙相菌第2 相H 抗原缺失；②復(fù)合的雙相H 抗原；薩林納斯沙門氏菌屬于一種具有復(fù)合雙相H 抗原的沙門氏菌，這一菌種具有兩套H 抗原基因，一旦被H：d 抗血清誘導(dǎo)，就會(huì)產(chǎn)生4，12，e，h：e，n，215，與圣地亞哥血清型不能區(qū)別。③H 抗原的R 相；④無(wú)動(dòng)力菌隱藏的H 抗原；⑤O 抗原的點(diǎn)突變。O 抗原是由脂多成分構(gòu)成，經(jīng)多個(gè)重復(fù)寡糖單元鏈接而成，在細(xì)胞外膜中分布[10]。多糖側(cè)鏈部分能產(chǎn)出O 抗原，其特異性也是來(lái)自于此。編碼為O 抗原基因主要包括菌體表面抗原合成基因、O 抗原轉(zhuǎn)位酶編碼基因等，大多數(shù)都有高度特異性，基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜。O 抗原具有多樣性特點(diǎn)，引起這一特點(diǎn)的原因多種多樣，主要有肽鍵多樣性、單糖種類多樣性等。沙門氏菌當(dāng)中含有多種O 抗原，不同種類O 抗原個(gè)數(shù)、種類均有一定差異，可根據(jù)其類別不同將其歸屬于不同種類，只有A～E 群感染才會(huì)導(dǎo)致人體患病。H 抗原是鞭毛蛋白，主要由鞭毛素組成，鞭毛素并不耐熱，因此H 抗原也有不耐熱的特性[11]。鞭毛對(duì)沙門氏菌的運(yùn)動(dòng)、侵襲等有重大作用，根據(jù)臨床相關(guān)研究表明：通過(guò)臨床統(tǒng)計(jì)得知，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的H 抗原已經(jīng)有百余種，沙門氏菌大部分表達(dá)為2種H 抗原，少數(shù)僅僅含有單一相H 抗原，也被稱之為單項(xiàng)菌[12]。

沙門菌的血清型不同，其宿主也有所不同，但也有相同的宿主，可根據(jù)宿主選擇性將沙門氏菌分為兩種，一種是宿主適應(yīng)性，另一種是非宿主適應(yīng)性。前者血清型對(duì)宿主的要求為：宿主本身需要具備一定的選擇性，如傷寒沙門氏菌、馬流產(chǎn)沙門氏菌、羊流產(chǎn)沙門氏菌等；非宿主適應(yīng)性血清型對(duì)宿主的選擇性則相對(duì)來(lái)說(shuō)比較廣泛，包括腸炎沙門氏菌等。目前針對(duì)血清型分型方法也比較多，分別有玻片凝集反應(yīng)、抗體微陣列技術(shù)、全基因組信息或PCR 擴(kuò)增等[13]。從玻片凝集反應(yīng)上進(jìn)行分析，這一試驗(yàn)就是根據(jù)菌體與相應(yīng)單價(jià)血清反應(yīng)進(jìn)行判斷抗原成分，分析其凝集現(xiàn)象發(fā)生與否進(jìn)行判斷。對(duì)沙門氏菌實(shí)施玻片凝集反應(yīng)前，需要對(duì)沙門菌進(jìn)行鑒定以及純化，之后需要對(duì)H 抗原以及O 抗原進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)期間進(jìn)行液體培養(yǎng)。首先需要進(jìn)行自凝試驗(yàn)，而后檢測(cè)Vi 抗原，如在檢測(cè)過(guò)程中與Vi 抗原產(chǎn)生凝集，則要適當(dāng)加熱予以破壞，而后進(jìn)行O 抗原檢測(cè)[14]。沙門氏菌的血清分型分析一般都需要2～3 d，是基礎(chǔ)分析項(xiàng)目，要求檢驗(yàn)人員在凝集試驗(yàn)結(jié)果判定期間需要有足夠的經(jīng)驗(yàn)。這種檢驗(yàn)方法的分辨率相對(duì)較低，可能會(huì)出現(xiàn)交叉凝集甚至不凝集情況；且在檢驗(yàn)期間需要耗費(fèi)許多血清試劑，僅能檢測(cè)比較差的血清型，在進(jìn)化關(guān)系分析方面，血清分型并不能充分反映出遺傳相關(guān)性[15]。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者的檢出率相比于參照組明顯較高 （P＜0.05），由此可見，相比于常規(guī)檢驗(yàn)方法來(lái)說(shuō)，血清檢驗(yàn)與全面生化反應(yīng)檢驗(yàn)的應(yīng)用效果更好。

為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)單一檢測(cè)技術(shù)當(dāng)中存在的不足之處，臨床學(xué)者們應(yīng)用多種檢測(cè)技術(shù)，如納米技術(shù)、光譜技術(shù)、電子顯微鏡技術(shù)、傳感技術(shù)等，將多種技術(shù)相互結(jié)合，為沙門氏菌的檢測(cè)以及鑒定帶來(lái)新契機(jī)。在PCR 擴(kuò)增之后通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的差別，其溶解曲線也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，通過(guò)對(duì)溶解曲線變化識(shí)別區(qū)分產(chǎn)物就是高分辨溶解曲線檢測(cè)，核酸序列遺傳差異，從而對(duì)沙門氏菌進(jìn)行分類以及分型。通過(guò)對(duì)46 種不同血清型的417株沙門氏菌分離株進(jìn)行高分辨率溶解曲線進(jìn)行分析，結(jié)果顯示能明確、簡(jiǎn)便鑒定其中37 種血清型，這一方式具有準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)以及簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用效果比較好。電子顯微鏡技術(shù)等應(yīng)用于沙門氏菌的血清型分型中，也能通過(guò)電化學(xué)阻抗譜監(jiān)測(cè)獲得良好的檢測(cè)效果。

沙門菌的鑒定與沙門菌的分型都能為臨床及時(shí)確定沙門菌感染疾病來(lái)源，從而及時(shí)予以控制，給予正確臨床靶向治療。針對(duì)沙門菌感染爆發(fā)事件，必須在短時(shí)間內(nèi)對(duì)病原菌進(jìn)行正確的分型，這一技術(shù)有望成為沙門菌感染治療以及感染源控制的有效管理方法。目前在沙門菌分類以及沙門菌鑒定核心中，主要為血清型分型，但是在血清型分型中存在一定缺陷，檢測(cè)的靈敏度、特異度等均是一個(gè)挑戰(zhàn)，隨著臨床對(duì)各種新技術(shù)的研究越來(lái)越深入，一些技術(shù)逐漸從研究階段逐漸應(yīng)用于臨床，對(duì)傳統(tǒng)血清學(xué)分型方式予以補(bǔ)充。在沙門菌血清型分型中，不同的應(yīng)用方法有各自的特色，但是理想的血清型分型方式不但能有快速的反應(yīng)能力，還能準(zhǔn)確鑒定病原菌，追蹤傳染源，確定同源性以及進(jìn)化關(guān)系等相關(guān)信息，目前正在不斷探索中。

綜上所述，沙門氏菌臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用全面生化反應(yīng)檢驗(yàn)與血清檢驗(yàn)的應(yīng)用價(jià)值比較高，其檢驗(yàn)準(zhǔn)確率、檢出率均比較高，相比于常規(guī)檢驗(yàn)方法來(lái)說(shuō)應(yīng)用效果更為顯著，值得臨床推廣；同時(shí)，本研究結(jié)果為全面生化反應(yīng)與血清學(xué)檢驗(yàn)方法檢查沙門菌的后期標(biāo)準(zhǔn)制訂提供了借鑒依據(jù)。