張 璽 ,胡桂霖 ,牛澤家馨 ,杜鳴飛 ,鄒 婷 ,張曉玉 ,王 蘭,褚 超,廖月圓,馬 瓊,王 丹,王科科,賈 昊,陳 晨,嚴 瑜,孫 月,郭統(tǒng)帥,張 婕,高衛(wèi)華,閆睿晨,高 可,羅文婧,牟建軍,汪 洋,6

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710061;2.西北婦女兒童醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710003;3.西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710100;4.西安市人民醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710004;5.西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710002;6.西安交通大學全球健康研究院,陜西西安 710061)

高血壓是引起心腦血管疾病、慢性腎病和周圍血管疾病的主要危險因素,是世界范圍內(nèi)最重要的單一死亡原因[1]。人體血壓受復雜生理系統(tǒng)調(diào)節(jié),同時受遺傳和環(huán)境因素的共同作用[2]。研究表明,個體血壓變化與鈉鹽攝入量呈正相關(guān),高鹽引起血壓升高,低鹽則引起血壓下降,稱為血壓的鹽敏感性[3-4]。此外,血壓與膳食鉀攝入量呈現(xiàn)明顯的負相關(guān)性,且不同個體的血壓反應性不盡相同[5-6]。既往研究提示,血壓對鈉鉀攝入量反應的異質(zhì)性可能取決于個體等位基因變異[7-8]。因此,識別血壓鈉鉀敏感性的遺傳變異有助于我們對血壓調(diào)節(jié)機制的進一步理解。

M3毒蕈堿乙酰膽堿受體(M3受體)由CHRM3基因編碼,是G 蛋白偶聯(lián)受體家族的重要成員,參與第二信使信號通路傳導[9-10]。M3受體廣泛分布于心血管系統(tǒng),在心率調(diào)節(jié)、肌力效應、心肌缺血損傷、血管舒縮及血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[11-13]。近來研究發(fā)現(xiàn),M3受體基因變異與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)。DENG 等[14-15]發(fā)現(xiàn),CHRM3基因的T1667C錯義突變,可促使M3受體信號增強及再致敏,誘導腎上腺素分泌,進而致使血壓升高。然而,以上研究未考慮基因和環(huán)境因素的相互作用,CHRM3基因變異引起的血壓變化是否與膳食鈉鉀攝入量存在相關(guān)性。因此,本研究通過對既往建立的高血壓隊列進行慢性鹽負荷及補鉀干預實驗,旨在討論M3受體遺傳變異與血壓對膳食鈉鉀干預的反應性之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究通過對陜西省眉縣農(nóng)村地區(qū)18～60歲的成年人進行社區(qū)血壓篩查,確定潛在先證者及其家系。收縮壓(SBP)在130～160 mm Hg之間和/或舒張壓(DBP)在85～100 mm Hg之間且未使用抗高血壓藥物的先證者及其兄弟姐妹、配偶和后代被招募參加本次研究。排除標準:繼發(fā)性高血壓,2 期高血壓及以上,心血管病史或糖尿病史,使用抗高血壓藥物,懷孕,酗酒,正在低鈉飲食或無法簽署知情同意書者。最終納入來自124個家庭的514名受試者,建立鹽敏感性高血壓隊列并行基線調(diào)查,對其中的333名非父母者進行鈉鉀飲食干預研究。

1.2 飲食干預

慢性鈉鹽負荷及補鉀干預方案參照本課題組既往研究[16-18]。首先為3 d基線調(diào)查,包括問卷調(diào)查、身高、體質(zhì)量、血壓、血尿生化參數(shù)等。此后依次為7 d低鹽飲食(3 g氯化鈉或51.3 mmol鈉/日)、7 d高鹽飲食(18 g氯化鈉或307.8 mmol鈉/日)、7 d高鹽補鉀飲食(高鹽飲食基礎(chǔ)上再加60 mmol/4.5 g氯化鉀/日)。所有食物均為不加鹽烹飪,此后由研究人員將預先分裝好的鈉鹽及鉀添加到每個受試者食物中。在整個研究期間,其他膳食營養(yǎng)攝入量保持不變。為了確保受試者對干預計劃的依從性,其三餐(早餐、午餐和晚餐)被要求在指定餐廳進行,避免食用研究以外的食物。

1.3 24 h尿鈉鉀排泄量的測定

為確保受試者對飲食干預的依從性,在基線期的第3天及每個干預期的第7天收集24 h尿液標本,使用火焰光度計測定尿液中鈉和鉀的濃度。將所測得的鈉、鉀濃度乘以個體24 h尿液總?cè)莘e,計算每個受試者的24 h尿鈉、鉀排泄量。

1.4 血壓測量

受試者進行血壓測量之前禁止吸煙、飲酒、進食刺激性食物及劇烈活動,靜坐休息30 min后,由專業(yè)人員按照Korotkoff聽音法測量右上臂坐位血壓。于基線期每天和每階段飲食干預期的第5、6、7天測量血壓,每日測量3次,每次間隔1 min,最終將各階段9次血壓的平均值納入研究。具體血壓測量方法參照本課題組既往研究[16-18]。平均動脈壓、脈壓計算公式:平均動脈壓=舒張壓+1/3(收縮壓-舒張壓);脈壓=收縮壓-舒張壓。將血壓的鈉鉀反應性視為連續(xù)性變量,計算如下:低鹽期血壓反應性=低鹽期血壓-基線期血壓;高鹽期血壓反應性=高鹽期血壓-低鹽期血壓;補鉀期血壓反應性=高鹽補鉀期血壓-高鹽期血壓。

1.5 單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點選擇和基因分型

檢索國家生物技術(shù)信息中心和基因組變異服務器數(shù)據(jù)庫,按照以下標準篩選CHRM3基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點:①SNP頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,P值不小于0.05;②次要等位基因頻率(MAF)不小于0.05;③連鎖不平衡系數(shù)r2不小于0.8。最終選取13個SNPs(rs10802764、rs997148、rs12034970、rs6429147、rs6692904、rs75804766、rs373288072、rs619288、rss58359377、rs114677844、rs663148、rs10802811、rs4072234)進行后續(xù)分析。使用Gold Mag-Mini純化試劑盒提取受試者外周靜脈血脫氧核糖核酸(DNA)。采用MassARRAY平臺對CHRM3 SNPs進行基因分型。

1.6 統(tǒng)計學分析

連續(xù)變量以均數(shù)±標準差表示,分類變量以頻率和百分比表示,連續(xù)性變量首先進行正態(tài)性檢驗,符合正態(tài)分布采用兩獨立樣本t檢驗,不符合正態(tài)分布采用Mann-WhitneyU檢驗。各干預階段指標比較采用重復測量的單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義,以上分析通過軟件SPSS 26.0進行。通過PLINK 軟件對SNP 基因型進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗和孟德爾一致性檢驗,同時計算MAF。運用PLINK 軟件在加性模型、顯性模型和隱性模型中對各SNP與血壓鈉鉀反應性進行混合線性回歸分析,同時校正年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)和家系相關(guān)性等因素。通過R 軟件(版本號:3.0.1)glmer函數(shù),采用基于基因的分析法(gene-based analyses)評估單一性狀與單個候選基因之間的關(guān)系[16]。運用截點乘積法(truncated product method,TPM)結(jié)合每個SNP關(guān)聯(lián)分析的P值,評估CHRM3基因與血壓鈉鉀反應的總體相關(guān)性[19]。

2 結(jié)果

2.1 基線特征及受試者血壓的鈉鉀反應性

受試者基線特征及鈉鉀飲食干預的血壓反應如表1所示?；€期先證者組的舒張壓及平均動脈壓在各組中最高,而收縮壓低于父母組。在鈉鉀飲食干預過程中,各階段血壓均發(fā)生了變化,低鹽期呈下降趨勢,高鹽期呈上升趨勢,高鹽補鉀后的血壓則再次下降。

表1 基線特征及飲食干預下的血壓反應性Tab.1 Baseline characteristics and BP responses to dietary intervention

續(xù)表1

2.2 鈉鉀干預對受試者24 h尿鈉和鉀排泄的影響

各干預期受試者尿鈉、鉀排泄情況如表2所示,其與膳食鈉鉀攝入量的趨勢平行。24 h尿鈉排泄量在低鹽期明顯低于基線期,而在高鹽負荷后則顯著增加;此外,補鉀可顯著升高24 h尿鉀排泄量(均P＜0.05)。以上結(jié)果說明受試者對飲食干預的依從性良好。

表2 各干預期受試者尿鈉、鉀排泄量Tab.2 Urinary excretions of sodium and potassium in the subjects during the intervention

2.3 CHRM 3基因SNP位點信息

符合納入排除標準的13個CHRM3基因SNP位點的基本信息如表3所示,包括基因型、位點位置、等位基因、次要等位基因頻率和Hardy-Weinberg檢驗結(jié)果。各SNP位點基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律,說明受試人群具有群體代表性。

表3 CHRM 3基因SNPs基本信息Tab.3 Information on SNPs of CHRM 3

續(xù)表3

2.4 CHRM 3基因SNPs與血壓鈉鉀反應性的關(guān)聯(lián)分析

如表4所示,在低鹽期,rs10802811位點與收縮壓、舒張壓和平均動脈壓反應性顯著相關(guān),rs4072234位點與舒張壓和平均動脈壓反應性顯著相關(guān),rs58359377位點與平均動脈壓和脈壓反應性顯著相關(guān)。在高鹽期,rs6429147、rs114677844、rs663148位點均與收縮壓和平均動脈壓反應性顯著相關(guān),rs373288072位點與收縮壓、舒張壓和平均動脈壓反應性顯著相關(guān),rs10802811與舒張壓、平均動脈壓和脈壓反應性顯著相關(guān)。在高鹽補鉀期,rs6692904位點與收縮壓、舒張壓和平均動脈壓反應性顯著相關(guān)。

表4 CHRM 3基因SNP位點與血壓鈉鉀反應性的關(guān)系Tab.4 Associations of CHRM 3 SNPs with blood pressure responses to dietary intervention

續(xù)表4

進一步分析上述具有統(tǒng)計學意義的SNP位點,探討其不同基因型與血壓鈉鉀反應性的關(guān)系。如圖1A、圖1B所示,與野生型GG 相比,rs10802811 位點突變型AG 受試者低鹽期及高鹽期的舒張壓及平均動脈壓反應性均增高。在rs114677844位點中,突變的GG 純合基因型受試者高鹽期的收縮壓反應性明顯升高(圖1C)。在高鹽補鉀期,與野生型CC 相比,rs6692904位點純合突變型AA 受試者的舒張壓及平均動脈壓反應性均明顯升高(圖1D)。

圖1 CHRM 3基因SNP位點基因型與血壓鈉鉀反應性的關(guān)系Fig.1 Associations of CHRM 3 SNP genotypes with BP responses to dietary intervention

基于基因的分析(gene-based analyses)結(jié)果如表5所示,在高鹽期,CHRM3基因與收縮壓、舒張壓和脈壓反應性顯著相關(guān)(PTMP分別為0.001、0.013、0.002)。而在低鹽期及高鹽補鉀期,CHRM3基因與血壓反應無明顯相關(guān)性。

表5 CHRM 3基因與血壓鈉鉀反應性的關(guān)系Tab.5 Associations of CHRM 3 with BP responses to dietary intervention

3 討 論

M3毒蕈堿乙酰膽堿受體是G 蛋白偶聯(lián)受體家族中五種毒蕈堿受體亞型(M1-M5)之一,廣泛分布于心血管系統(tǒng),在心律失常、心肌缺血、心肌肥厚、心房顫動、心力衰竭及其他非心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的生理功能和病理意義[11-13,20]。NISHIMARU 等[21]發(fā)現(xiàn)向離體小鼠心房中注入M3 選擇性拮抗劑p-F-HHSiD 可顯著降低左心房的心肌收縮力。ORII等[22]在兔肺動脈高壓模型中發(fā)現(xiàn)M3 受體介導肺循環(huán)中乙酰膽堿誘導的血管舒張反應。BORELLA 等[23]發(fā)現(xiàn),向大鼠側(cè)腦室注射M3 受體拮抗劑4-DAMP可顯著降低匹魯卡品誘導的升壓反應。然而,M3受體參與心血管功能調(diào)控的具體分子細胞學機制尚不清楚。M3 受體的編碼基因CHRM3位于1號染色體q43,由一個外顯子組成,具有＞1100個SNP位點,在所有毒蕈堿受體基因中具有最豐富的遺傳多態(tài)性[24-25]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)多個CHRM3 SNPs與飲食鈉鉀干預的血壓反應性顯著相關(guān),提示M3受體可能參與血壓的調(diào)節(jié),并與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

高血壓是多基因遺傳和環(huán)境因素相互作用導致正常血壓調(diào)節(jié)失衡的結(jié)果,而個體遺傳背景可能與鹽敏感性高血壓的病理生理學機制有關(guān)[26]。DENG等[27]在Dahl 鹽敏感大鼠多基因高血壓模型中發(fā)現(xiàn),CHRM3基因末端結(jié)構(gòu)域T1776C 錯義突變可導致M3受體內(nèi)吞延遲,引起細胞表面受體增加,功能信號延長,最終致使血壓升高。為了進一步探索CHRM3基因突變在此升壓過程中起到的關(guān)鍵作用,DENG 等[27]構(gòu)建了CHRM3基因敲除DSS大鼠模型,發(fā)現(xiàn)CHRM3-/-組大鼠的血壓明顯低于CHRM3+/+組。此外,M3受體信號通路的增強可誘導腎上腺素分泌,進而影響鹽敏性高血壓的血管功能[14]。然而,CHRM3基因變異在人類鹽敏感性高血壓發(fā)展中的作用尚未被探索。本研究通過對陜西省農(nóng)村人口進行慢性鈉鹽負荷實驗,首次發(fā)現(xiàn)CHRM3基因SNP 位點rs10802811 與低鹽期及高鹽期舒張壓及平均動脈壓反應性顯著關(guān)聯(lián),而rs6429147、rs373288072、rs114677844、rs663148 位點與高鹽期收縮壓及平均動脈壓反應呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。而且,在低鹽及高鹽飲食干預下,rs10802811和rs114677844不同基因型之間的血壓反應也存在差異。此外,通過基因分析發(fā)現(xiàn),CHRM3基因與高鹽期收縮壓、舒張壓和脈壓反應的相關(guān)性顯著,進一步提示M3受體遺傳變異可能參與了人體血壓鹽敏感性的形成。

流行病學研究表明,膳食鉀攝入量與血壓呈負相關(guān),且個體血壓對鉀攝入量的反應存在異質(zhì)性[28-30]。GenSalt研究發(fā)現(xiàn),APLN 和ACE2 基因SNP 位點與膳食鉀補充后的血壓反應顯著相關(guān)[31]。此外,內(nèi)皮素1(EDN1)、一氧化氮合酶3(NOS3)及E 選擇素(SELE)基因多態(tài)性與補鉀的降壓反應均密切相關(guān)[7]。GU 等[32]提出,膳食鉀補充引起的血壓反應在中國人群中存在中等遺傳力。本課題組既往隊列研究發(fā)現(xiàn)抗衰老因子KLOTHO、脂肪素AdipoQ 及蛋白激酶SGK1基因多態(tài)性與補鉀的血壓反應性顯著相關(guān)[33-35]。這些研究表明,遺傳因素可能導致了血壓對鉀攝入量反應的變化。本研究首次討論了M3受體基因多態(tài)性與補鉀干預的血壓反應性之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)rs6692904位點與高鹽補鉀期的收縮壓、舒張壓和平均動脈壓反應性顯著相關(guān),且突變型AA 基因型受試者的舒張壓及平均動脈壓反應性更高,提示M3受體遺傳變異可能參與了血壓鉀敏感性的形成。

綜上所述,本研究通過對具有相似遺傳背景的陜西省漢族人群進行慢性鹽負荷及補鉀干預實驗,發(fā)現(xiàn)CHRM3基因多態(tài)性與鈉鉀飲食干預的血壓反應存在顯著相關(guān)性,提示M3受體遺傳變異參與血壓鈉鉀敏感性的形成,為探索鹽敏感性高血壓的發(fā)生發(fā)展機制提供了新思路。