吳 燕,杜鳴飛,張 璽,王 蘭,胡桂霖,牛澤家馨,鄒 婷,張曉玉,褚 超,廖月圓,馬 瓊,王 丹,王科科,賈 昊,陳 晨,嚴(yán) 瑜,孫 月,郭統(tǒng)帥,張 婕,高衛(wèi)華,滿(mǎn)子悅,高 可,羅文婧,牟建軍,汪 洋,6

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710061;2.西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710100;3.西北婦女兒童醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710003;4.西安市人民醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710004;5.西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710002;6.西安交通大學(xué)全球健康研究院,陜西西安 710061)

高血壓是心腦血管疾病及慢性腎臟病的主要危險(xiǎn)因素,是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的主要公共健康問(wèn)題之一[1]。研究表明,高血壓受遺傳和多種環(huán)境因素的相互影響,其中高鈉膳食與鉀攝入量不足是高血壓的重要環(huán)境因素[2]。同時(shí),大量證據(jù)顯示,不同個(gè)體的血壓對(duì)飲食中鈉鉀攝入的反應(yīng)性存在顯著差異[3-4]。這表明遺傳因素在決定個(gè)體血壓的鹽敏感性和鉀敏感性方面起著重要作用。

尿調(diào)節(jié)素又稱(chēng)Tamm-Horsfal蛋白,是正常人尿液中占比最大的一種蛋白,由腎小管髓袢升支粗段上皮細(xì)胞產(chǎn)生[5]。尿調(diào)節(jié)素可以防止腎結(jié)石產(chǎn)生、尿路感染及調(diào)節(jié)免疫,是目前研究較多的生物學(xué)功能[5-6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),尿調(diào)節(jié)素基因的變異與鈉鉀穩(wěn)態(tài)及高血壓的發(fā)生與調(diào)節(jié)關(guān)系密切[7]。通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析,PADMANABHAN 等[8]發(fā)現(xiàn),尿調(diào)節(jié)素基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)rs13333226的次要G 等位基因與較低的高血壓風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。TRUDU 等[9-10]發(fā)現(xiàn),尿調(diào)節(jié)素SNP rs4293393的主要T 等位基因與高血壓相關(guān)。相較于野生型小鼠,尿調(diào)節(jié)素基因缺失小鼠血壓顯著降低;過(guò)表達(dá)尿調(diào)節(jié)素基因的小鼠血壓顯著升高。然而,關(guān)于基因與環(huán)境的互相作用尚未闡明,尤其是關(guān)于鈉鉀干預(yù)與尿調(diào)節(jié)素基因的關(guān)系,這也導(dǎo)致基因在血壓變異中的作用無(wú)法精確評(píng)估。因此,本研究基于既往建立的陜西“鹽敏感高血壓研究隊(duì)列”,通過(guò)對(duì)研究人群飲食進(jìn)行鈉鉀干預(yù),探討尿調(diào)節(jié)素基因多態(tài)性與血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本課題組在2003年10月—2004年10 月對(duì)陜西寶雞市眉縣多個(gè)農(nóng)村漢族人群進(jìn)行系統(tǒng)篩查,最終招募了來(lái)自124個(gè)家系的514名年齡在18～60歲之間,收縮壓130～160 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和(或)舒張壓85～100 mm Hg的受試者建立“鹽敏感性高血壓研究隊(duì)列”。具體已在本課題組以往相關(guān)文獻(xiàn)中詳細(xì)報(bào)道[11-13]。本研究已經(jīng)過(guò)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò),受試者均知曉研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 基線(xiàn)調(diào)查及飲食干預(yù) 本研究如前所述[11-13],對(duì)選中的333名非父母者進(jìn)行慢性鹽負(fù)荷及補(bǔ)鉀干預(yù)試驗(yàn),具體分為四個(gè)階段:3 d基線(xiàn)調(diào)查期、7 d低鹽飲食期(3 g或51.3 mmol/L NaCl/d)、7 d高鹽飲食期(18 g或307.8 mmol/L NaCl/d)和7 d高鹽補(bǔ)鉀期(18 g或307.8mmol/L NaCl/d+4.5 g或60 mmol/L KCl/d)。基線(xiàn)期調(diào)查主要包括年齡、性別、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)指數(shù)、腰圍、血壓等基本資料的問(wèn)卷調(diào)查。

1.2.2 血壓測(cè)量 基線(xiàn)期與鈉鉀干預(yù)期的第5、6、7天采用隨機(jī)零點(diǎn)血壓計(jì)(Hawksley&Sons,英國(guó))按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量血壓,重復(fù)測(cè)量3次,最終統(tǒng)計(jì)分析時(shí)采用9次血壓的平均值。平均動(dòng)脈壓、脈壓計(jì)算公式為:平均動(dòng)脈壓=舒張壓+1/3(收縮壓-舒張壓)。在本研究中,我們將血壓對(duì)鈉鉀的反應(yīng)性看作連續(xù)性變量,具體計(jì)算公式如下:低鹽期血壓反應(yīng)性=低鹽期血壓-基線(xiàn)期血壓;高鹽期血壓反應(yīng)性=高鹽期血壓-低鹽期血壓;補(bǔ)鉀期血壓反應(yīng)性=高鹽補(bǔ)鉀期血壓-高鹽期血壓。

1.2.3 血、尿標(biāo)本的收集與分析 在各個(gè)階段的最后一天安排當(dāng)?shù)蒯t(yī)院采集受試者的外周靜脈血標(biāo)本和24 h尿標(biāo)本。清晨空腹采集4 mL靜脈血,離心機(jī)的半徑為16 cm,3 000 r/min離心15 min,將分離的血清標(biāo)本存放在-80℃冰箱冷凍保存待測(cè)。收集受試者24 h 尿液標(biāo)本并測(cè)量記錄總體積,分別吸取4 mL尿標(biāo)本存放于2 個(gè)凍存管內(nèi),存于-40℃冰箱。所有血尿標(biāo)本處理好后于當(dāng)天運(yùn)送至西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院采用Hitachi7060 全自動(dòng)生化分析儀(日立,日本)檢測(cè)尿標(biāo)本中鈉、鉀濃度以及血清生化指標(biāo),包括血糖、血肌酐、三酰甘油、總膽固醇等水平。鈉、鉀排泄量用24 h尿液總體積乘以尿鈉、鉀濃度計(jì)算得到。

1.2.4 SNP 位點(diǎn)選擇及基因分型 通過(guò)對(duì)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)和基因組變異服務(wù)器數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gvs.gs.washington.edu/GVS147)進(jìn)行檢索,采用Haplo View 4.2軟件(Broad Institute,Cambridge,MA,USA)在中國(guó)北京漢族(CHB)和亞洲人群數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選尿調(diào)節(jié)素基因中的標(biāo)簽SNP位點(diǎn)。具體篩選標(biāo)準(zhǔn):該標(biāo)簽位點(diǎn)SNP 頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P≥0.05),次要等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)P≥0.05,且連鎖不平衡系數(shù)r2≥0.8。最終納入13個(gè)尿調(diào)節(jié)素基因相關(guān)的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析,分別為rs77875418、rs4293393、rs7193058、rs4997081、rs11859916、rs13333226、rs79245268、rs4632135、rs4383153、rs12708631、rs7198000、rs6497476、rs12917707。

采集全部受試者外周靜脈血,應(yīng)用Gold Mag-Mini純化試劑盒(Gold Mag有限公司,中國(guó))提取外周血脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)。通過(guò)Mass ARRAY 檢測(cè)平臺(tái)對(duì)13個(gè)尿調(diào)節(jié)素基因有關(guān)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型。每種基因分型實(shí)驗(yàn)均由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行。連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,分類(lèi)變量以n(%)表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間的比較,采用方差分析進(jìn)行多組間比較。使用PLINK 軟件(version 1.9)通過(guò)精確檢驗(yàn)法對(duì)選取父母受試者的基因型進(jìn)行平衡檢驗(yàn)和孟德?tīng)栆恢滦詸z驗(yàn),計(jì)算各基因型的MAF。利用PLINK 軟件在不同遺傳模型(加性模型,顯性模型和隱性模型)下構(gòu)建混合線(xiàn)性回歸模型,截點(diǎn)乘積法(truncated product method,TPM)分析SNPs與人群血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)系。將年齡、性別和體質(zhì)量指數(shù)作為固定效應(yīng),家系相關(guān)性作為隨機(jī)效應(yīng)在模型中進(jìn)行校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者的基線(xiàn)特征及血壓的鈉鉀反應(yīng)性

如表1所示,在基線(xiàn)期,先證者的收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓均高于其同胞、配偶和子女。鈉鉀飲食干預(yù)時(shí),與基線(xiàn)期血壓相比,受試者低鹽期血壓明顯下降,高鹽期血壓則顯著升高,此外與高鹽期相比,在高鹽補(bǔ)鉀期,血壓顯著降低(表1)。

表1 基線(xiàn)特征及飲食干預(yù)下的血壓反應(yīng)性Tab.1 Baseline characteristics and BP responses to dietary intervention

續(xù)表1

2.2 受試者各時(shí)期24 h尿液鈉、鉀的反應(yīng)情況

基線(xiàn)期受試者的尿鈉、尿鉀排泄均呈現(xiàn)“高鈉低鉀”規(guī)律,提示日常鈉攝入過(guò)多而鉀攝入不足,符合中國(guó)北方農(nóng)村居住者的飲食習(xí)慣。與基線(xiàn)期相比,低鹽期24 h尿鈉排泄量顯著降低,高鹽干預(yù)后顯著升高,補(bǔ)鉀可以顯著升高24 h尿鉀排泄量(表2)。這提示受試者對(duì)膳食干預(yù)依從性好。

表2 受試者各時(shí)期24 h尿液鈉、鉀的排泄量Tab.2 Urinary excretions of sodium and potassium in subjects during the intervention periods

2.3 尿調(diào)節(jié)素基因SNP位點(diǎn)的基本信息

由于本研究以家系為基礎(chǔ),故Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)僅在父母的數(shù)據(jù)中進(jìn)行,表3羅列了本研究采取的SNP所在基因組位置、等位基因、MAF、Hardy-Weinberg檢驗(yàn)結(jié)果及功能預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示,各SNP位點(diǎn)基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律,表明受試者選自遺傳平衡的大眾人群,具有很強(qiáng)的代表性。

表3 尿調(diào)節(jié)素基因各SNP位點(diǎn)的基本信息Tab.3 Characteristics of the uromodulin SNPs analyzed in this study

續(xù)表3

2.4 尿調(diào)節(jié)素基因多態(tài)性與血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)性

通過(guò)對(duì)所有位點(diǎn)與血壓的鈉鉀反應(yīng)性這一性狀表型進(jìn)行分析,尿調(diào)節(jié)素基因SNPs rs7193058、rs4997081與高鹽期舒張壓和平均動(dòng)脈壓反應(yīng)性顯著相 關(guān)(均P＜0.05)。此外,rs77875418、rs79245268、rs4293393、rs6497476、rs4997081、rs13333226、rs12917707與高鹽補(bǔ)鉀期收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓反應(yīng)性顯著相關(guān)(均P＜0.05,表4)。

表4 尿調(diào)節(jié)素基因多態(tài)性與血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)性Tab.4 Associations of renalase SNPs with blood pressure responses to salt and potassium interventions

3 討 論

通過(guò)對(duì)陜西“鹽敏感性高血壓研究隊(duì)列”進(jìn)行鈉鉀膳食干預(yù),本研究發(fā)現(xiàn),尿調(diào)節(jié)素基因多個(gè)SNPs與血壓鈉鉀反應(yīng)性密切相關(guān)。其中rs7193058、rs4997081位點(diǎn)與高鹽期舒張壓和平均動(dòng)脈壓反應(yīng)性顯著相關(guān);rs77875418、rs79245268、rs4293393、rs6497476、rs4997081、rs13333226、rs12917707 位 點(diǎn)與高鹽補(bǔ)鉀期收縮壓、舒張壓及平均動(dòng)脈壓反應(yīng)性均顯著相關(guān)。因此,以上SNPs可能作為鹽敏感性和鉀敏感性的遺傳標(biāo)記,并為高血壓的治療提供潛在的遺傳靶點(diǎn)。

尿調(diào)節(jié)素基因由11個(gè)外顯子組成,位于染色體16p12.3-16p13.11,轉(zhuǎn)錄子只特異性存在于腎臟中,其基因結(jié)構(gòu)在人和小鼠體內(nèi)均非常保守[5-6],尿調(diào)節(jié)素產(chǎn)生于腎小管髓袢升支粗段上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng),由高爾基體多聚糖加工,隨后作為糖基磷脂肌醇連接分子被運(yùn)送到頂端細(xì)胞膜,最后經(jīng)蛋白酶水解切割后釋放到尿液中。研究表明,尿調(diào)節(jié)素參與調(diào)節(jié)血壓,促使血壓升高。PADMANABHAN 等[8]通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)尿調(diào)節(jié)素SNP 13333226的次要G 等位基因與較低的高血壓風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。GRAHAM 等[10]研究表明SNP rs4293393的主要T 等位基因與尿調(diào)節(jié)素基因表達(dá)、慢性腎臟病及高血壓相關(guān)。本課題組近期對(duì)“鹽敏感性高血壓研究隊(duì)列”長(zhǎng)達(dá)8年的隨訪(fǎng),發(fā)現(xiàn)尿調(diào)節(jié)素基因SNPs rs12917707及rs12708631與遠(yuǎn)期的血壓改變有關(guān),SNP rs12708631與遠(yuǎn)期高血壓的發(fā)病率顯著相關(guān)(OR=1.344,P=0.035)?；凇皾h中青少年高血壓研究隊(duì)列”的研究,在調(diào)整多種混雜因素后,血清尿調(diào)節(jié)素的水平與高血壓風(fēng)險(xiǎn)顯著負(fù)相關(guān)(OR=0.978,P＜0.001)[14]。在動(dòng)物模型中,相較于野生型小鼠,敲除尿調(diào)節(jié)素基因的小鼠血壓明顯下降,并對(duì)鹽誘導(dǎo)的高血壓有抵抗力;尿調(diào)節(jié)素基因過(guò)表達(dá)的小鼠血壓上升,并對(duì)呋塞米的利尿及降壓作用更為敏感[10-11]。此外,有研究證實(shí),尿調(diào)節(jié)素對(duì)鈉水代謝的調(diào)節(jié)與腎小管髓袢升支粗段上皮細(xì)胞的Na+-K+-2CL-同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na+-K+-2Cl-cotransporter,NKCC2)通道相關(guān),上皮細(xì)胞內(nèi)NKCC2在敲除尿調(diào)節(jié)素基因小鼠腎小管髓袢升支粗段表達(dá)上調(diào),細(xì)胞膜側(cè)NKCC2表達(dá)無(wú)顯著變化,但磷酸化水平下降,其總體功能降低[15];尿調(diào)節(jié)素過(guò)表達(dá)小鼠的NKCC2 磷酸化水平上升[10]。以上研究提示尿調(diào)節(jié)素通過(guò)NKCC2參與鈉水代謝的調(diào)節(jié)進(jìn)而影響血壓。本研究通過(guò)對(duì)陜西“鹽敏感性高血壓研究隊(duì)列”進(jìn)行慢性鹽負(fù)荷及補(bǔ)鉀干預(yù),首次發(fā)現(xiàn)尿調(diào)節(jié)素基因多態(tài)性位點(diǎn)rs7193058、rs4997081 與高鹽期舒張壓和平均動(dòng)脈壓反應(yīng)性明顯相關(guān)。表明尿調(diào)節(jié)素基因可能參與鹽敏感性血壓的形成。

人群研究顯示鈉干預(yù)與血壓呈正相關(guān),補(bǔ)鉀與血壓呈負(fù)相關(guān)[2]。大量證據(jù)顯示,補(bǔ)鉀的降壓作用存在個(gè)體差異性[3]。GenSalt研究顯示,在遺傳背景相似的中國(guó)漢族人群中,補(bǔ)鉀的血壓變化仍不同,表明人群存在血壓的鉀敏感性[16]。ZHAO 等[17]報(bào)道漢族人群Apelin(APLN)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)基因變異與補(bǔ)鉀的血壓反應(yīng)有關(guān)。MONTASSER 等[18]研究發(fā)現(xiàn),中國(guó)農(nóng)村人群血管內(nèi)皮通路包括內(nèi)皮素1(endothelin,EDN1)、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3,NOS3)、E選擇素(E selection,SELE)等關(guān)鍵基因的多態(tài)性與補(bǔ)鉀反應(yīng)性相關(guān)。本研究首次探討尿調(diào)節(jié)素基因多態(tài)性與補(bǔ)鉀的血壓反應(yīng)性的關(guān)系,結(jié)果表明SNPs rs77875418、rs79245268、rs4293393、rs6497476、rs4997081、rs13333226、rs12917707位點(diǎn)與高鹽補(bǔ)鉀期收縮壓、舒張壓及平均動(dòng)脈壓反應(yīng)性顯著相關(guān),提示尿調(diào)節(jié)素基因可能參與血壓鉀敏感性的形成。尿調(diào)節(jié)素基因多態(tài)性對(duì)血壓鉀反應(yīng)性的影響與腎外髓鉀通道(renal outer medullary potassium channel,ROMK)密切相關(guān)。RENIGUNTA 等[19]發(fā)現(xiàn)尿調(diào)節(jié)素基因敲除小鼠細(xì)胞內(nèi)ROMK 蛋白蓄積增加,而頂端膜側(cè)表達(dá)量減低,通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)及免疫共沉淀等證實(shí)尿調(diào)節(jié)素與ROMK 存在相互作用。SCHIANO等[20]通過(guò)藥物抑制或基因敲除小鼠腎小管髓袢升支粗段細(xì)胞ROMK,導(dǎo)致尿調(diào)節(jié)素分泌減少,細(xì)胞內(nèi)尿調(diào)節(jié)素累積。以上研究表明,尿調(diào)節(jié)素可能通過(guò)ROMK 參與血壓鉀敏感性的調(diào)節(jié),提示尿調(diào)節(jié)素為高血壓潛在的治療靶點(diǎn)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)尿調(diào)節(jié)素基因多態(tài)性與血壓鈉鉀反應(yīng)性相關(guān),這有助于從遺傳學(xué)角度進(jìn)一步理解鉀敏感性血壓形成機(jī)制并為其防治工作提供思路。考慮到本研究存在樣本量相對(duì)較小且受試者局限于中國(guó)北方人口等不足之處,因此,膳食鈉鉀鹽的攝入與尿調(diào)節(jié)素基因多態(tài)性的關(guān)系及其在高血壓的發(fā)生發(fā)展中的作用等方面的臨床意義還有待大規(guī)模前瞻性研究予以證實(shí)。